相关专利和专利申请的交叉引用
本发明主题涉及2001年1月23日出版的美国专利No.6,177,439， 和与本申请同一天递交的共同待决且共同拥有的美国非临时专利申 请，名称为：5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱及其制备和治疗癌症 的用途，律师代理案件号为DRF3.0-031US，它们都通过整体引用而 并入本文。
本发明是专利合作条约申请，并要求获得2006年5月24日递交 的印度临时申请No.897/CHE/2006和2007年1月31日递交的美国 临时申请No.60/887,416的权益，它们都被本文所参考，并通过整体 引用而并入本文。
发明背景
(1)发明领域
本发明总体来讲涉及晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，其 制备方法，及其使用方法和组合物。
(2)相关技术描述
喜树碱(CPT)是五环植物生物碱，最早由Wall等人从中国喜树 (Camptotheca acuminate)中分离得到，J.Am.Chem.Soc，88：3888 (1966)。喜树碱的结构如式I所示：
未经修饰的喜树碱，亲脂性高而水溶性差。早期使用溶于氢氧化 钠水溶液的喜树碱钠进行临床试验，表明该化合物具有抗肿瘤活性， 其它研究证明活性归因于化合物作为DNA拓扑异构酶I抑制剂的作 用。然而，由于喜树碱的毒性问题和有限的水溶性，其潜在治疗作用 远未得以充分实现。
为改善该化合物的性质进行了尝试，包括合成和检测许多喜树碱 类似物。例如，美国专利No.5,004,758描述了水溶性喜树碱类似物， US 5,734,056描述了喜树碱类似物。美国专利No.5,004,758和美国专 利出版物US 2007/0105885讨论了喜树碱的类似物，托泊替康 (Topotecan)。
美国专利No.6,177,439描述了20(S)-喜树碱的各种C-5取代的类 似物。其中一种类似物，5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的结构 如式II所示：
专利6,177,439，公开了该类似物的非对映异构体混合物的制备 方法，—本文称作5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，或者5-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，是5-烷氧基取代的具五环 结构的20(S)-喜树碱类似物。其手性中心位于C-5和C-20。C-20手 性中心对应于天然S-构型。然而，C-5取代表现为比例大致相等的R 和S非对映异构体。5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的分子式为 C22H20N2O6。化合物的分子量为408.41克/摩尔，熔点为190℃。非对 映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，或5-(2′-羟基乙 氧基)-20(S)-喜树碱的水溶性不好。
5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(S)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱非对映异构体，化学上描述为5(S)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱，而5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的5(R)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体，化学上描述为5(R)-(2′-羟基 乙氧基)-20(S)-喜树碱。5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，还可化学 上描述为4-(S)-乙基-4-羟基-12(S)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧 杂-6，12a-二氮杂二苯并[b，h]芴-3，13-二酮，其具有如式III所示的下列 化学结构：
5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱非对映异构体的化学结构如 式IV所示：
一般来讲，作为对映体的异构体，当以对称形式存在时，除能够 使平面偏振光旋转角度相同但方向相反之外，具有相同的化学和物理 性质。另一方面，作为非对映异构体的异构体是立体异构体，而不是 对映体。非对映异构体可以具有不同的物理性质和不同的反应性，且 通常如此。另一种定义，非对映异构体是在一处或多处手性中心具有 相反构型，但互相不为镜象的成对异构体。
众所周知，不同固态形式的化合物可以具有不同的物理性质。在 药用化合物中，这种差异对商业化合物的成功具有重要的影响。例如， 具有不同固相形态的化合物，可以具有不同的充填性质(packing property)，例如摩尔体积、密度和吸湿性，不同的热力学性质，例如 熔融温度和溶解度，不同的动力学性质，例如溶解速率和稳定性(包 括在周围条件下的稳定性，特别是对湿度的稳定性，和在贮藏条件下 的稳定性)，不同的表面性质，例如表面积、可湿性、界面张力和形 状，不同的机械性质，例如硬度、抗张强度、压塑性、处理、流动和 混合性质，和/或不同的过滤性质。物理性质上的这些差异，可以影 响药用化合物的制备、加工、配方或给予。
药用化合物的另一个重要固态性质，是其在水性液体中的溶解速 率。活性成分在患者胃液中的溶解速率，可以对治疗产生影响，因为 它给出了口服给药的活性成分可到达患者血流的速率上限。因此，溶 解速率可以对给予药物的治疗效果产生重要影响。
通常，药用化合物的溶解速率取决于其稳定的晶型。同样，药用 化合物的这个性质，在配制糖浆、酏剂，及其它液体药物时，应作为 重要特性加以考虑。化合物的固态形式也可影响其压制行为及其贮藏 稳定性。
因此，由上清楚可知，期望提供5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜 树碱的稳定晶型的活性5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱药用成分， 其具有所需的批量处理(bulk handling)和溶解特性。
发明概述
简而言之，因此本发明涉及新的晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)- 喜树碱，其特征在于X射线粉末衍射图包含一个或多个选自7.2±0.1， 9.4±0.1，11.02±0.1，12.00±0.1，14.54±0.1，15.2±0.1，18.92±0.1， 21.86±0.1，22.74±0.1和26.42±0.1°2θ的峰强(peakintensity)。
本发明还涉及包含上述晶体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱 和药学上可接受载体的新药用组合物。
本发明还涉及用晶体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱生产药 用组合物的新方法，所述方法包括将上述晶体5(S)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱与药学上可接受载体混合。
本发明还涉及新的制备上述晶体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜 树碱的方法，所述方法包括：
(a)使5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱与选自正丁醇或四氢 呋喃的溶剂混合；
(b)回流混合物约1至约4小时；
(c)使混合物冷却至约40℃至约50℃；和
(d)将固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱从混合物中分离。
本发明还涉及用晶体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱治疗患 者癌症的新方法，所述方法包括给予患者有效量的上述晶体5(S)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。
本发明发现取得了几个有益之处，尤其是提供了5(RS)-(2′-羟基 乙氧基)-20(S)-喜树碱具有所需的批量处理(bulk handling)和溶解特性 的稳定晶型的活性5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱药用成分。
附图简述
图1为本发明固态5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱实施方式的 差示扫描量热法(DSC)温谱图；
