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1、(10)申请公布号 CN 102988765 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988765 A *CN102988765A* (21)申请号 201210590325.0 (22)申请日 2012.12.31 A61K 36/898(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 成都中医药大学 地址 611137 四川省成都市温江区柳台大道 1166 号 申请人 四川大学 (72)发明人 彭成 万峰 彭芙 熊亮 曹小玉 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 杜朗宇 (54) 发明名。
2、称 白及乙酸乙酯提取物的用途 (57) 摘要 本发明提供了白及乙酸乙酯提取物在制备抗 菌药物中的用途。白及乙酸乙酯提取物对各种革 兰氏阴性菌、 阳性菌以及耐药菌均有良好的抑制 作用， 能够有效保护细菌感染个体， 其药效活性与 抗生素相当， 尤其是该提取物还可以有效对抗耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌， 为临床用药提供了更 好的选择。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 白及乙酸乙酯提取物在制备抗菌药物中的用途。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于。
3、 ： 所述药物是抗临床耐药菌的药物。 3. 根据权利要求 2 所述的用途， 其特征在于 ： 所述临床耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的用途， 其特征在于 ： 所述药物是抗革兰氏阴性菌、 革兰氏 阳性菌的药物。 5. 根据权利要求 4 所述的用途， 其特征在于 ： 所述革兰氏阴性菌为支气管文血鲍特菌、 卡他莫拉菌、 铜绿假单胞菌、 肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌 ； 所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄 球菌、 巨型球菌、 腐生葡萄球菌、 粪肠球菌或表皮葡萄球菌。 6. 根据权利要求 1-5 任意一项所述的用途， 其特征在于 ： 所述药物是治疗细菌感染性 疾病的药物。。
4、 7. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于 ： 所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法 制备的 ： 取白及， 乙醇提取 ； 醇提液回收乙醇后的浸膏， 再按系统溶剂法提取， 取乙酸乙酯部分， 即得白及乙酸乙酯提取物。 8. 根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述乙醇浓度为 8095%V/V。 9. 根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述系统溶剂法中， 依次用石油醚、 乙酸 乙酯进行提取。 10. 根据权利要求 1-9 任意一项所述的用途， 其特征在于 ： 所述药物是以白及乙酸乙酯 提取物为活性成分制备而成的口服剂、 注射剂或外用制剂。 权 利 要 求 书 CN 1。
5、02988765 A 2 1/6 页 3 白及乙酸乙酯提取物的用途 技术领域 0001 本发明涉及白及乙酸乙酯提取物的新用途。 背景技术 0002 感染类疾病， 一直被视为极其凶险的疾病， 直至 Alexander Fleming 于 1928 年偶 然发现青霉素并用于临床后， 人类与感染性疾病的斗争才有了一个重大突破。然而随着抗 生素的广泛使用， 滥用抗生素的危害远远超出人们的想象 ： 英国的 Jevons 就首次发现了耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA),MRSA 从发现至今感染几乎遍及全球， 已成为院内感染的 重要病原菌之一。研究发现， MRSA 除对甲氧西林耐药外， 对其它所有与甲。
6、氧西林相同结构 的 - 内酰胺类和头孢类抗生素均耐药， MRSA 还可通过改变抗生素作用靶位， 产生修饰酶， 降低膜通透性产生大量 PABA 等不同机制， 对氨基糖苷类、 大环内酯类、 四环素类、 氟喹喏 酮类、 磺胺类、 利福平均产生不同程度的耐药， 即具有广谱耐药性， 而万古霉素成为了攻克 MRSA感染的最后一道防线。 由此可见， 细菌耐药性产生的速度远远超出了新药研发的速度， 如果继续发展， 终有一天会因为耐药性而导致现有所有抗生素无效， 人们生病可能 “无药可 救” 由此进入后抗生素时代。 0003 正当人类面对耐药菌和机体耐药性迅速发展的严峻现实而焦头烂额之时， 中医药 作为新的抗菌。
