一种提高西瓜多倍体选育的方法
技术领域
本发明属于农业作物育种技术领域，涉及一种提高西瓜多倍体选育的方 法。
背景技术
为获得优良的三倍体无籽西瓜品种，通过染色体加倍获得四倍体西瓜材 料是育种成功的关键[1，2]。中国和美国现已成为研究和栽培三倍体无籽西瓜的 主要国家[2，3]。用多倍体生产无籽西瓜成为主要途径。三倍体无籽西瓜是目前 在生产上利用同源多倍体面积最大的植物品种之一[4]。
西瓜多倍体的形成途径有人工诱导和自然发生两种主要方式。人工诱导 是通过各种方法使原种或杂种的合子染色体数加倍。而自然发生的频率很低， 是通过原种或杂种所形成未减数配子的受精结合使染色体数加倍。人工诱导 获得西瓜四倍体西瓜有以下途径：(1)利用物理方法诱导：利用各种射线、 异常温度、超速离心力、高电压等诱导变异。此种方法变异方向较多，但诱 变率几率很低。(2)生物方法：如多次摘心、嫁接后在愈伤组织处可能出现四 倍体。此种方法的诱变率也很低，一般不采用。(3)利用化学方法诱导：利用 化学试剂如秋水仙素、苯乙烷、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有机砷制剂、有 机汞制剂、磺胺剂、及其它植物碱不下200种[5～9]。以上几种方法单独使 用时诱变率很低，一般为百分之几。
以下是背景技术在引用的参考文献
[1]王鸣蔬菜育种学(第二版)[M]北京：农业出版社，1990：150～160
[2]刘文革 无籽少籽西瓜研究进展[J]北方园艺，1999，(2)：35～37
[3]Maynard DN.Watermelon cultivars in the United States in 2000[J].Cucurbit Coop Rrt，2000，23，51～53
[4]刘文革 实现西瓜无籽的策略[J]专题综述中国西瓜甜瓜2003 (6)：17～20
[5]刘文革，王鸣 西瓜甜瓜育种中的染色体倍性操作及倍性鉴定[J]果 树学报，2002 19(2)～13
[6]韩毅科 杜胜利 瓜类遗传育种中的染色体倍性操作[J]大津农业科 学2002(9)30～34
[7]乔永刚 宋芸 蔬菜多倍体育种研究综述[J]长江蔬菜，学术专刊 2002 8～10
[8]刘文革，王鸣 蔬菜作物多倍体诱导进展[J]长江蔬菜2003(01) 29～31
[9]王志敏，牛义 多倍体诱导在蔬菜育种上的应用[J]生物学杂志2004 (12)35～38
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种高效、 快速的西瓜多倍体选育的方法。
实现上述发明目的技术是一种提高西瓜多倍体选育的方法，具体包括下列步 骤：
将二倍体种子在经温烫浸种后在常温水中浸种6～8h后，再经0.05％～ 0.1％秋水仙素浸种16～20h后，用湿毛巾包好后在培养箱中28-32℃下进行催 芽48～72h，露白后播种于穴盘中，基质可选用泥炭、蛭石、珍珠岩等育苗基 质，于温室内育苗，在西瓜幼苗长至一叶一心或二叶一心时，将幼苗置于12 ℃～18℃的人工智能培养箱中，对幼苗进行摘除生长点后，进行秋水仙素(浓 度0.2％～0.4％)滴苗处理，每天一次滴苗，在光照12～16h/大，光照强度 为3000lx条件下处理4～6天数，进行多倍体诱导，待幼苗长出新的生长点 后对幼苗进行多倍体鉴定，将多倍体幼苗定植，压蔓整枝授粉保存多倍体种 子。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明专利首次将西瓜二倍体幼苗进行了多因素综合处理，不仅对采用 了常规的秋水仙素滴苗法处理幼苗同时还对西瓜幼苗进行了一定的低温处 理，和摘心处理，大大的提高了活体条件下西瓜多倍体的诱变率。