图2为本发明固态5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱实施方式的 X射线粉末衍射(XRPD)图；
图3为本发明固态化合物晶胞中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树 碱的两个独立分子I&II的空间关系；
图4为单晶5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的模拟X射线衍射 图与本发明晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱实施方式实验粉 末X射线衍射图的比较；
图5为本发明固态5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱实施方式的 傅立叶变换红外(FT-IR)光谱图；
图6为5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在DMSO-d6中的质子 核磁共振谱(1HNMR)图；
图7为5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在DMSO-d6中的D2O 交换谱图。
图8为5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱在DMSO-d6中的C-13 核磁共振(13CNMR)谱图；
图9为固态5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱实施方式的紫外 (UV)谱图。
图10为5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的DSC温谱图；
图11为固态5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的DSC温谱图；
图12为5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的X-射线粉末衍射 图；和
图13为5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的X-射线粉末衍射 图；
优选实施方式的详述
本发明涉及5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的固态物理性质， 晶型在制剂中的用途，和药物活性。依照本发明，现已发现5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的新晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树 碱非对映异构体，具有优于外消旋形态化合物和5(R)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱形态化合物的优势。此外，作为本发明的一个实施 方式，本文所述晶型还提供了在制备、加工、配方和/或给予化合物 方面优于其它固态形式的好处。
在其它实施方式中，本晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱可 以是无水的。本晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱可以是非吸湿 性的，具有高度物理稳定性，并且在正常室温环境下具有可接受的固 态性质。此外，本晶型组合物可用于治疗和/或预防癌症疾患。
本发明还提供了新晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的制 备方法。
本发明还涉及包含新晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱和 药学上可接受载体的药用组合物，本发明的各种实施方式可适合于经 口服、注射、吸入、滴眼液、静脉内及其它途经给予，如下讨论。
在另一个实施方式中，晶型5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的 含水量小于约1％w/w，或者小于约0.5％w/w，或者更小于约0.25 ％w/w，用库仑卡尔费歇尔(KF)滴定法测定。(见，例如Poynter，W.G. 和R.J.Barrios，Oil and Gas Journal，92：15(1994)。
选择在生产加工(例如粉碎以获得降低粒径和增大表面积的物料) 期间物理稳定的固态形式的5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，可以 避免特殊的加工条件，以及常与这种特殊加工条件相关的成本增加。 类似地，选择在一定范围的贮藏条件下物理稳定的固态形式的 5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，可有助于避免化合物产生多晶型 或其它降解变化，而这些变化会导致产品损失或者产品效力退化。因 此，选择具有更好物理稳定性的固态形式的5(S)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱，具有优势。
在一个实施方式中，本晶型5(S)-CPT的全相(overall phase)纯度 超过约90％，或超过约95％，或超过约97％，或超过约98％，或超 过约99％。
本文描述了新晶型5(S)-CPT。在某些实施方式中，晶体5(S)-CPT 基本不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。当本晶体5(S)-CPT被 描述为基本不含5(R)-CPT时，这是指CPT中5(R)-CPT的量，小于 约2％w/w CPT总量；或小于约1.5％w/w；或小于约1％w/w；或小 于约0.5％w/w；或小于约0.1％w/w。
本晶体5(S)-CPT是有益的，因为其是非吸湿性的，其是稳定的， 其以晶体形态存在，且可以无水形态存在。由于其物理稳定性的增加， 与非对映异构体混合物5(RS)-CPT相比，本晶体5(S)-CPT更易处理 和贮藏。
本申请说明书通篇讨论了本发明的其它方面和实施方式。
如本文所用，术语“DSC”指差示扫描量热法。
如本文所用，术语“XRPD”指X射线粉末衍射。
如本文所用，关于核磁共振(1H NMR)，符号“δ”指1H NMR化学 位移；缩写“d”指1H NMR双峰；缩写“m”指1H NMR多重峰；缩写“q” 指1H NMR四重峰；缩写“s”指1H NMR单峰；缩写“t”指1H NMR三 重峰。
如本文所用，关于喜树碱，术语“C-5位”指如上式I1所示，存在 于5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的化学结构第5位上的碳原子， 术语“C-20位”指如上式I1所示，存在于5(S)-(2-羟基乙氧基)-20(S)- 喜树碱的化学结构的第20位上的碳原子。
如本文所用，在本说明书全文中，“5(S)-CPT”是指“5(S)-(2′-羟基 乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其化学名称为“4-(S)-乙基-4-羟基-12-(S)-(2- 羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13- 二酮”。
如本文所用，在本说明书全文中，“5(R)-CPT”是指“5(R)-(2′-羟基 乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其化学名称为“4-(S)-乙基-4-羟基-12-(R)-(2- 羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2-氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13- 二酮”。
如本文所用，在本说明书全文中，“5(RS)-CPT”是指“5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”或“5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱”，其化 学名称为“4-(S)-乙基-4-羟基-12-(RS)-(2-羟基乙氧基)-1，12-二氢-4H-2- 氧杂-6，12a-二氮杂-二苯并[b，h]芴-3，13-二酮”。
如本文所用，术语“组合物”是指通过混合或结合多于一种的元素 或成分而得到的产品。
如本文所用，术语“单个晶体”，也称作单晶，是指结晶固体，其 中整个样品的晶格是连续且完整的，直到样品的边缘，而没有晶界。
如本文所用，关于5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，术语“晶 型”是指固态形式，其中5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱分子的排 列形成可区别的晶格，其(i)包含可区别的晶胞，和(ii)在受X射线辐 射时产生衍射峰。