7、药物脱颖而出， 以其抗菌性强、 毒副作用小而受到广大患者的青睐。 0004 白及， 又名甘根、 白芨、 白根等， 为兰科植物白及 Bletilla striata（Thunb.） Reichb.f. 的干燥块茎， 主产于浙江、 贵州、 湖北、 四川、 湖南、 河南、 陕西等地。含有联苄类、 二氢菲类、 联菲类、 芘类等化合物。中医认为， 其性涩而收， 能入肺止血， 生肌治疮。研究表 明， 白及具有止血、 抗癌、 保护胃粘膜、 代血浆、 促进角质细胞游走的形成、 促进血管内皮细 胞黏附生长、 抗溃疡、 预防肠粘连、 促进伤口愈合、 免疫促进等药理作用。 临床可用于上呼吸 道等出血、 褥疮、 烧烫。
8、伤、 肿瘤、 肺结核、 痤疮、 百日咳等的治疗。 0005 经文献检索发现， 现药理研究主要集中在白及止血等效用上， 抑菌活性的研究国 内鲜有报道。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供白及乙酸乙酯提取物的新用途。 0007 本发明提供了白及乙酸乙酯提取物在制备抗菌药物中的用途。 0008 进一步地， 所述药物是抗临床耐药菌的药物。 0009 更进一步地， 所述临床耐药菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 0010 进一步地， 所述药物是抗革兰氏阴性菌、 革兰氏阳性菌的药物。 0011 更进一步地， 所述革兰氏阴性菌为支气管文血鲍特菌、 卡他莫拉菌、 铜绿假单胞 菌、 肺炎克雷伯菌或大肠埃希菌 。
9、； 所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌、 巨型球菌、 腐生葡 萄球菌、 粪肠球菌或表皮葡萄球菌。 0012 其中， 所述药物是治疗细菌感染性疾病的药物。 说 明 书 CN 102988765 A 3 2/6 页 4 0013 其中， 所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法制备的 ： 取白及， 乙醇提取 ； 醇提液 回收乙醇后的浸膏， 再按系统溶剂法提取， 取乙酸乙酯部分， 即得白及乙酸乙酯提取物。 0014 进一步地， 所述乙醇浓度为 8095%V/V。 0015 进一步地， 所述系统溶剂法中， 依次用石油醚、 乙酸乙酯进行提取。 0016 其中， 所述药物是以白及乙酸乙酯提取物为活性成分制备而成的。
10、口服剂、 注射剂 或外用制剂。 0017 白及乙酸乙酯提取物对各种革兰氏阴性菌、 阳性菌以及耐药菌均有良好的抑制作 用， 能够有效保护细菌感染个体， 其药效活性与抗生素相当， 尤其是该提取物还可以有效对 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌， 为临床用药提供了更好的选择。 具体实施方式 0018 本发明所述的白及乙酸乙酯提取物， 按照中药化学领域中常规的系统溶剂法提取 即可， 具体操作可以参见下述实施例制备方法。 除此之外， 也可以直接按照现有文献报道的 方法进行提取， 如陆波等， 白及不同提取部位对家兔血小板聚集的影响， 解放军药学学报， 2005 年 5 期。 0019 实施例 1 白及乙酸乙酯提取。
11、物的制备方法 0020 称取白及药材 250g， 粉碎， 加 95%v/v 乙醇加热回流提取两次， 第一次 10 倍量， 第 二次 8 倍量， 每次各 1 小时。将两次提取液合并， 过滤， 滤液减压回收溶剂， 得粗浸膏 31g。 取粗浸膏， 加水约 250ml， 超声混悬， 转移至 1000ml 分液漏斗中， 加石油醚萃取 8 次， 每次 300ml， 余下的水层再用乙酸乙酯萃取 10 次， 每次 250ml， 减压回收乙酸乙酯， 得乙酸乙酯提 取物 8g。 0021 实施例 2 白及乙酸乙酯提取物的制备方法 0022 称取白及药材500g， 粉碎， 加80%v/v乙醇加热回流提取两次， 第一。
12、次10倍量， 第二 次 8 倍量， 每次各 1 小时。将两次提取液合并， 过滤， 滤液减压回收溶剂， 得粗浸膏。取粗浸 膏， 干燥后， 加石油醚振摇提取5次， 余下的水层再用乙酸乙酯振摇提取5次， 合并乙酸乙酯 部位， 减压回收乙酸乙酯， 得乙酸乙酯提取物。 0023 实施例 3 白及乙酸乙酯提取物的制备方法 0024 称取白及药材100g， 粉碎， 加90%v/v乙醇加热回流提取两次， 第一次12倍量， 第二 次 10 倍量， 每次各 1 小时。将两次提取液合并， 过滤， 滤液减压回收溶剂， 得粗浸膏。取粗 浸膏， 干燥后， 加石油醚温浸 3 次， 余下的水层再用乙酸乙酯温浸 5 次， 合并。
