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1、10申请公布号CN104206382A43申请公布日20141217CN104206382A21申请号201410397527222申请日20140813A01N43/22200601A01P21/00200601C07D493/2020060171申请人中国科学院大学地址100049北京市石景山区玉泉路19号（甲）72发明人王红池剑亭申亚琳74专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245代理人关畅任凤华54发明名称油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用57摘要本发明公开了油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用。本发明所提供的应用，为A1、A2或A3的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用；所述A。
2、1的物质为油菜素内酯；所述A2的物质为油菜素内酯类似物；所述A3的物质为以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质。实验证明，对黄花蒿施用油菜素内酯可以提高黄花蒿中青蒿素的含量。该方法不需要基因工程方法所要求的较高的前期投入，可以有效降低青蒿素的生产成本并提高黄花蒿中青蒿素的产量。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104206382ACN104206382A1/1页21A1、A2或A3的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用；所述A1的物质为油菜素内酯；所述A2的物质为油菜素内酯类似物；。
3、所述A3的物质为以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质。2根据权利要求1所述的应用，其特征于所述提高黄花蒿中青蒿素含量，包括对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或所述以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液的步骤。3根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5M200M。4根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为10M100M。5根据权利要求2或3或4所述的应用，其特征在于所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为80M。6根据权利要求25中任一所述的应用，其特征在于施用所述油菜素内。
4、酯的溶液的时间是在采收前410天。7根据权利要求26中任一所述的应用，其特征在于施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基中添加这三种中的任一种、任两种或三种。8生产黄花蒿叶的方法，包括在采收黄花蒿叶前，对所述黄花蒿施用油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液。9根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5M200M。10制备青蒿素的方法，包括从按照权利要求8或9所述方法生产的黄花蒿叶中提取青蒿素。权利要求书CN104206382A1/5页3油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用技术领域0001。
5、本发明涉及生物技术领域中油菜素内酯在提高青蒿素含量中的应用。背景技术0002黄花蒿ARTEMISIAANNUAL是一种传统的药用植物。黄花蒿又名香蒿、苦蒿、蒿枝。20世纪70年代，我国科学家首次从黄花蒿中分离到具有抗疟活性的无色针状晶体化合物，命名为青蒿素ARTEMISININ，并最终确定其结构为一种具有内部过氧桥的倍半萜内酯。后来的研究表明，由于分子内部“过氧桥”的存在，青蒿素及其衍生物对脑型疟疾、抗氯喹恶性疟疾具有很好的疗效，被世界卫生组织认为是最有潜力的抗疟药物。在2002年非洲“疟疾日”上，世界卫生组织官员指出基于青蒿素的综合治疗ARTEMISININBASEDCOMBINATIONT。