如本文所用，术语“相纯度”是指相对于其它固态形式5(S)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的纯度，而不一定是指相对于其它组分的 高度化学纯度。
术语“约”，用于本文指测定量时，是指测定量的正规变分(normal variation)，可由实施测量的技术人员根据测量目的和测量设备精度进 行预测。
如本文所用，术语“无水的”，是指物质基本不含水，并且物质可 以包含小于约1.0％w/w水，且物质可以包含小于约0.5％w/w水。如 本文所用，术语“无水的”和“无水物”可替换使用。
术语“非吸湿性”，用于本文指物质时，是指在正常室温、压力和 湿度条件下，不吸收空气中湿气的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”，是指与组合物中其它 成分相适合且不会有害于患者的载体。这种载体可以是药学上可接受 的物质、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、 溶剂或胶囊成形材料(encapsulating material)，参予运载或输送化学物 质。如下面更加详细的论述，优选的组合物依赖于给药方法。
如本文所用，术语“治疗有效量”，是指可引发研究者或临床医生 正寻求的组织、系统或动物的生物学或医学反应的药物或药用物质的 量。
如本文所用，术语“治疗”(和相应的术语“治疗的”和“治疗性”)， 是指对患者缓解、恢复和预防性的治疗。
如本文所用，术语“预防”，是指采取措施以维持健康并防止患者 疾病扩散。
如本文所用，下列术语/符号的意义为：
“kg”指“千克”
“mg”指“毫克”
“μl”指“微升”
“μg”指“微克”
“KBr”指“溴化钾”
“DMSO”指“二甲基亚砜”
晶体5(S)-CPT的表征：
卡尔费歇尔滴定法测定水份
使用卡尔费歇尔试剂在 DL 31 KF仪器上测定晶体 5(S)-CPT的水份。将称定量的晶体5(S)-CPT转移至卡尔费歇尔仪器 的滴定容器中，其内装有约40ml事先中和好的甲醇。搅拌下使样品 溶解，然后在剧烈搅拌下用卡尔费歇尔试剂滴定至终点。水份的计算 如下：
在40℃±2℃/765％RH±5％RH加速稳定性条件下6个月，用卡 尔费歇尔分析法测定，未观察到水份变化，且发现产品是非吸湿性的。 产品在6个月加速条件下稳定。
差示扫描量热法(DSC)分析：
用 DSC-50量热计进行晶体5(S)-CPT的DSC分析。 将样品放置在铝盘上，精密记录重量，用盖子把盘子盖上，使夹钳松 开。使每个样品平衡，并在氮气下以5℃/分钟的速率加热。熔融吸热 峰的温度报告为熔点。来自DSC分析的数据取决于几个因素，包括 加热速率、样品的纯度、晶体大小和样品量。本晶体5(S)-CPT的特 征还在于：用DSC测量，如图1所示，约234℃至238℃，或约234℃ 至236℃有单熔融吸热峰。
X射线粉末衍射法(XRPD)：
用X射线粉末衍射法(“XRPD”)分析5(S)-CPT的晶体结构。使用 配有水平角度计(θ/2θ几何学)的Rigaku D/Maz 2200衍射仪，测量X 射线粉末衍射光谱。所用X射线管为Cu K-α，50KV和34mA下的 波长为发散和散射狭缝设置在0.5°，接收狭缝设置在0.15 毫米。用闪烁计数检测法检测衍射的辐射，以3°/分钟从3至45°进行 θ至2θ连续扫描。
晶体5(S)-CPT的例证性XRPD图如图2所示。表1列出了晶体 5(S)-CPT相应的主要衍射峰(2θ)值和强度。
表1：晶体5(S)-CPT的特征XRPD峰
2θ相对强度百分比(I/I0)7.2769.49311.025212.005114.546515.2010018.924521.863922.743426.4254
应该认识到，在晶体5(S)-CPT与其它相的混合物中，不是表1 列出的所有峰都会在混合物的粉末衍射图中明显可见。
可能的异构现象和立体化学的鉴别：
用5(S)-CPT样品进行单晶衍射研究，目的在于确定5(S)-CPT的 C-5位上的绝对立体化学。适于X射线衍射研究的晶体从二甲基亚砜 中长大。5(S)-CPT在单斜晶空间群P21中结晶，晶胞参数为3和 Z＝4。用CCD面积检测器(area-detector)石墨单色MoKα辐射在Rigaku AFC-7S单晶衍射仪上收集X射线强度数据。用直接方 法(SIR92软件)得出结构，并用最小平方法细化(refine)。对于3713 观测的反射(3713 observed reflections)，最终R(Rw)为0.041(0.044)。 晶胞中两个独立分子I&II(图3)，在5(S)-CPT的C-5位侧链上 的构象有所不同。
根据C-20位上的已知构型是S立体中心，确定C-5位上的绝对 立体化学为S立体中心。
单晶X射线衍射的模拟粉末X射线图与实验粉末X射线衍射的 数据相符很好(图4)。
傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法：
晶体5(S)-CPT的特征还在于傅立叶变换红外(FT-IR)光谱，在固 态KBr分散体中记录。使用 1650傅立叶变换红外分光 光度仪进行结构确认。实验误差，除非另有说明，为±2cm-1。
晶体5(S)-CPT的红外光谱显示，在约3271，2927，1743，1669， 1607，1504，1465，1405，1342，1225，1158，1188，1080，1120，1043，992， 893，838，796，772，和659cm-1处具有吸收带。红外光谱基本如图5 所示。
核磁共振(NMR)研究：
在400MHz的 Mercury Plus Fourier Trans form(FT)NMR 波谱仪上检测5(S)-CPT(DMSOd6)的1H和13C NMR。1H和13C NMR 化学位移以δ(ppm)标度报告，分别相对于内标TMS(δ0.00)和 DMSO-d6(δ 39.50)。5(S)-CPT的1H和13C NMR波谱分别如图6和图 8所示。发现δ 4.82和6.55ppm处的信号归属于D2O交换波谱的可 交换质子(见图7)。
紫外分光光度法(UV光谱)：
5(S)-CPT(甲醇中，浓度＝0.001％w/v)的UV光谱在Shimadzu 2100紫外可见分光光度仪上记录。所得光谱如图9所示，显示在λ357， 293，257和207nm处有四个最大峰。
5(S)-CPT的晶型：
在一个实施方式中，5(S)-CPT以晶体形式获得分离，其基本不含 水(即，基本无水)。术语“基本不含水”是指存在少于约1.0％水w/w， 且特别少于约0.5％水w/w，用卡尔费歇尔分析法或TGA法测量。在 这种形式中，5(S)-CPT的有利性质是，在40℃±2℃/75％RH±5％RH 条件下6个月加速稳定性实验中，水份用卡尔费歇尔分析法测量，未 发现明显变化，且发现为非吸湿性的。产品在40℃±2℃/75％RH±5％ RH的加速稳定性实验条件下可稳定6个月，在30℃±2℃/65％RH± 5％RH的长期稳定性实验条件下可稳定24个月。
本发明的另一个实施方式，提供了晶体5(S)-CPT，其差示扫描量 热法温谱图、X射线粉末衍射图、X射线晶体结构、傅立叶变换红外 光谱、质子核磁共振谱、D2O交换谱、C-13核磁共振谱、UV光谱分 别如图1、图2、图3、图5、图6、图7、图8和图9所示。
本发明的一个方面，提供了晶体5(S)-CPT，其差示扫描量热法温 谱图、X射线粉末衍射图、傅立叶变换红外光谱分别如图1、图2和 图5所示。
本发明的另一个方面，提供了晶体5(S)-CPT，其差示扫描量热法 温谱图和X射线粉末衍射图分别如图1和图2所示。
本发明的另一个实施方式，提供了晶体5(S)-CPT，其X射线粉 末衍射图如图2所示。
本发明的另一个实施方式，提供了无水晶型5(S)-CPT，其XRPD 图具有至少一个选自7.2±0.1，9.4±0.1，11.02±0.1，12.00±0.1，14.54 ±0.1，15.20±0.1，和18.92±0.1°2θ的衍射峰。在一个实施方式中， 该晶型的XRPD图在7.2±0.1°2θ处具有衍射峰。在另一个实施方式 中，该晶型的XRPD图在7.2±0.1°2θ处具有衍射峰，此外具有至少 一个选自9.4±0.1，11.02±0.1，12.00±0.1，14.54±0.1，15.20±0.1，和 18.92±0.1°2θ的另外的衍射峰。
本发明的另一个实施方式，提供了晶体5(S)-CPT，其FT-IR光谱 具有至少一个选自3271±2，1743±2，1669±2，1607±2，1225±2， 1158±2，1043±2和992±2cm-1的吸收带。在一个实施方式中，该 晶型的FT-IR光谱在1743±2cm-1处具有吸收带。在另一个实施方式 中，该晶型的FT-IR光谱在1743±2cm-1处具有吸收带，此外还具有 至少一个选自3271±2，1669±2，1607±2，1225±2，1158±2，1043± 2和992±2cm-1的吸收带。
在一个适当的实施方式中，晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2± 0.1°2θ处具有衍射峰，且FT-IR光谱在1743±2cm-1处具有吸收带。