具体实施方式
以下通过发明人给出的具体试验例和实施例来进一步说明本发明的效果和具 体的西瓜多倍体选育方法。
实验例1
1材料与方法
1.1实验材料
供试3个二倍体西瓜种质：
红小玉(早熟品种)：果实近圆形，单瓜重3kg，果皮底色浅绿显深绿细 条带，果皮薄脆，瓤色红，品质沙细，中心含糖11％以上，近皮部8％，籽 小而多。
京父-2(中熟品种)：果实近圆形，单瓜重5kg，果皮底色浅绿显深绿中 宽条带，果皮薄而脆，瓤色粉红，品质沙细，中心含糖11％以上，近皮部8 ％，籽中等而多。
M08(晚熟品种)：果实近圆形，单瓜重7kg，果皮底色浅绿显深绿宽条带，果 皮薄而脆，瓤色粉红，品质沙细稍脆，中心含糖11％以上，近皮部8％，籽 中等而多。
1.2材料培养及实验处理
1.2.1材料的培养
种子经常温浸种6～8h后，再经0.1％秋水仙素浸种18h后，在培养箱中 进行催芽后播种于穴盘中，基质为3∶1的泥炭和蛭石，于温室内育苗。
1.2.2实验处理
对不同种质资源西瓜幼苗进行温度、不同苗态摘心、秋水仙素溶液浓度、 处理时间等的综合处理的处理。设计四因素三水平正交试验如表1。
表1西瓜四因素三水平正交诱变试验表
处理 秋水仙素浓度(％) 处理温度 苗态(几叶一心)摘心 处理天数 1 2 3 4 5 6 7 8 0.20 0.20 0.20 0.30 0.30 0.30 0.40 0.40 12 15 18 12 15 18 12 15 1 2 3 2 3 1 3 1 4 5 6 6 4 5 5 6
9 0.40 18 2 4
注：实验共设九个处理
在西瓜幼苗长至合适的苗态时，将幼苗置于调为合适的低温的人工智能 培养箱中，对幼苗进行摘除生长点，并进行秋水仙素滴苗，每天下午18:00 滴苗，处理一定的天数，处理期间温度恒定，光照为7:0-18:00光照为3000lx。
2实验结果与分析
设计四因素三水平正交试验处理结果如表2：
表2西瓜正交试验处理总结果
品种 处理 总株数(株) 成活株数 成活率(％) 变异株数 诱变率(％) 红小玉 京父-2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ck1 ck2 1 2 75 70 51 68 61 70 51 53 63 46 48 60 66 72 67 49 65 59 68 50 51 62 44 46 52 62 96.00 95.71 96.08 95.59 96.72 97.14 98.04 96.23 98.41 95.65 95.83 86.67 93.94 4 2 9 8 6 13 13 8 5 0 0 3 9 5.33 2.86 17.65 11.76 9.84 18.57 25.49 15.09 7.94 0.00 0.00 5.00 13.64
m08 3 4 5 6 7 8 9 ck1 ck2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ck1 ck2 58 72 58 61 66 72 69 50 50 50 50 50 50 50 48 50 50 48 45 50 56 63 57 58 62 65 66 48 49 45 48 49 49 50 46 48 44 45 44 49 96.55 87.50 98.28 95.08 93.94 90.28 95.65 96.00 98.00 90.00 96.00 98.00 98.00 100.00 95.83 96.00 88.00 93.75 97.78 98.00 5 16 1 7 3 13 8 0 0 12 23 20 21 15 17 19 10 14 12 0 8.62 22.22 1.72 11.48 4.55 18.06 11.59 0.00 0.00 24.00 46.00 40.00 42.00 30.00 35.42 38.00 20.00 29.17 26.67 0.00