13、乙酸乙酯部位， 减压回收乙酸乙酯， 得乙酸乙酯提取物。 0025 以下通过试验例说明本发明的有益效果。 0026 试验例 1 抗菌试验 0027 1 材料与仪器 0028 1.1 药物及制备 0029 供试药物， 白及， 购自北京同仁堂成都分店， 经成都中医药大学鉴定教研室马云桐 老师鉴定为兰科植物白及 Bletilla striata(Thund.)Reichb.f. 的干燥块茎。白及的四个 活性部位分别采取以下方法制备。 0030 阳性药物， 注射用盐酸万古霉素， 规格 ： 50 万单位， 浙江医药股份有限公司新昌制 说 明 书 CN 102988765 A 4 3/6 页 5 药厂， 批。
14、号 ： 111204 ； 注射用头孢噻肟钠， 规格 ： 1.0g， 华北制药河北华民药业有限责任公 司， 批号 ： XF3120707 ； 头孢克肟片， 规格 0.2g/ 片， 浙江海正药业有限公司， 批号 120501。 0031 造模药物 ： Mucin form Porcine Stomach(Type),规格 ： 100g， SIGMA-ALDRICH， 批号 ： 018K0079。 0032 1.1.1 乙酸乙酯部位的提取方法称取白及药材 250g， 粉碎， 加 95%v/v 乙醇加热回 流提取两次， 第一次 10 倍量， 第二次 8 倍量， 每次各 1 小时。将两次提取液合并， 过。
15、滤， 滤液 减压回收溶剂， 得粗浸膏 31g。剩余药渣备用。取粗浸膏， 加水约 250ml， 超声混悬， 转移至 1000ml 分液漏斗中， 加石油醚萃取 8 次， 每次 300ml， 减压回收石油醚。水层再用乙酸乙酯 萃取 10 次， 每次 250ml， 减压回收乙酸乙酯， 得乙酸乙酯部位 8g（即本发明白及乙酸乙酯提 取物） 。剩余水层备用。 0033 1.1.2 醇提后水煎液部位取 “1.1.1” 中剩余的药渣， 加 8 倍量的水 （约 2000ml） 煎 煮 1 小时， 用纱布过滤， 滤液加热至 60， 减压浓缩， 得醇提后水煎液部位 95g。 0034 1.1.3 正丁醇部位的提取方。
16、法取 “1.1.1” 中剩余的水层， 加入正丁醇萃取 10 次， 每 次 250ml， 减压回收正丁醇， 得正丁醇部位提取物 7g。剩余水层备用。 0035 1.1.4 萃取后水部位取 “1.1.3” 中剩余的水层液， 加热至 60， 减压浓缩， 得萃取 后水部位提取物 12g。 0036 1.2 菌株 0037 1.2.1 标准菌株大肠埃希菌 ATCC25922、 金黄色葡萄球菌 ATCC25923（四川抗菌素 工业研究所赠送） 。 0038 1.2.2 受试菌株经 VITEK-32、 VITEK-60 自动微生物鉴定分析仪进行鉴定， 再经 Biolog 细菌鉴定仪 （美国） 及 API20。
17、E、 20NE、 Staph 系列和常规方法重新鉴定的 10 个种属的 22 株临床分离病原菌。 0039 1.3 仪器及试剂 Mueller-Hinton agar(OXOID， 批号 ： 729683） ， 营养琼脂培养基 （杭州微生物试剂有限公司， 批号 ： 20100831-02） ， 一次性无菌培养皿 （江苏康健生物有限公 司） ， Mcfarland Standard（bioMeriux,Inc. 批号 ： 821772701） 等。 0040 2 方法 0041 2.1 体外抑菌活性试验采用琼脂平板二倍稀释法分别测定白及乙酸乙酯部位、 醇 提后水煎液部位、 萃取后水部位和正丁醇部。
18、位对 11 个种属 26 株病原菌和标准菌株的体外 抑菌活性。 0042 2.1.1 含药平板制备 4 个不同部位分别用蒸馏水或 DMSO 稀释液进行倍比稀释， 分 别稀释成 1 ： 1、 1 2、 1 4、 1 8、 1 16、 1 32、 1 64、 1 128， 1 256 共 9 个梯度。 在一次性无菌培养皿中分别加入上述不同浓度梯度的稀释药液 1ml 和 14ml 灭菌的 MH 培养 基， 充分混匀， 晾干备用。 0043 2.1.2 菌液配置 ： 将受试菌株和药敏质控菌株用无菌生理盐水调至菌液浓度 1.5106CFU/ml。 0044 2.1.3 最低抑菌浓度测定采用多点接种仪将实。
19、验菌株的菌液加入不同浓度梯度的 含药平板和阳性对照平板， 并以生理盐水代替菌液作阴性对照。 37恒温培养1824h， 观 察各菌株在含不同浓度梯度药物平板中的生长情况。 在阴、 阳性对照均成立的情况下， 以培 养皿中无细菌生长的最小质量浓度为试验部位对该菌的最低抑菌质量浓度 （MIC） 。 说 明 书 CN 102988765 A 5 4/6 页 6 0045 2.2 体内抗菌活性试验 0046 2.2.1 预试验 0047 实验菌株毒力的测定 ： 37恒温培养受试耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、 大肠埃希 菌至对数生长期， 用生理盐水稀释成不同浓度梯度的菌液。取不同浓度的菌液与 10% 胃膜 素等。