在另一个实施方式中，晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2±0.1°2θ 处具有衍射峰，且FT-IR光谱在3271±2和1743±2cm-1处具有吸收 带。
在另一个实施方式中，本晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2±0.1 和9.4±0.1°2θ处具有衍射峰，且FT-IR光谱在1743±2cm-1处具有 吸收带。
在另一个实施方式中，晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2±0.1和 9.4±0.1°2θ处具有衍射峰，且FT-IR光谱在3271±2和1743±2cm-1处具有吸收带。
在另一个实施方式中，晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2±0.1，9.4 ±0.1，11.02±0.1，12.00±0.1，14.54±0.1，15.20±0.1和18.92±0.1°2θ 处具有衍射峰，且FT-IR光谱在3271±2，1743±2，1669±2，1607±2， 1225±2，1158±2，1043±2和992±2cm-1处具有吸收带。
在另一个实施方式中，晶体5(S)-CPT的XRPD图在7.2±0.1，9.4 ±0.1，11.02±0.1，12.00±0.1，14.54±0.1，15.20±0.1和18.92±0.1°2θ 处具有衍射峰，且熔点范围为约234℃至约238℃。
为了对比之目的，依照美国专利No.6,177,439制备的5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，和5(R)-CPT的X射线粉末衍射图分别如 图12和图13所示。
本发明的另一个实施方式，提供了基本不含5(R)-CPT的晶体 5(S)-CPT。该物质的特征还在于：DSC测量的单熔融吸热峰在约236℃ 处，如图1所示。相比而言，依照美国专利No.6,177,439制备的非 对映异构体混合物5-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的DSC图(如图10 所示)要复杂得多，在约39℃处具有吸热峰，第二个吸热峰在约173℃ 处，且第三个吸热峰在约207℃处，与美国专利No.6,177,439所列该 化合物的190℃熔点一致。此外，5(R)-CPT的DSC图如图1l所示， 在约63℃处有吸热峰，第二个吸热峰在约186℃，且第三个吸热峰在 约205℃。这再一次确定了5(S)-CPT和5(R)-CPT的不同固态结构。
此外，晶体5(S)-CPT的较高熔点，表明该晶型比5(R)-CPT更稳 定。
本发明的另一个实施方式，提供了晶体5(S)-CPT，其NMR图如 表2所给出数值所示。
表2：5(S)-CPT的1H和13C NMR归属。
位置＊1Hδ(PPM)J(Hz)#13C2---150.823---143.3351H6.95-89.396--130.3971H8.78-133.228---127.7991H8.16-128.93101H7.73t(7.6)128.06111H7.88t(7.6)131.02121H8.16-129.0813---148.85141H7.26S96.8415---150.34
16---121.5616a---157.35172H5.42dd(16.4，2.4)65.13183H0.90t(7.6)7.73192H1.89M30.2920---72.1621---172.21 22Ha Hb4.17 4.00m m 73.02232H3.65M60.8424OH4.82t(5.2)-25OH6.55S-
*指以上结构式编号。
#该列给出了多重性(multiplicity)和偶合常数。
S-单峰，t-三重峰，dd-两组两重峰，m-多重峰。
基本不含5(R)-CPT的晶体5(S)-CPT，可通过下述方法获得，这 构成了本发明的又一个方面。
本发明的又一个方面，提供了无水晶型5(S)-CPT的制备方法。 在该方法中，将通过美国专利No.6,177,439或类似方法获得的 5(RS)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱，悬浮于适当的有机溶剂中，例 如正丁醇(n-BuOH)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、异丙醇(IPA)、 丙酮、甲基异丁基酮(MIBK)、乙基甲基酮(EMK)、乙睛(ACN)、乙酸 正丁酯、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、正丙醇(n-PrOH)、异丙醇(i-PrOH)、 戊醇等，或其混合物，回流约2至6小时。将悬浮液缓慢冷却至约 40至45℃，使沉淀完全。用常规技术分离沉淀，例如过滤，并且可 以用相同或其它适当的有机溶剂洗涤，真空干燥以得到基本不含 5(R)-CPT的固体5(S)-CPT。该产物可通过在相同或其它适当的有机 溶剂中反复回流约2至4次而得以富集。
在本发明的另一个实施方式中，提供的晶体5(S)-CPT包含少于 约1.5％式V所示的喜树碱二聚体，或少于约1％式V所示的喜树碱 二聚体，或少于约0.8％的喜树碱二聚体，或少于约0.5％的喜树碱二 聚体，或少于约0.1％的喜树碱二聚体，全都是基于w/w。
晶型5(S)-CPT与非对映异构体混合物5(RS)-(2′-羟基乙氧 基)-20(S)-喜树碱，在许多重要性质方面都不同，包括，例如，毒性、 体内抗肿瘤活性、生物利用度和拓扑异构酶I抑制性。此外，目前还 发现，基本不含5(R)-CPT的晶体5(S)-CPT是理想的抗肿瘤药用化合 物。
在本发明中，依照本领域普通技术人员周知的治疗癌症的标准给 药途经，来给予患者晶体5(S)-CPT。
提供的晶体5(S)-CPT，可以是纯化合物或者药学上的活性盐。例 证性的药学上可接受的盐，可由甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、 葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、 马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲 酸、甲磺酸、硬脂酸、水杨酸、对-羟基苯甲酸、苯基乙酸、扁桃酸、 双羟萘酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羟基 乙烷磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、藻酸、b-羟基丁酸、半乳糖二 酸、半乳糖醛酸制得。
本发明化合物的适当药学上可接受的碱加成盐，包括金属离子盐 和有机离子盐。更优选的金属离子盐包括但不限于，适当的碱金属(Ia 族)盐、碱土金属(IIa族)盐和其它生理学上可接受的金属离子。这种 盐可由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌离子制得。优选的有机盐可以由 叔胺和季铵盐制得，部分包括：三甲基胺、二乙基胺、N，N′-二苄基 乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N甲基葡 糖胺)和普鲁卡因。所有上述盐，都可以通过本领域技术人员采用常 规方法由本发明相应的化合物制得。
提供的本晶体5(S)-CPT，可以与药学上可接受的载体和赋形剂 (其中所有“载体”和“赋形剂”可用任一术语来描述)形成药用组合物。 药学上可接受的载体和赋形剂包括但不限于，生理盐水、Ringer’s溶 液、磷酸盐溶液或缓冲液、缓冲盐水及本领域周知的其它载体。药用 组合物还可以包含稳定剂、抗氧化剂、着色剂和稀释剂。选择药学上 可接受的载体和添加剂，使药用化合物的副作用降至最低，同时化合 物的性能不被消除或者不被抑制到治疗无效的程度。
在本发明的实施方式中，含5(S)-CPT的药用组合物，任选基本 不含5(R)-CPT。
药用组合物通常包含0.1至50％w/w，或1至20％w/w的活性晶 体5(S)-CPT化合物，组合物的其余部分为药学上可接受的载体、稀 释剂或溶剂。优选地，药用组合物为单位剂型，包含适量的活性化合 物，例如，获得预期目的之有效量。
本药用组合物，可经肠道和/或非肠道给药。口服(胃内)是优选的 给药途经。药学上可接受的载体，可以在适于本发明方法的固体剂型 中，包括片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂，其可用涂层和外壳来制备， 例如肠溶包衣及本领域周知的其它技术。适于口服给药的液体剂型包 括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。
非肠道给药包括皮下、肌内、皮内、乳房内、静脉内，及本领域 周知的其它给药方式。肠道给药包括溶液、片剂、缓释胶囊、肠溶包 衣胶囊和糖浆剂。给药时，药用组合物的温度可以为体温或接近体温。