由上表可以看出：
2.1诱变后的成活率
由表2可以看出：幼苗经秋水仙素，摘心以及低温处理后其幼苗的成活 率大都在85％以上，大部分在90％以上，M08的处理5成活率最高达100％。 虽然幼苗的成活率都比较高，但处理后的幼苗成活率比没经处理的成活率低， 而且对同一个种质，处理温度越低，幼苗越小，幼苗的成活率也越低，不同 的种质同一个处理幼苗的成活率也有所不同。
2.2正交处理后的变异率结果分析
2.2.1红小玉的九个处理中诱变率结果分析：
表3红小玉诱变率结果
处理 7 6 3 8 4 5 9 1 2 均值 25.49 18.57 17.65 15.09 11.76 9.84 7.94 5.33 2.86
由上表可以看出：红小玉最好的处理是处理7：即红小玉在秋水仙素浓度 为0.4％处理温度为12℃在3叶1心时摘心，处理时间是5天时诱变的效果最 好为25.49％，其次就是处理6：红小玉在秋水仙素浓度为0.3％处理温度为18 ℃在1叶1心时摘心，处理时间是5天时处理效果也比较好为：18.57％，因而 对种质红小玉可选择处理7和6作为诱导西瓜多倍体的处理。
2.2.2京父-2诱变率结果分析
表4京父-2诱变率结果
处理 4 8 2 9 6 3 1 7 5 均值 22.22 18.06 13.64 11.59 11.48 8.62 5 4.55 1.72
由上表可以看出：京父-2最好的处理是处理4：即种质京父-2在秋水 仙素浓度为0.3％处理温度为12℃在2叶1心时摘心，处理时间是6天时诱 变的效果最好为22.22％，其次就是处理8：即在秋水仙素浓度为0.4％处理温 度为15℃在1叶1心时摘心，处理时间是6天时处理效果也比较好，为18.06％， 因而对种质京父-2来说可以采用处理4和处理8作为诱导京父-2的多倍体 诱导的较好的处理。
2.2.3M08九个处理中诱变率结果分析：
表5M08诱变率结果
处理 2 4 3 7 6 5 9 1 8 均值 46 42 40 38 35.42 30 29.17 24 20
由上表可以看出：M08最好的处理是处理2：即M08在秋水仙素浓度为0.2％ 处理温度为15℃在2叶1心时摘心，处理时间是5天时诱变的效果最好为46％， 其次就是处理4：即在秋水仙素浓度为0.3％处理温度为12℃在2叶1心时摘 心，处理时间是6天是处理效果为42％也比较高，因而对种质M08来说可以采 用处理2和处理4作为诱导M08的多倍体诱导的较好的处理。
2.3对以上三个种质西瓜多倍体诱导结果进行正交分析
表6红小玉正交试验正交分析表
因子 极小值 极大值 极差R 调整R′ 秋水浓度 温度 苗态 时间 8.61333 9.26333 7.52000 7.70333 16.1733 14.7200 17.6600 15.6400 7.5600 5.4567 10.1400 7.9367 6.80904 4.91464 9.13276 7.14829 表7京父-2正交试验正交分析表 因子 极小值 极大值 极差R 调整R′ 秋水浓度 9.08667 11.8067 2.7200 2.44981
温度 苗态 时间 10.56333 4.96333 6.10333 11.1400 15.8167 16.3000 0.5767 10.8533 10.1967 0.51938 9.77523 9.18380
表8M08正交分析表
