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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410316100.5 (22)申请日 2014.07.04 (73)专利权人 中国水产科学研究院淡水渔业研 究中心 地址 214081 江苏省无锡市山水东路9号 (72)发明人 金武 顾若波 闻海波 杜兴伟 郑金良 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 曹翠珍 (51)Int.Cl. A01K 61/00(2006.01) 审查员 张团委 (54)发明名称 一种暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法 (57)摘要 本发明公开了一种暗纹东方。
2、鲀活体提取皮 肤组织的方法， 首先将活体暗纹东方鲀一侧的表 皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小口中 向四周剪取皮肤组织， 然后用浓度为8-12:2000 （w/v） 的金霉素溶液进行伤口涂抹处理， 待金霉 素溶液颜色明显变淡时将鱼养在盐水中， 饲养第 3天后， 采用同浓度的金霉素溶液再次对鱼体浸 泡， 待金霉素溶液颜色明显变淡时将鱼取出， 再 在相同浓度盐水中饲养。 本发明方法操作简便、 经济实用， 能够做到暗纹东方鲀非致命性获得体 色差异皮肤组织， 在获得用于研究的样品同时保 存珍贵的遗传材料。 权利要求书1页 说明书3页 CN 104082210 B 2016.08.31 CN 1。
3、04082210 B 1.一种暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 其特征在于， 首先将活体暗纹东方鲀一 侧的表皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小口中向四周剪取皮肤组织， 然后用质量体 积比为8-12:2000的金霉素溶液进行伤口涂抹处理， 待金霉素溶液颜色明显变淡时将鱼养 在盐水中， 饲养第3天后， 采用同浓度的金霉素溶液再次对鱼体浸泡， 待金霉素溶液颜色明 显变淡时将鱼取出， 再在相同浓度盐水中饲养。 2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 其特征在于， 剪取皮肤 组织时， 尽量保留尽可能多的皮肤下方结缔组织， 同时要避开肌肉层中的血管。 3.根据权利要求1所述的。
4、暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 其特征在于， 剪取皮肤 组织的面积不超过本侧皮肤表面积的三分之一。 4.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 其特征在于， 所述盐水 质量体积比为68。 5.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 其特征在于， 所述活体 暗纹东方鲀个体为体重0.8kg1.5kg的成鱼。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104082210 B 2 一种暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 具体而言是提取暗纹东方 鲀皮肤组织以及术后处理的方法， 属于水产养殖技术领域。 。
5、背景技术 0002 在已有技术中， 进行组织提取的方法一般都需要采取将鱼杀死， 然后剪取特定部 位的组织。 但是， 由于暗纹东方鲀种质资源很宝贵， 尤其是研究一些体色突变体使需要保有 尽可能多的群体。 在此之前， 暗纹东方鲀组织提取多采用的传统方法， 鱼死亡后， 遗传材料 就消失了。 对体色突变体的研究只能限于已有的遗传材料， 限制了后续研究的跟进。 暗纹东 方鲀剪取皮肤后， 存活率情况不太明晰。 一般认为， 剪取皮肤后， 可能会导致感染引发死亡。 因此需要一种在活体提取组织后还能够保持暗纹东方鲀很好存活率的处理方法， 来保证遗 传材料的延续性。 发明内容 0003 本发明的目的在于为了克服以。