拟口服使用的组合物，可以依照本领域周知的适于生产药用组合 物的任何方法来制备，这种组合物可以包含一种或多种选自以下的物 质：甜味剂、芳香剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上优良且口感良 好的制剂。片剂包含活性成分，混有适合于片剂生产的非毒性药学上 可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂，例如碳酸 钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀 粉或褐藻酸；粘合剂，例如淀粉、凝胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例 如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是无涂层的，或者它们可 经周知技术进行涂层，以延迟胃肠道内的崩解和吸收，从而可在较长 时期内持续有效。例如，可以使用延时物质，例如单硬脂酸甘油酯或 二硬脂酸甘油酯。
适于口服使用的制剂，还可以是硬凝胶胶囊，其中晶体5(S)-CPT 与惰性固体稀释剂(如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者软凝胶胶 囊，其中活性成分直接使用(present as such)，或者与水或油介质(如花 生油、液体石蜡，或橄榄油)混合。
生产的水性悬浮剂，可以包含晶体5(S)-CPT，混有适于水性悬浮 剂生产的赋形剂。这些赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基 纤维素、羟基丙基甲基-纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶 和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，可以是天然存在的磷脂，如卵磷脂， 或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者环氧乙 烷与长链脂肪醇的缩合物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或者环 氧乙烷与偏酯(来自脂肪酸和己糖醇)的缩合物，例如聚氧乙烯山梨醇 单油酸酯，或者环氧乙烷与偏酯(得自脂肪酸和己糖醇酐)的缩合物， 例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。
水性悬浮剂还可以包含一种或多种防腐剂，如乙基或正丙基对- 羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种芳香剂，或一种或多 种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液的制备，可以将晶体5(S)-CPT悬浮于ω-3脂肪酸、 植物油(如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡) 中。油性悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。
适于通过加入水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒，得到晶体 5(S)-CPT与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。 适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂的例子，上面已论述过。其它赋形剂， 例如甜味剂、芳香剂和着色剂，也可以存在。
晶体5(S)-CPT和包含晶体5(S)-CPT的组合物，还可以无菌注射 水性或olagenous悬浮液的形式经非肠道给药，或皮下，或静脉内， 或肌内，或膜内(intrasternally)，或者经输注技术给药。这些悬浮液的 制备，可依照周知技术使用上述那些适当的分散剂、润湿剂和悬浮剂， 或其它可接受的物质。无菌注射制剂，还可以是在非毒性非肠道可接 受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中 的溶液。在可接受的媒介和溶剂之中，可以使用水、Ringer’s溶液和 等渗氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发性油是常用的溶剂或悬浮介质。 为达此目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成的单或二甘 油酯。此外，发现n-3聚不饱和脂肪酸可用于注射剂的制备。
还可以气雾剂或喷雾器溶液的形式，经吸入给药，或者以栓剂形 式经直肠给药，通过将药物与适当的非刺激性赋形剂(常温下为固体 而在直肠温度下为液体)混合而制成栓剂，因此栓剂在直肠中融化以 释放药物。这种物质是可可油和聚乙二醇。
本发明还包括口腔或“舌下”给药，其包括含本文所述化合物的锭 剂或咀嚼口香糖。可将化合物沉积在调味基质中，常为蔗糖和阿拉伯 胶或黄芪胶，还有惰性基质(例如凝胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包 含化合物的锭剂。
本发明还包括局部给药系统，包括膏剂、粉末剂、喷雾剂、霜剂、 凝胶剂、洗眼剂、溶液或悬浮剂。
粉末剂的优点是，粘附在湿润表面之上，从而可以较长时间持续 有效。因此，粉末剂特别适于治疗例如耳道内的癌症。同理，霜剂也 是有效的药学上可接受的载体。
本发明的组合物可以任选加入其它的物质，例如粘性增强剂、防 腐剂、表面活性剂和渗透促进剂。
这种粘性强化剂包括，例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基 纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟 基丙基纤维素或本领域技术人员周知的其它物质。这些物质的使用量 通常为0.01％至2％重量。
任选使用防腐剂，以防止使用期间的微生物污染。适当的防腐剂 包括：聚季铵盐-1(polyquaternium-1)、苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、 尼伯金甲酯、尼伯金丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸，或本领域 技术人员周知的其它物质。优选使用聚季铵盐-1作为抗菌防腐剂。通 常，这种防腐剂的使用量为0.001％至1.0％重量。
本组合物组分的溶解度，可因组合物中的表面活性剂或其它适当 的助溶剂而得以增加。这种助溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80，聚 氧乙烯/聚氧丙烯表面活性剂(如，Pluronic F-68、F-84和P-103)，环 糊精，或本领域技术人员周知的其它物质。通常，这种助溶剂的使用 量为0.01％至2％重量。
药学上可接受的赋形剂和载体包括所有前述及类似物质。上面关 于有效配方和给药方式的考虑，是本领域众所周知的且描述于标准教 科书中。见例如Gennaro A.R.，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(药学科学与实线)，第20版，(Lippincott，Williams和Wilkins)， 2000；Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷氏药物 科学)，Mack Publishing Co.，Easton Pennsylvania，1975；Liberman，等人， Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms(药物剂型)，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Kibbe，等人，Eds.，Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)(第三版)，American Pharmaceutical Association(美国制药协会)，Washington，1999。
为了本发明的目的，优选晶体5(S)-CPT的量包含有效量的化合 物。因此本发明包括预防或治疗癌症、肿瘤，和/或肿瘤相关疾病或 病患(在本文中统称为“癌症”)的方法，这种治疗可给予需要这种预防 或治疗的患者，该方法包括给予患者有效量的本文所述晶体 5(S)-CPT。
在确定晶体5(S)-CPT的有效量或剂量时，主治诊断医生会考虑 多种因素，包括但不限于，所用化合物的疗效和作用持续时间、受治 疾病的性质和严重程度，以及受治患者的性别、年龄、体重、总体健 康状态和个体反应，及其它相关的情况。可以理解的是，用于治疗或 预防癌症所需晶体5(S)-CPT的量，可在较宽限度内变化，且可根据 每个具体病例的个体需要进行调整。