6、HERAPIES,ACTS能够降低疟疾发生的频率以及降低疟原虫抗性的产生和蔓延，是目前最有效和最值得推广的治疗方法，为了控制疟疾的蔓延，今后要推行“基于青蒿素的综合治疗”。越来越多的国家将ACTS作为疟疾治疗的首选策略，增加了青蒿素的市场需求量。此外，有研究表明，青蒿素对白血病、乳腺癌等一系列癌细胞具有很好的抑制作用。0003目前世界上青蒿素类药物的生产主要是从黄花蒿中直接提取，而黄花蒿中青蒿素的含量一般较低约占干重的00108，且提取环节多、费时费力，使青蒿素的生产成本高、产量低，难以满足市场需求，所以如何提高黄花蒿中青蒿素的含量成为提高青蒿素产量的关键。发明内容0004本发明所要解决的一个。
7、技术问题是如何提高黄花蒿ARTEMISIAANNUAL中青蒿素的含量。0005为解决上述技术问题，本发明提供了A1、A2或A3的物质在提高黄花蒿中青蒿素含量中的应用；0006所述A1的物质为油菜素内酯；0007所述A2的物质为油菜素内酯类似物；0008所述A3的物质为以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质。0009上述应用中，所述提高黄花蒿中青蒿素含量可为提高黄花蒿叶中青蒿素含量。0010上述应用中，所述提高黄花蒿中青蒿素含量，包括对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或所述以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液的步骤。0011上述应用中，所述油菜素内酯。
8、的溶液中油菜素内酯的浓度为5M200M，所述5M200M具体可为10M100M；所述10M100M具体可为80M。0012上述应用中，施用所述油菜素内酯的溶液的时间是在采收前410天，如4天或10天。施用所述油菜素内酯的溶液的方法为每天施用1次，直至采收。0013上述应用中，施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基说明书CN104206382A2/5页4中添加这三种中的任一种、任两种或三种。0014本发明所要解决的另一个技术问题是如何获得青蒿素含量高的黄花蒿ARTEMISIAANNUAL叶。0015为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产黄花蒿叶的方法。0016本发明所提供的。
9、生产黄花蒿叶的方法，包括在采收黄花蒿叶前，对所述黄花蒿施用所述油菜素内酯的溶液、所述油菜素内酯类似物的溶液或所述以所述油菜素内酯或其类似物为活性成分的物质的溶液。0017上述生产黄花蒿叶的方法中，所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5M200M，所述5M200M具体可为10M100M；所述10M100M具体可为80M。0018上述生产黄花蒿叶的方法中，施用所述油菜素内酯的溶液的时间是在采收前410天，如4天或10天。施用所述油菜素内酯的溶液的方法为每天施用1次，直至采收。0019上述生产黄花蒿叶的方法中，施用所述油菜素内酯的溶液的方式为叶面喷施、土壤浇灌和培养基中添加这三种中的任一种、任两。
10、种或三种。0020上述生产黄花蒿叶的方法中，所述油菜素内酯的溶液中油菜素内酯的浓度为5M200M，所述5M200M具体可为10M100M；所述10M100M具体可为80M。0021本发明所要解决的再一个技术问题是如何降低制备青蒿素的成本。0022为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备青蒿素的方法。0023本发明所提供的制备青蒿素的方法，包括从上述生产黄花蒿叶的方法中生产的黄花蒿叶中提取青蒿素。0024上述制备青蒿素的方法中，提取青蒿素的方法可采用现有的从黄花蒿叶中提取青蒿素的方法。0025上述制备青蒿素的方法还包括纯化青蒿素的步骤；所述纯化青蒿素可按照现有的方法进行。0026本申请的油菜素内。
11、酯处理黄花蒿后可以明显增加黄花蒿中青蒿素的含量黄花蒿叶经2体积百分比乙醇水溶液处理CK后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为129010MG/G干燥叶，黄花蒿叶经5M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为243038MG/G干燥叶，黄花蒿叶经10M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的平均为245048MG/G干燥叶，黄花蒿叶经80M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为326028MG/G干燥叶，黄花蒿叶经100M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为288007MG/G干燥叶，黄花蒿叶经200M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶中青蒿素的含量为211090MG/G干燥叶。其中，经80M的。