6、上现有技术的不足， 而提供一种暗纹东方鲀活体提 取皮肤组织的方法。 0004 本发明是通过以下技术手段实现的： 0005 一种暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 首先将活体暗纹东方鲀一侧的表皮向 外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小口中向四周剪取皮肤组织， 然后用质量体积比为8- 12:2000的金霉素溶液进行伤口涂抹处理， 待金霉素溶液颜色明显变淡时将鱼养在盐水中， 饲养第3天后， 采用质量浓度为8-12:2000的金霉素溶液再次对鱼体浸泡， 待金霉素溶液颜 色明显变淡时将鱼取出， 再在相同浓度盐水中饲养。 0006 所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 剪取皮肤组织时， 尽量保留尽可。
7、能 多的皮肤下方结缔组织， 同时要避开肌肉层中的血管。 0007 所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 剪取皮肤组织的面积不超过本侧皮 肤表面积的三分之一。 0008 所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 所述盐水质量体积比可以为6 8。 0009 所述的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法， 所述活体暗纹东方鲀个体可以为体 重0.8kg1.5kg的成鱼。 0010 本发明采用了质量体积比为8-12:2000的金霉素溶液作为创口的抗菌处理剂， 可 以对暗纹东方鲀的创口进行有效的抗菌保护， 同时采用质量体积比为68的盐水进行培 养， 能够加快皮肤组织的重生， 加快伤口愈合。 0011 本发明。
8、提供的暗纹东方鲀活体提取皮肤组织的方法经实施验证能够达到100%的 组织提取后存活率， 既能满足组织提取的要求， 又能保有宝贵的体色突变体遗传材料， 对暗 纹东方鲀养殖过程影响小， 并保有较高数目的体色突变体群体。 说 明 书 1/3 页 3 CN 104082210 B 3 0012 具体实施方式： 0013 下面结合实施例对本发明进一步说明， 但不构成对本发明的限制。 0014 实施例1 0015 首先用镊子将暗纹东方鲀一侧面的表皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小 口中向四周剪取约四分之一本侧面表皮的面积。 剪取不同体色皮肤组织时， 要尽量保留尽 可能多的皮肤下方结缔组织， 利于伤。
9、口愈合。 剪取皮肤组织时， 要避开肌肉层中的血管， 尤 其是鳍条基部的血管， 防止大出血。 组织剪取后， 用浓度8:2000 （w/v） 的金霉素溶液对伤口 进行涂抹处理， 防止感染。 待金霉素溶液颜色变淡后， 即可将手术后的暗纹东方鲀放入盐水 中， 暂养盐水浓度为6 （w/v） 。 暂养盐水中后第3天， 采用同样浓度 （8:2000 ， w/v） 的金霉素 溶液再次对鱼体浸泡， 浸泡后待金霉素溶液颜色变淡后再将鱼转入同样浓度的盐水中培 养， 被剪取皮肤暗纹东方鲀个体为体重约0.8kg的成鱼， 利于提高术后个体成活率。 术后约6 天， 在伤口处逐渐开始重新长出新的皮肤组织。 以上对30尾体重约。
10、0.8kg的暗纹东方鲀进行 以上活体组织提取试验， 存活率达到100%。 0016 实施例2 0017 首先用镊子将暗纹东方鲀一侧面的表皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小 口中向四周剪取约五分之一本侧面表皮的面积。 剪取不同体色皮肤组织时， 要尽量保留尽 可能多的皮肤下方结缔组织， 利于伤口愈合。 剪取皮肤组织时， 要避开肌肉层中的血管， 尤 其是鳍条基部的血管， 防止大出血。 组织剪取后， 用浓度9:2000 （w/v） 的金霉素溶液对伤口 进行涂抹处理， 防止感染。 待金霉素溶液颜色变淡后， 即可将手术后的暗纹东方鲀放入盐水 中， 暂养盐水浓度为7 （w/v） 。 暂养盐水中后第3。
11、天， 采用同样浓度 （9:2000 ， w/v） 的金霉素 溶液再次对鱼体浸泡， 浸泡后待金霉素溶液颜色变淡后再将鱼转入同样浓度的盐水中培 养。 被剪取皮肤暗纹东方鲀个体为体重约1.2kg的成鱼， 利于提高术后个体成活率。 术后约5 天， 在伤口处逐渐开始重新长出新的皮肤组织。 以上对30尾体重约1.2kg的暗纹东方鲀进行 以上活体组织提取试验， 存活率达到100%。 0018 实施例3 0019 首先用镊子将暗纹东方鲀一侧面的表皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小 口中向四周剪取约四分之一本侧面表皮的面积。 剪取不同体色皮肤组织时， 要尽量保留尽 可能多的皮肤下方结缔组织， 利于伤口愈。