对于任何化合物，治疗有效剂量最初可在细胞培养或动物模型中 估计。治疗有效剂量是指改善病情或其症状的活性化合物的量。细胞 培养或动物模型中的疗效和毒性，可用标准药学方法来确定(例如， ED50：总体的50％治疗有效的剂量；LD50：总体的50％致死剂量)。 然后可以使用来自细胞培养和动物模型的数据，得到患者使用化合物 的剂量范围。
通常，对于成人给药，适当的日用剂量如本文所述，但确定的优 选限度在有利的情况下可以被超过。日用剂量可以作为单次剂量或者 分次剂量给予。本领域技术人员会理解，剂量的确定还可参考指南： Goodman & Goldman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第 九版(1996)，附录II，页码1707-1711。通常推荐的日用剂量方案， 一般为约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天，或约0.05mg/kg/天至约25 mg/kg/天，或约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天，或约0.1mg/kg/天至 约5mg/kg/天，乃至为约0.2mg/kg/天至约3mg/kg/天。
在一个实施方式中，提供的晶体5(S)-CPT是可供口服给予的硬 凝胶胶囊，每个胶囊含5(S)-CPT约1mg至约1000mg，或者每个胶 囊含5(S)-CPT约2mg至约500mg，或约5mg至约250mg。当给予 平均体重约70kg的成人患者5(S)-CPT时，5(S)-CPT的日用剂量可 为约0.01mg/kg/天至约50mg/kg/天，或约0.05mg/kg/天至约25 mg/kg/天，或约0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天，或约0.1mg/kg/天至 约5mg/kg/天，乃至为约0.2mg/kg/天至约3mg/kg/天。
如本文所用，治疗目的的术语“患者”包括任何患者，且可以是需 要治疗癌症的患者。如本文所用，术语“需要的患者”是指患有或易患 癌症的任何患者。术语“需要的患者”还指需要低剂量常规癌症治疗物 质的任何患者。此外，术语“需要的患者”是指需要减少常规治疗物质 的副作用的任何患者。此外，术语“需要的患者”是指需要改善对癌症 治疗的任何常规治疗物质耐受性的任何患者。
所述患者通常是动物，而更通常为哺乳动物。“哺乳动物”，如本 文所用的术语，是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养或 农场动物、动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。所述 患者还可以是有患癌症风险或癌症复发风险的人类患者。
本发明的方法和组合物可用于治疗或预防几种癌症，包括但不限 于，卵巢癌、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、 中枢神经系统(CNS)癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺 癌、表皮样癌、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、子宫癌、软组织肉瘤、胰 腺癌和横纹肌肉瘤。
本发明的化合物和制剂还可用于治疗结肠癌、卵巢癌和骨肉瘤。
本发明的化合物和制剂还可用于治疗骨肉瘤、结肠直肠癌和胰腺 癌。
以下实施例描述了本发明的优选实施方式。本文权利要求书范围 之内的其它实施方式，对于考虑本文所公开的发明说明书或实践的本 领域技术人员来讲是显而易见的。说明书和实施例只作例证性考虑， 实施例之后的权利要求书，指明了本发明的范围和精神。实施例中给 出的所有百分数都是基于重量，除非另有说明。
实施例1
该实施例阐述5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的制备。
将如美国专利No.6,177,439实施例-26中所述制备的5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱(75克)，悬浮于正丁醇(约600ml)中，回流 约2至3小时。在1至4小时内使反应物料温度降至约40至50℃， 过滤所得固体物质，用正丁醇(约15至20ml)洗涤并在约50至55℃ 下真空干燥，得到基本不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的固体 5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。通过在正丁醇中反复回流，使产 物得到进一步富集(通常2至4次，产量25至35克)。最终干燥产物 的特征在于X-射线粉末衍射，XRPD图如图2所示，在约4.68，7.22， 9.4，11.02，12.00，14.14，14.54，15.20，16.22，17.10，17.32，17.94，18.92， 19.16，19.70，21.86，22.22，22.74，23.28，23.72，24.22，24.4，25.36，26.42， 27.12，27.66，28.58，29.12，29.46，30.62，30.78，31.42，31.94，32.46， 32.78，33.30，33.54，33.98，35.18，36.74，37.62，38.28，38.92，39.82， 40.38，42.08，42.22和43.98°2θ处具有峰。
实施例2
该实施例阐述5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的任选制备方 法。
将如美国专利No.6,177,439实施例-26中所述制备的5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品(75克)，悬浮于四氢呋喃(THF)(1125ml) 中，回流2至3小时。在约1至4小时内使反应物料温度降至40至 45℃，过滤所得固体，用THF(15至20ml)洗涤并在50至55℃下真空 干燥，得到固体5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。通过在THF中 反复回流，使产物得到进一步富集(通常2至4次，产量15至20克)。 最终干燥产物的特征在于图2所示的X-射线粉末衍射图。
实施例3
该实施例说明与5(RS)-CPT非对映异构体混合物和5(R)-CPT非 对映异构体相比，5(S)-CPT具有出乎意料高的拓扑异构酶I抑制活性。
将如美国专利No.6,177,439实施例-26中所述制备的5(RS)-(2′- 羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱样品(75克)，悬浮于正丁醇(约600ml)中， 回流约2至3小时。在1至4小时内使反应物料温度降至约40至50℃， 过滤所得固体物质，用正丁醇(约15至20ml)洗涤并在约50至55℃ 下真空干燥，得到基本不含5(R)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱的固体 5(S)-(2′-羟基乙氧基)-20(S)-喜树碱。通过在正丁醇中反复回流，使产 物得到进一步富集，得到基本不含5(R)-CPT的5(S)-CPT(通常回流2 至4次，产量25至35克)。
通过逐滴加入正庚烷，再用10μ Nutche过滤器过滤，使5(R)-CPT 从母液中分离。
得到如美国专利No.6,177,439实施例26中所述的5(RS)-(2′-羟基 乙氧基)-20(S)-喜树碱。
拓扑异构酶I在特定部位在DNA中引入瞬时切口(transient nicks)。这些瞬时DNA切口的检测需要用蛋白质变性剂将酶捕获在带 切口的中间复合物(nicked intermediate complex)中的DNA上。所得的 共价DNA/拓扑I复合物包含带切口的开环DNA，其可以用琼脂糖凝 胶电泳(含溴化乙啶)检测。捕获带切口的中间体效率相对较低，然而， 抑制剂，例如天然产物喜树碱，使中间体稳定并使带切口的DNA产 物增加。这就构成了机械药物筛选的基础，设计用于检测通过使切开 的中间体复合物稳定化来影响拓扑异构酶I的物质。
Topo I Drug Screening Kit(拓扑异构酶I药物筛选试 剂盒)(Topogen，Inc.，Port Orange，FL)的设计，使得研究者能快速识别 新的拓扑异构酶I抑制剂。该试剂盒可以检测新的化合物，其或者稳 定带切口的中间体，或者抑制拓扑异构酶I的催化活性。
所用分析试剂盒：药物筛选试剂盒
厂家：TOPOGEN，Cat No：1018
每一反应混合物包含：
使上述反应混合物在37℃下培养30分钟。通过加入2μl的10％ SDS使反应终止，使混合物迅速涡旋(应在37℃下加入SDS，因为冷 却试管可以重新封住带切口的DNA)。每管加入约2.5μl的10×染料， 再加入等体积的氯仿和异戊醇(24:1)混合物，以13000rpm离心10分 钟。加样于1％琼脂糖凝胶上，在80伏特下电泳1小时。在UV透 射仪上观察凝胶，并计算带的密度估值。