因子 极小值 极大值 极差R 调整R′ 秋水浓度 温度 苗态 时间 29.05667 32.00000 26.47333 27.72333 36.6667 34.8633 39.0567 39.8067 7.6100 2.8633 12.5833 12.0833 6.85407 2.57891 11.33339 10.88305
通过正交分析，对以上三个西瓜二倍体种质诱导过程中，四个因素在正交 试验中对诱变结果的影响大小关系是：苗态(摘心)＞处理时间＞秋水仙素浓 度>处理温度。即不同的苗态摘心处理的变化对整个诱变率的影响最大，其次 识不同的处理时间，再就是秋水仙素的浓度变化，最后是不同的低温处理， 因而不同的苗态摘心处理是提高诱变率的关键因素，因而，在诱变过程中要 选择最合适的苗态进行诱导处理。
3总结及讨论
3.1通过正交试验结果可以看出对西瓜幼苗进行摘心滴苗处理能够显著 提高西瓜多倍体的诱导率，对西瓜种质M08最高可达46％，红小玉和京父也 有了很大的提高，达到了25.49％和22.22％。而且通过正交试验得出在不同 的苗态摘心处理是提高多倍体诱变率的关键因素，其次是处理时间，再就是 秋水仙素的浓度的变化，影响最小的是不同的低温处理。
3.2通过整个实验可以看出，对西瓜不同种质进行多倍体诱变过程中，幼 苗越小，处理温度越低，处理时间越长，处理时秋水仙素浓度越高，幼苗的 成活率越低，但基本上都在85％以上。
3.3通过对西瓜多倍体的诱导试验，可以明显得看出对西瓜进行不同苗 态的摘心处理可以明显提高西瓜多倍体的诱变率，获得西瓜多倍体种质。在 本实验中由于西瓜幼苗育苗时间，幼苗处理时间及栽培时间有一定不同，在 一定程度上影响了西瓜幼苗的成活率，因而在以后的多倍体诱导试验中要尽 量消除一些环境因素的影响。，
实施例1京父-2多倍体种子的生产方法
将二倍体西瓜京父-2的种子在经温烫浸种后在常温水中浸种6h后，再 经0.08％秋水仙素浸种18h后，用湿毛巾包好后在培养箱中30℃(下进行催 芽48～72h，露白后播种于穴盘中，育苗基质为泥炭和蛭石，于温室内育苗， 在西瓜幼苗长至不同的苗态二叶一心，将幼苗置于12℃的人工智能培养箱中， 对幼苗进行摘除生长点后，进行0.3％秋水仙素，每天一次滴苗，在光照14 h/天，光照强度为3000lx，连续处理六天，进行多倍体诱导，待幼苗长出 新的生长点后对幼苗进行多倍体鉴定，得到京父-2的多倍体诱变率为23.2 ％，将多倍体幼苗定植，压蔓整枝授粉保存多倍体种子。
实施例2M08多倍体种子的生产方法
将二倍体西瓜京父-2的种子在经温烫浸种后在常温水中浸种8h后，再 经0.05％秋水仙素浸种18h后，用湿毛巾包好后在培养箱中30℃(下进行催 芽48～72h，露白后播种于穴盘中，育苗基质为泥炭和蛭石，于温室内育苗， 在西瓜幼苗长至不同的苗态二叶一心，将幼苗置于15℃的人工智能培养箱中， 对幼苗进行摘除生长点后，进行0.2％秋水仙素，每天一次滴苗，在光照14 h/天，光照强度为3000lx，连续处理五天，进行多倍体诱导，待幼苗长出 新的生长点后对幼苗进行多倍体鉴定，得到M08的多倍体诱变率为46％，将 多倍体幼苗定植，压蔓整枝授粉保存多倍体种子。
实施例3海黄一号多倍体种子的生产方法
将二倍体西瓜海黄一号的种子在经温烫浸种后在常温水中浸种8h后，再 经0.0％秋水仙素浸种18h后，用湿毛巾包好后在培养箱中30℃(下进行催 芽48～72h，露白后播种于穴盘中，育苗基质为泥炭和蛭石，于温室内育苗， 在西瓜幼苗长至不同的苗态一叶一心，将幼苗置于18℃的人工智能培养箱中， 对幼苗进行摘除生长点后，进行0.3％秋水仙素，每天一次滴苗，在光照14 h/天，光照强度为3000lx，连续处理五天，进行多倍体诱导，待幼苗长出 新的生长点后对幼苗进行多倍体鉴定，得到的多海黄一号多倍体诱变率为28 ％，将多倍体幼苗定植，压蔓整枝授粉保存多倍体种子。