12、油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量最高，为喷施2体积百分比乙醇水溶液CK的黄花蒿中青蒿素含量的253倍。0027本申请的实验证明，油菜素内酯在提高黄花蒿中青蒿素的含量作用显著，因此在田间生产过程中可以施用油菜素内酯来提高黄花蒿中青蒿素的含量。该方法工艺简单，可以有效降低青蒿素的生产成本并提高黄花蒿中青蒿素的含量，对青蒿素大规模生产具有重要意义。说明书CN104206382A3/5页5附图说明0028图1为不同浓度油菜素内酯处理黄花蒿叶片后黄花蒿叶片中青蒿素含量的变化。其中，DW表示叶片干重，CK表示2体积百分比乙醇水溶液。0029图2为青蒿素标准品和样品的HPLC图。其中A为青蒿素标准品的H。
13、PLC图，B为样品的HPLC图。0030图3为80M油菜素内酯处理黄花蒿叶片后第4天叶片中青蒿素的含量。其中，DW表示叶片干重，未处理表示未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，处理表示经80M油菜素内酯处理的黄花蒿叶片。具体实施方式0031下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。0032下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。0033下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0034下述实施例中的油菜素内酯为INALCO公司产品。0035下述实施例中的各浓度的油菜素内酯溶液均是将油菜素内酯先用无水。
14、乙醇溶解，再用蒸馏水配制成所需要浓度的溶液。各浓度的油菜素内酯溶液中，乙醇的浓度均为2。0036下述实施例中的黄花蒿ARTEMISIAANNUAL均为黄花蒿株系001HIGHEFCIENCYOFGENETICTRANSFORMATIONANDREGENERATIONOFARTEMISIAANNUALVIAAGROBACTERIUMTUMEFACIENSMEDIATEDPROCEDURE，JUNLIHAN,HONGWANG,HECHUNYE,YANLIU,ZHENQIULI,YIZHANG,YANSHENGZHANG,FANGYAN,GUOFENGLI，PLANTSCIENCE,16820057。
15、380公众可从中国科学院大学即申请人获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。0037实施例1、不同浓度油菜素内酯对黄花蒿中青蒿素合成的影响0038实验重复三次，每次重复实验的方法如下00391、用油菜素内酯处理黄花蒿植株0040将黄花蒿ARTEMISIAANNUAL种子依次按照下述步骤进行消毒用70体积百分比乙醇水溶液清洗2MIN；5质量百分比次氯酸钠水溶液消毒1015MIN；无菌水冲洗，得到无菌黄花蒿种子。将无菌黄花蒿种子播种在MS培养基中，于温度为25、光照强度为3000LX、光照周期为16H白天/8H黑夜的条件下进行培养，两周后得到黄花蒿幼苗。将黄花蒿幼苗转到。
16、含有草木灰和蛭石草木灰和蛭石的体积比为11的基质中，于温度为25、光照强度为3000LX、光照周期为16H白天/8H黑夜的条件下培养5周，得到生长状态均一的黄花蒿植株，该黄花蒿植株未出现花蕾。0041用浓度分别为5M、10M、80M、100M、200M的油菜素内酯溶液和2体积百分比乙醇水溶液作为对照，CK分别对黄花蒿植株叶面进行喷施，每天喷施一次，每次喷施后于温度为25、光照强度为3000LX、光照周期为16H白天/8H黑夜的条件下培养，共培养10天，分别得到5M黄花蒿植株、10M黄花蒿植株、80M黄花蒿植株、100M黄花蒿植株、200M黄花蒿植株、CK黄花蒿植株。每种溶液为一个处理，每个处理。
17、喷施六株黄说明书CN104206382A4/5页6花蒿植株。00422、青蒿素含量的检测0043分别将5M黄花蒿植株、10M黄花蒿植株、80M黄花蒿植株、100M黄花蒿植株、200M黄花蒿植株、CK黄花蒿植株的叶片于45烘箱中烘干至恒重，分别得到5M干燥叶片、10M干燥叶片、80M干燥叶片、100M干燥叶片、200M干燥叶片、CK干燥叶片。将5M干燥叶片、10M干燥叶片、80M干燥叶片、100M干燥叶片、200M干燥叶片、CK干燥叶片分别研成粉末，分别得到六种干燥叶片的粉末。分别称取上述六种干燥叶片的粉末各100MG，各加入40ML石油醚沸点3060并于室温下浸提过夜，分别得到5M粗提液、10。
18、M粗提液、80M粗提液、100M粗提液、200M粗提液、CK粗提液。将上述六种粗提液于室温下超声处理24MIN，并于旋转蒸发仪中蒸干石油醚，分别得到5M提取物、10M提取物、80M提取物、100M提取物、200M提取物、CK提取物。分别用10ML甲醇溶解上述六种提取物，并于12000RPM离心5MIN，弃沉淀，分别得到5M精提液、10M精提液、80M精提液、100M精提液、200M精提液、CK精提液。0044分别向上述六种精提液中各加入4ML02质量百分比的NAOH，分别混匀后并分别于50下水浴30MIN，并将其分别冷却至室温后，分别加入5ML005M醋酸水溶液，将其分别混匀后，经045M的N。