用密度仪测定超螺旋型和松弛型DNA的DNA带密度。记录处 理后(用单一浓度供试药物)和无药物(即，对照)的带密度。计算所有 通道(包括处理后和对照)的相比于超螺旋型DNA的松弛型DNA百分 数。
拓扑异构酶活性抑制率％的计算为：
＝(100-(100×(1/对照抑制率％)×处理后抑制率％))
表3为这些测试的结果以及基本互不包含的5(S)-CPT和 5(R)-CPT的体外拓扑异构酶I活性，与5(RS)-CPT的活性相比。
表3：5(S)-CPT、5(R)-CPT和5(RS)-CPT的拓扑异构酶I活性
化合物IC50(μM)5(S)-CPT1.065(R)-CPT225(RS)-CPT12.5
结果显示，5(S)-CPT抑制拓扑异构酶I的活性，是5(R)-CPT的 约21倍，是5(RS)-CPT的约12倍。这种活性上的差异，无法根据非 对映异构体之间结构上的差异来预期，众所周知，特别是考虑到E- 环在酶活性中的重要性。
实施例4
该实施例说明与5(RS)-CPT的活性相比，5(S)-CPT对抗裸鼠中 NCI-H460(人小细胞肺癌)异种移植物的抗肿瘤活性。
如实施例3中所述，提供5(S)-CPT和5(RS)-CPT样品。
为了进行NCI-H460异种移植物的研究，将NCI-H460肿瘤块 (tumor pieces)(约60mm3)植入雌性无胸腺裸鼠的背侧胁(dorsallateral flank)空间内以引发肿瘤生长。当肿瘤长至约150至1000mm3时，启 动治疗之前将动物随机分成5组。每克5(RS)-CPT配方包含102.65mg 活性化合物、801.62mg羟基丙基β-环糊精、80.62mg无水右旋糖和 13.33mg碳酸钠。每克5(S)-CPT配方包含105.57mg活性化合物、 800.99mg羟基丙基β-环糊精、80.13mg无水右旋糖和13.34mg碳酸 钠。每克安慰剂配方包含895.2mg羟基丙基β-环糊精、89.52mg无水 右旋糖和14.9mg碳酸钠。将每种配方溶于2ml无菌水中，经口服途 径(d×5)2方案给予。用游标卡尺一周两次测量肿瘤直径。
假定肿瘤为椭圆体，用下式计算肿瘤体积：
V＝(D×d2)/2，
其中V(mm3)是肿瘤体积，D是最长直径(mm)，d是最短直径 (mm)。用具体观察日的平均肿瘤体积，减去治疗第一天(起始日)的平 均肿瘤体积，来计算各治疗组(T)与对照组(C)肿瘤体积的变化(Δ)。这 些值用于下式中计算生长百分率(％T/C)
％T/C＝(ΔT/ΔC)×100，其中ΔT>0，或
％T/C＝(ΔT/ΔTi)×100，其中ΔT<0且
Ti是平均肿瘤体积。
然后用下式计算肿瘤生长抑制百分率(％TGI)：
％TGI＝100-％TC。
所有患约150至800mm3的皮下肿瘤的小鼠，用供试化合物经口 管饲法(d×5)2方案治疗。用游标卡尺一周两次测量肿瘤直径，假定肿 瘤为椭圆体，用式V＝(D×d2)/2计算肿瘤体积，其中V(mm3)是肿瘤 体积，D是最长直径(mm)，d是最短直径(mm)。用具体观察日的平 均肿瘤体积，减去治疗第一天(起始日)的平均肿瘤体积，来计算各治 疗组(T)与对照组(C)肿瘤体积的变化(Δ体积)。这些值用于下式中计 算生长百分率(％T/C)：
％T/C＝(ΔT/ΔC)×100，其中ΔT>0，或＝(ΔT/ΔTi)×100，其中ΔT <0，其中Ti是治疗开始时的平均肿瘤体积。用下式计算肿瘤生长抑 制百分率：肿瘤生长抑制百分率＝100-％TC。
如果肿瘤体积减至治疗开始时肿瘤体积的50％或更小而不小于 63mm3，则定为肿瘤部分衰退。如果肿瘤体积降至测量限以下(<63 mm3)，则定为完全衰退。
用下式计算与各动物起始日体重相比的体重变化百分比：
体重变化百分比＝[(具体观察日体重-起始日体重)/起始日体重] ×100。
其它观察参数是死亡率。
检测结果如表4所示，其中两种供试化合物和对照，各显示肿瘤 生长抑制率和死亡率。
表4：5(S)-CPT和5(RS)-CPT对患NCI-H460(人小细胞肺癌)异 种移植物的裸鼠的肿瘤生长抑制和死亡率的影响。
该检测数据表明，5(S)-CPT对抗裸鼠NCI-H460(人小细胞肺癌) 异种移植物的体内活性，优于非对映异构体混合物5(RS)-CPT。如表 4所示，与给予5(RS)-CPT相比，给予相同剂量的5(S)-CPT，产生出 乎意料更好的肿瘤生长抑制作用(2mg/kg时68％对比60％，4mg/kg 时76％对比64％)，而无死亡率增加。
实施例5
该实施例阐述在Sulphorhodamine(硫代罗丹明)B(SRB)分析中 5(S)-CPT对比5(R)-CPT的体外抑制细胞增殖效果
如实施例3中所述，提供5(S)-CPT和5(R)-CPT样品。
体外细胞生长分析方案
用Sulphorhodamine(硫代罗丹明)B(SRB)分析来评估细胞增殖， 染色后与细胞结合的染料量，可测出细胞生长。参考：JNCI，第83 卷，第11期，1991年6月5日，其通过参考而并入本文。
简而言之，将细胞(膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、表皮状 癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌和子宫癌代表的34人 类癌细胞系)，以每孔10000个细胞的浓度接种在96孔细胞培养板上， 并在CO2培养箱中37℃下培养。24小时之后，用溶于DMSO的不 同浓度的供试化合物来处理细胞，使培养基中的终浓度为0.05％，并 暴露48小时。通过加入冰冷的50％三氯乙酸(TCA)，并在4℃下培 养1小时使细胞固定。培养板用蒸馏水洗涤，风干，并在室温下用 SRB溶液(0.4％重量/体积，于1％乙酸中)染色10分钟。用1％乙酸 彻底洗去未结合的SRB，并使培养板风干。用10mM Tris缓冲液使 结合的SRB染剂溶解，在分光光度板读数器515nm单波长处读出光 密度。在药物加入时，细胞生长的单独的参考板在0小时(药物加入 时)也如上所述被终止。用下式由光密度计算生长百分率：
如果T大于或等于T0，生长百分率＝100×[(T-T0)/(C-T0)]，如果 T小于T0，生长百分率＝100×[(T-T0)/T0]，
这里T是供试品的光密度，C是对照的光密度，T0是0时的光密 度。
由生长百分率数据，得出剂量响应曲线，并且由生长曲线内插 GI50值。表5为结果。
表5：5(S)-CPT对比5(R)-CPT的GI50值。
化合物GI50(μM)5(S)-CPT5.05(R)-CPT14.6
该检测结果衣明试验中5(S)-CPT非对映异构体对抗细胞增殖的 活性几乎是5(R)-CPT非对映异构体的3倍。
实施例6
该实施例阐述5(S)-CPT在几种骨肉瘤模型中的效力。
如实施例3所述，提供5(S)-CPT和5(RS)-CPT样品。试验方案 见Cancer Res.，10月.15：64(2)7491-9(2004)，和Clin.Cancer Res.，11 月.15：9(15)：5442-53(2003)。
所有患约0.2至1厘米直径的皮下(＂sc)肿瘤的小鼠，用供试化合 物经口管饲法[(d×5)2]3方案治疗。用游标卡尺每七天测量一次肿瘤直 径，假定肿瘤为球体，用式[π/6)×d3]计算肿瘤体积，其中d是平均直 径。肿瘤对供试化合物的响应，如下规定：对于单个肿瘤，若体积衰 退>50％但始终有可测量的肿瘤，则定为PR。若在治疗开始后12周 内的某点，可测量的肿瘤块消失，则定为CR。若在12周研究时限内 没有肿瘤再生长，则定为持续CR。选择该时间点，是因为所有研究 为期至少12周。在12周研究时间结束之前且获得响应前死亡的小鼠， 被认为是肿瘤响应失败。结果(剂量为28mg/kg)如表6所示。
表6：5(S)-CPT对比5(RS)-CPT在小鼠肿瘤衰退模型中的效力。
异种移植物5(S)-CPT5(RS)-CPT骨肉瘤-296+5+骨肉瘤-176+4+骨肉瘤-26+5+骨肉瘤-326+3+
6+：持续完全衰退
5+：完全衰退
4+：部分衰退
3+：稳定疾病
如表6数据所示，与给予5(RS)-CPT相比，给予5(S)-CPT产生 了出乎意料更好的结果，用5(S)-CPT的所有四个异种移植物系都获 得了持续完全衰退(6+)。
实施例5和6提供的数据证明，5(S)-CPT在几种试验模型中具有 出乎意料更好的活性/效力特征。此外，5(S)-CPT的效力明显高于 5(R)-CPT，但出乎意料的是，该效力增加的同时，毒性没有相应增加。
实施例7
该实施例说明5(S)-CPT对比5(R)-CPT的人骨髓毒性。
如实施例3所述，提供5(S)-CPT和5(R)-CPT样品。
人骨髓分析方案：
包含甲基纤维素/Iscove′s MDM、胎牛血清、牛血清白蛋白、2- 巯基乙醇、L-谷氨酰胺(glutamine)、rhStem细胞因子、rhGM-CSF和 rhIL-3的MethocultTM GF(Cat No：H4534，Poietics，Biowhittakar，USA) 培养基用于分析。将人骨髓单核细胞(Cat No.2M-125C，Poietics， Biowhittakar，USA)与MethocultTM GF混合，调整细胞密度为3×105细胞/ml。将该制备液制成500μl的小份，向每份中加入2.5μl的20× 药物溶液或媒介物(vehicle)，并充分混合。将100μl克隆源(clonogenic) 培养基注入每个孔中，使板在4℃下胶化15分钟。板在培养箱中5 ％CO2全湿空气中37℃下培养14天。在倒置显微镜下计数CFU-GM 集落，以50个或更多细胞的聚集体计。用下式计算集落(colony)抑制 百分率：