12、合。 剪取皮肤组织时， 要避开肌肉层中的血管， 尤 其是鳍条基部的血管， 防止大出血。 组织剪取后， 用浓度10:2000 （w/v） 的金霉素溶液对伤口 进行涂抹处理， 防止感染。 待金霉素溶液颜色变淡后， 即可将手术后的暗纹东方鲀放入盐水 中， 暂养盐水浓度为8 （w/v） 。 暂养盐水中后第3天， 采用同样浓度 （10:2000 ， w/v） 的金霉 素溶液再次对鱼体浸泡， 浸泡后待金霉素溶液颜色变淡后再将鱼转入同样浓度的盐水中培 养。 被剪取皮肤暗纹东方鲀个体为体重约1.5kg的成鱼， 利于提高术后个体成活率。 术后约7 天， 在伤口处逐渐开始重新长出新的皮肤组织。 以上对30尾体重约。
13、1.5kg的暗纹东方鲀进行 以上活体组织提取试验， 存活率达到100%。 0020 实施例4 0021 首先用镊子将暗纹东方鲀一侧面的表皮向外提起， 用手术剪剪开一个小口， 从小 口中向四周剪取约三分之一本侧面表皮的面积。 剪取不同体色皮肤组织时， 要尽量保留尽 可能多的皮肤下方结缔组织， 利于伤口愈合。 剪取皮肤组织时， 要避开肌肉层中的血管， 尤 说 明 书 2/3 页 4 CN 104082210 B 4 其是鳍条基部的血管， 防止大出血。 组织剪取后， 用浓度12:2000 （w/v） 的金霉素溶液对伤口 进行涂抹处理， 防止感染。 待金霉素溶液颜色变淡后， 即可将手术后的暗纹东方鲀放。
14、入盐水 中， 暂养盐水浓度为8 （w/v） 。 暂养盐水中后第3天， 采用同样浓度 （12:2000 ， w/v） 的金霉 素溶液再次对鱼体浸泡， 浸泡后待金霉素溶液颜色变淡后再将鱼转入同样浓度的盐水中培 养。 被剪取皮肤暗纹东方鲀个体为体重约1.5kg的成鱼， 利于提高术后个体成活率。 术后约7 天， 在伤口处逐渐开始重新长出新的皮肤组织。 以上对30尾体重约1.5kg的暗纹东方鲀进行 以上活体组织提取试验， 存活率达到100%。 0022 对比例1 0023 按照实施例3进行组织提取， 剪取约二分之一的表皮面积， 其他处理与实施例3相 同， 对30尾暗纹东方鲀进行以上活体组织提取试验， 培。
15、养到最后死亡12条， 存活率为60%； 在 组织提取后， 每天对鱼的康复情况进行观察， 得到最终死亡的鱼都是因为组织剪取范围较 大， 影响了鱼的正常生理状况， 剪取组织后第2天鱼就开始死亡。 因此说明组织提取不能超 过三分之一。 0024 对比例2 0025 按照实施例3进行组织提取， 分别将金霉素溶液浓度换为6:2000 （w/v） 和13:2000 （w/v） ,其他处理与实施例3相同， 分别对30尾暗纹东方鲀进行以上活体组织提取试验， 培养 到最后分别死亡7条和5条， 存活率分别为77%和83%； 在以上试验进行过程中， 在组织提取 后， 每天对鱼的康复情况进行观察， 得到最终死亡的鱼分。
16、别在使用浓度为6:2000 （w/v） 的金 霉素溶液二次浸泡前1-2天与使用浓度为13:2000 （w/v） 的金霉素溶液二次浸泡后2-3天时 鱼伤口出现了感染， 最终导致死亡。 由以上试验现象可以得出， 金霉素溶液的浓度对鱼伤口 的抗感染性有着比较苛刻的要求， 金霉素溶液浓度低时不能完全杀死伤口处的细菌， 而金 霉素浓度高时， 可能会由于高浓度使部分细菌产生耐药性， 在一定时间后细菌会恢复活性， 从而使得鱼再次被感染。 0026 对比例3 0027 按照实施例3进行组织提取， 分别盐水质量体积浓度 （g/ml） 调整为5和10,其 他处理与实施例3相同， 分别对30尾暗纹东方鲀进行以上活体。
17、组织提取试验， 培养到最后分 别死亡4条和5条， 存活率分别为87%和83%； 在以上试验进行过程中， 在组织提取后， 每天对 鱼的康复情况进行观察， 得出最终导致死亡的鱼在处理伤口后培养一周左右， 均没有完全 长出新的皮肤组织， 在培养到10天左右时伤口愈合仍不完全， 最终导致死亡。 分析原因可能 由于培养用盐水的浓度对于暗纹东方鲀鱼自身的应激系统功能的激发和调动有着重要的 影响， 盐水浓度高或者低都不利于鱼自身应激系统的激发从而起到迅速增殖细胞来修复自 身损伤的作用， 因此为了保证在组织提取后暗纹东方鲀能够迅速激发自身应激系统从而迅 速修复自身损伤， 需要选择上述实施例中的盐水浓度。 0028 从以上实施例与对比例可以看出， 要使暗纹东方鲀在活体组织提取后还能够保证 很好的存活率， 必须对试验条件进行严格的控制， 而本发明提供的暗纹东方鲀活体提取皮 肤组织的方法经实施验证能够达到100%的组织提取后存活率； 可以很好地保证活体提取后 遗传资源的延续性。 说 明 书 3/3 页 5 CN 104082210 B 5 。