19、C膜过滤，分别得到5M待测液、10M待测液、80M待测液、100M待测液、200M待测液、CK待测液。将上述六种待测液分别上柱进行HPLC分析。0045HPLCAGILENT1260INNITY液相色谱仪检测条件为39150MMC18反相柱，流动相为溶液A溶液A由001MPH70磷酸钠缓冲液与甲醇按照5050的体积比混合而成，流速为1ML/MIN，UV检测波长为260NM,上柱体积为20L。0046HPLC分析中，使用AGILENTMASSHUNTER对色谱峰进行积分，以青蒿素纯度为98，购自SIGMA公司，货号为361953为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法外标法进行定量分析。
20、上述六种待测液的青蒿素含量。上述六种待测液的青蒿素含量见图1。标准品和样品的HPLC分别如图2中A和B所示，标准品青蒿素在该色谱条件下的保留时间为4分钟；样品在该色谱条件下含有保留时间为4分钟的青蒿素的层析峰。0047结果显示，黄花蒿植株叶经5M的油菜素内酯溶液处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为243038MG/G干燥叶，黄花蒿植株叶经10M的油菜素内酯溶液处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为245048MG/G干燥叶，黄花蒿植株叶经80M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为326028MG/G干燥叶，黄花蒿植株叶经100M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为288007MG。
21、/G干燥叶，黄花蒿植株叶经200M的油菜素内酯处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为211090MG/G干燥叶，黄花蒿植株叶经2体积百分比乙醇水溶液CK处理后，黄花蒿叶片中青蒿素的含量为129010MG/G干燥叶。结果表明，与喷施2体积百分比乙醇水溶液CK的黄花蒿相比，黄花蒿植株经不同浓度的油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量均增加，其中，经80M的油菜素内酯处理后黄花蒿中青蒿素的含量最高，为喷施2体积百分比乙醇水溶液CK的黄花蒿中青蒿素含量的253倍。油菜素内酯处理黄花蒿可以明显增加黄花蒿中青蒿素的含量，其中80M的油菜素内酯溶液中油菜素内酯的浓度为80M时为处理黄花蒿的最佳浓度。说明书CN10。
22、4206382A5/5页70048实施例2、油菜素内酯处理时间对黄花蒿中青蒿素合成的影响0049实验重复三次，每次重复实验的方法如下0050用浓度为80M的油菜素内酯INALCO公司产品溶液对实施例1中步骤1中的黄花蒿植株的叶面进行喷施，每天喷施一次，每次喷施后于温度为25、光照强度为3000LX、光照周期为16H白天/8H黑夜的条件下培养，以喷施2体积百分比乙醇水溶液CK的黄花蒿植株作为未经油菜素内酯处理的对照。培养期间，在第4天采集经过80M油菜素内酯处理和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，分别得到经过油菜素内酯处理的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片。0051按照实施例1中步骤2的。
23、方法，将5M黄花蒿植株、10M黄花蒿植株、80M黄花蒿植株、100M黄花蒿植株、200M黄花蒿植株、CK黄花蒿植株的叶片替换为上述经过油菜素内酯处理的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片，其余步骤不变，测定经过80M油菜素内酯处理4天的黄花蒿叶片和未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量，结果见图3。0052结果表明，经80M油菜素内酯处理后第4天的黄花蒿叶片中青蒿素的含量为382032MG/G干燥叶，未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量为168030MG/G干燥叶，与未经油菜素内酯处理的黄花蒿叶片中青蒿素的含量相比，经80M油菜素内酯处理后第4天的黄花蒿叶片中青蒿素的含量提高了127倍。说明书CN104206382A1/2页8图1图2说明书附图CN104206382A2/2页9图3说明书附图CN104206382A。