100-[(药物处理孔内的集落数/对照孔内的集落数)×100]。
将两种非对映异构体(分别为5(S)-CPT和5(R)-CPT)对抗肿瘤细 胞系的体外效力，与其在健康细胞内的体外毒性进行比较。表7为人 细胞内骨髓毒性比较研究的结果。
表7：5(S)-CPT和5(R)-CPT对体外人骨髓细胞的GI90值。
化合物GI90(μM)5(S)-CPT0.695(R)-CPT0.89
参考表5中所示数据，可以看出，出乎意料的是，5(S)-CPT对抗 代表膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、结肠癌、表皮状癌、肺癌、卵巢癌、 黑素瘤、前列腺癌、肾癌和子宫癌的34人肿瘤细胞系的效力，几乎 是5(R)-CPT的3倍，而两种非对映异构体的毒性相当。事实上，如 果用人细胞毒性GI90与抗癌活性GI50的比值来估计安全范围(safety margin)，如表8所示，显然作为治疗癌症的药用化合物，5(S)-CPT 要出乎意料地优于5(R)-CPT和5(RS)-CPT。换句话说，在治疗癌症 方面，相比5(R)-CPT以及5(S)-CPT和5(R)-CPT的混合物，5(S)-CPT 化合物的效力有所增加。事实上，最大程度地减少给予患者的 5(S)-CPT中5(R)-CPT的存在量具有出乎意料的重要性。
表8：5(S)-CPT和5(R)-CPT的人细胞毒性GI90与抗癌活性GI50之比。
化合物安全范围(GI90/GI50)5(S)-CPT0.145(R)-CPT0.06
实施例8
该实施例说明5(R)-CPT的存在对大鼠和小鼠体内5(S)-CPT生物 利用度的影响。
如实施例3所述，提供5(S)-CPT和5(RS)-CPT样品。
给予雄性Wistar大鼠5(S)-CPT(2.5mg/kg)和5(RS)-CPT(5 mg/kg，混合物中含有2.5mg/kg的5(S)-CPT)，以评估口服药代动力 学。
将6至8周龄，体重205至218克的雄性Wistar大鼠分组，每 组四只大鼠。在过夜禁食情况下进行口服药代动力学试验，在进食情 况下进行静脉内药代动力学试验。供试药物作为溶液经口管饲法给予 或经侧尾静脉注射给予。在规定时间点从眼眶静脉丛(retro-orbital plexus)收集约250微升的少量血样，置于含25微升EDTA的微量离 心管中。以12,800rpm离心血液2分钟分离血浆，并冷冻直至分析。
如下检测样品中是否存在供试药物。取100μl血浆(8℃下贮藏)， 用400μl冷甲醇沉淀，以估算总量(内酯+羧酸酯)。混合2分钟，并 以12,800rpm离心4分钟后，分出澄清上清液，置于300μl自动进 样器小瓶中，取该混合物20μl注入分析柱进行HPLC分析。通过在 空白大鼠血浆中加入已知浓度的供试药物来绘制线性图，由此计算供 试药物的浓度。用非房室模型分析计算供试药物的药代动力学。
研究结果如表9所示。
表9：雄性Wistar大鼠体内5(S)-CPT的口服药代动力学参数
化合物剂量AUC(o-t)μM*h5(S)-CPT5mg/kg5.765(RS)-CPT 5mg/kg (2.5mg/kg5(S)-CPT+2.5mg/kg 5(R)-CPT) 5.08 5(RS)-CPT中 5(S)-CPT的贡献2.5mg/kg1.21
给予Swiss Albino小鼠5(S)-CPT(2.5mg/kg)和5(RS)-CPT(5 mg/kg，混合物中含有2.5mg/kg的5(S)-CPT)，以评估口服药代动力 学。
研究中使用3至6周龄，体重28至34克的Swiss Albino小鼠。 每次研究使用12只小鼠。在过夜禁食情况下进行口服药代动力学试 验，在进食情况下进行静脉内药代动力学试验。供试药物作为溶液经 口管饲法给予或经侧尾静脉注射给予。在规定时间点从眼眶静脉丛收 集约250微升的少量血样，置于含25微升EDTA的微量离心管中。 以12,800rpm离心血液2分钟分离血浆，并冷冻直至分析。
如下检测样品中是否存在供试药物。取100μl血浆(8℃下贮藏)， 用400μl冷甲醇沉淀，以估算总量(内酯+羧酸酯)。混合2分钟，并 以12,800rpm离心4分钟后，分出澄清上清液，置于300μl自动进 样器小瓶中，取该混合物20μl注入分析柱进行HPLC分析。通过在 空白小鼠血浆中加入已知浓度的供试药物来绘制线性图，由此计算供 试药物的浓度。用非房室模型分析计算供试药物的药代动力学。研究 结果如表10所示。
表10：Swiss Albino小鼠体内5(S)-CPT的口服药代动力学参数
化合物剂量AUC(o-t)μM*h5(S)-CPT5mg/kg5.185(RS)-CPT 5mg/kg (2.5mg/kg 5(S)-CPT+2.5mg/kg 5(R)-CPT) 5.20 5(RS)-CPT中 5(S)-CPT的贡献2.5mg/kg1.10
参考表9和10，“5(S)-CPT的贡献”是可归因于5(RS)-CPT非对 映异构体混合物中5(S)-CPT的曲线下面积(“AUC”)。从表9和10可 以看出，5(R)-CPT的存在出乎意料地降低了所需5(S)-CPT非对映异 构体的生物利用度。此外，认为在人类患者中可以观察到所需非对映 异构体生物利用度的这种意外降低。基于以上，非常希望将5(S)-CPT 中的5(R)-CPT量降至最低。
实施例9
该实施例阐述与5(R)-CPT和5(RS)-CPT相比，5(S)-CPT对抗 BCRP突变和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)过度表达Saos-2细胞的效力。
如实施例3所述，提供5(S)-CPT、5(R)-CPT和5(RS)-CPT样品。
对比非对映异构体混合物5(RS)-CPT，评估5(S)-CPT&5(R)-CPT 对过度表达功能性BCRP#4和非功能性BCRPmut#10的Saos-2细胞 的抗癌作用。人骨肉瘤细胞系，Saos-2，来自ATCC(American Type Culture Collection，Cat#HTB-85，Manassas，VA)，保存在含有10％胎牛 血清、1％青霉素/链霉素和2毫摩尔/升谷氨酰胺的DMEM中。Saos-2 细胞或者用BCRP#4转染以过度表达功能性BCRP，或者用BCRP#10 转染以过度表达非功能性BCRP运载体(transporter)。以每孔1000个 细胞的密度将细胞注入96孔板0.1ml培养基中，使结合过夜。第二 天早上，轻微抽吸培养基，并加入供试化合物的连续稀释液。细胞在 5％CO2培养箱中37℃下培养。与供试药物接触6天之后，以无菌方 式向每个孔中加入10μl Alamar蓝(Alamar blue)，再把板放回培养箱 中6小时。在Cytofluor 2300(Millipore，Bedford，MA)上使用530nm 激发波长和590nm发射波长，测量产生的荧光染料量。所得的相对 荧光单位用于计算各个浓度下相对于未处理对照值的生长百分率。由 生长百分率值，得到IC50(与对照细胞生长相比，抑制50％细胞生长 所需的抑制浓度)值。所得IC50值如表11所示。
表11：5(S)-CPT、5(R)-CPT和5(RS)-CPT对抗BCRP突变和乳腺癌 耐药蛋白(BCRP)过度表达Saos-2细胞的IC50值。
如表11所示，5(S)-CPT在其对BCRP突变和BCRP过度表达 Saos-2细胞的细胞毒活性方面，优于5(R)-CPT和5(RS)-CPT。这些 结果表明，对BCRP mut#10和BCRP#4的细胞毒性排序为5(S)-CPT >5(RS)-CPT>5(R)-CPT。5(S)-CPT对BCRP mut#10和BCRP#4过 度表达Saos-2细胞的细胞毒性，分别是5(R)-CPT的约6倍和>2.5 倍。
尽管在这里参考具体实施方式描述了本发明，但应明白的是，这 些实施方式仅仅是本发明原理和应用的例证。因此应明白，可以对例 证实施方式做各种修改，并且可以设计出其它安排(arrangements)，而 不脱离下列权利要求书所规定的本发明精神和范围。
说明书中引用的所有出版物，包括专利出版物和非专利出版物， 说明了与本发明相关的本领域技术人员的技术水平。所有这些出版物 通过引用而完全并入本文，其相同程度好像每个单独出版物都作了专 门且个别的“通过引用而并入”的说明。这里对参考文献的讨论，只是 想概述其作者的主张，未承认任何参考文献构成了现有技术。申请者 保留质疑(challenge)所引用参考文献之准确度和相关性的权利。
鉴于以上，可以看出本发明取得的几个优势，并获得了其它有利 的结果。
由于本领域普通技术人员可以对上述方法和组合物，做出各种改 变而不脱离本发明的范围，因此期望，在上述说明书中所含的和附图 中所示的所有内容，应被解释为例证性而不具有限制性意义。此外， 应该明白，各种实施方式的方面可以全部或部分地被掉换。