20、量混合， 按 0.5ml/20g 的菌液量腹腔注射小鼠， 并以 5% 胃膜素做对照。在对照小鼠不 死亡的前提下， 记录小鼠 14d 内的死亡率， 测定小鼠全部死亡的最低细菌量， 即该菌液的最 小致死量 （MLD） 。 0048 体内有效剂量的预试 ： 设置多个不同剂量组对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、 大肠 埃希菌所引起的感染模型小鼠进行腹腔注射， 每组 4 只， 1 次 /d， 并提前 2 天给药， 在第 3 天 给药后 0.5h 攻毒， 观察动物 14d 内的死亡情况， 确定正式试验给药剂量。 0049 2.2.2 体内抗菌活性 0050 取 18 22g SPF 级 KM 小鼠， 雌雄各半，。
21、 每组 10 只， 分为注射用盐酸万古霉素组， 注射用头孢噻肟钠组， 头孢克肟片组， 白及 1、 0.5、 0.25、 0.125g/kg 组， 生理盐水空白组， 模 型组， 胃膜素对照组。均提前 2 天给药， 1 次 /d， 在第 3 天给药后 0.5h 攻毒， 即选取含 5% 胃 膜素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、 大肠埃希菌菌液腹腔注射。其中以生理盐水代替药物 为模型组 ； 以既不给药也不攻毒为空白组 ； 以不给药只注射不含细菌的 5% 胃膜素为胃膜素 对照组。观察小鼠攻毒后 14d 内的存活情况， 统计其存活率。 0051 3 结果 0052 3.1 白及不同活性部位的体外抗菌活性采用琼。
22、脂平板二倍稀释法测定了白及 4 个 部位对 26 株临床分离病原菌和标准菌株的 MIC， 结果见表 1。 0053 表 1 ： 白及 4 个部位对受试菌株的体外抑菌活性 0054 0055 注 ：“” 表示白及提取部位在试验最大浓度时， 未表现出抑菌活性。 说 明 书 CN 102988765 A 6 5/6 页 7 0056 由表 1 可知， 白及对受试病原菌有抑菌活性。其中， 醇提后水煎液和萃取后水部 位在试验最大浓度时未表现出对受试菌株的抑菌活性， 而正丁醇部位和乙酸乙酯部位均表 现出较强的抑菌活性， 其中尤以乙酸乙酯部位的抑菌活性明显， 对受试菌株的最小 MIC 为 65g/ml。正丁。
23、醇部位除对 1 株支气管文血鲍特菌未表现出抑菌活性外， 对其他受试菌株 均表现出较强的抑菌活性， 对受试菌株的最小MIC为16.667mg/ml。 乙酸乙酯部位对所有受 试菌株均表现出很强的抑菌活性， 有广谱抑菌活性， 且对 “超级耐药菌”耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌亦有很好的抑菌活性。 0057 3.2 白及乙酸乙酯部位的体内抗菌活性 0058 表 2 白及乙酸乙酯部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的体内保护 0059 0060 ip ： 注射给药 ； ig ： 口服给药。 0061 由表 2 可知， 白及乙酸乙酯部位对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染小鼠有很强的 保护作用， 其中尤以腹腔。
24、注射 0.5g/kg 的保护力强， 对小鼠的保护力达到了 100%， 腹腔注 射 0.25、 0.125g/kg 对小鼠的保护力亦达到 90%、 40% ； 灌胃 1、 0.5g/kg 对小鼠的保护力达到 50%、 40%。 0062 表 3 白及乙酸乙酯部位对大肠埃希菌感染模型小鼠的体内保护 0063 说 明 书 CN 102988765 A 7 6/6 页 8 0064 由表 3 可知， 白及乙酸乙酯部位对大肠埃希菌感染小鼠有很强的保护作用， 其中 尤以腹腔注射 0.5、 0.25g/kg 的保护力强， 保护力达到 80% ； 灌胃 1g/kg 对感染小鼠的保护 力达到 50%。 0065 4 结论 0066 白及在体外有广谱抑菌活性， 对革兰阴性、 阳性菌均有很好的抑菌活性， 且对 “超 级耐药菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也有很强的抑菌活性 ； 对白及不同部位的抑菌 活性进行比较研究发现， 其中尤以乙酸乙酯部位的抑菌活性最为明显， 表明乙酸乙酯部位 是其主要的活性部位。 0067 白及在体内亦有很强的抑菌活性， 该实验选择革兰阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌、 革兰阴性菌大肠埃希菌为试验菌株， 实验结果表明白及在体内亦有很强的抑菌活性。 说 明 书 CN 102988765 A 8 。