酸枣仁汤多糖提取物、制备方法及其应用.pdf

本发明属于中药制药领域，具体涉及一种酸枣仁汤多糖提取物、制备方法及在制备镇静、催眠药物中的应用，该工艺简单、成本低廉、适于工业化制备，可用于分离纯化酸枣仁汤多糖，为酸枣仁镇静催眠药物研发奠定基础。

1.  一种具有镇静、催眠活性的酸枣仁汤多糖提取物，该提取物分子量小于50kD。

2.  制备如权利要求１所述的提取物的方法，其步骤如下：
（1）称取酸枣仁汤各组成药味； 
（2）用4-40倍50-95%乙醇回流提取，弃去乙醇液； 
（3）残渣经干燥处理，加5-10倍量水浸提两次(50～70℃)，每次0.5-2h； 
（4）提取液静置过夜后将上清液离心，上清液用截留分子量为50kDa的超滤膜进行超滤处理，得到酸枣仁汤多糖超滤液；
（5）向多糖超滤液中加入60-90％乙醇，冷藏过夜，离心，沉淀干燥或冻干后，即得。

3.  如权利要求１所述的多糖提取物在制备镇静、催眠药物中的应用。

酸枣仁汤多糖提取物、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于中药制药领域，具体涉及一种酸枣仁汤多糖提取物制备方法及其在镇静、催眠药物中的应用，该工艺简单、成本低廉、适于工业化制备。 
背景技术
酸枣仁汤出自《金匮要略》、《中国药典》2010年版二部附录，其由炒酸枣仁(54g)、茯苓(18g)、川芎(18g)、知母(18g)、甘草(9g)五味中药组成。方中酸枣仁养肝血安心神为君药；川芎调血养肝、茯苓宁心安神为臣药；知母滋阴降火、清热除烦为佐药；甘草和中缓肝为使药。本方临床主治肝血不足，虚火内扰心神所致的心烦失眠等症。目前已有文献报道酸枣仁汤中的黄酮、皂苷、油脂和生物碱可能具有镇静催眠活性，但对酸枣仁汤中的多糖类的镇静催眠研究虽有报道，但并未对其活性多糖的分子量范围进行研究。 
多糖的生物活性与其分子量密切相关，已有文献报道不同分子量的多糖具有不同的生物活性，但具有镇静催眠作用的活性多糖的分子量范围还有待研究。 
目前多糖提取方法还比较落后，主要采用传统的水提醇沉法，由于多糖与色素结合紧密，并含有少量黏性物质，因此在提取分离过程中使成本增加，不易产业化。膜法作为一种新型的分离技术，不但具有能耗低、单级分离效果高、工艺简单，可在室温或低温下操作，而且用于中药分离、纯化时所得制品收率高、纯度好。 
因此本发明首先确定具有镇静催眠活性的酸枣仁汤多糖的分子量范围，针对目前多糖常规提取分离方法的缺点，建立一种简便高效的酸枣仁汤多糖的制备方法。 
发明内容
本发明提供了一种酸枣仁汤多糖提取物，该提取物中多糖分子量小于50kDa，具有良好的镇静、催眠活性。 
本发明还提供了制备上述酸枣仁汤多糖提取物的方法，其步骤如下： 
(1)称取酸枣仁汤各组成药味。 
(2)用4-40倍量，体积浓度为50-95％乙醇回流提取，弃去乙醇液。 
(3)残渣经干燥处理，加5-10倍量水浸提两次(50～70℃)，每次0.5-2h。 
(4)提取液静置过夜后将上清液离心，上清液用截留分子量为50kDa的超滤膜进行超滤处理，得到酸枣仁汤多糖超滤液。 
(5)向多糖超滤液中加入体积浓度为60-90％乙醇，冷藏过夜，离心，沉淀干燥或冻干后，即得。 
本发明还首次将HPLC-ELSD方法应用于酸枣仁汤中多糖的含量测定。采用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇-水(5:95)为流动相，ELSD检测；将酸枣仁汤多糖提取物溶于水，水解后作为供试品溶液，由线性方程求出样品液中葡萄糖的浓度，再按下式：多糖含量％＝f×(C×D)/W，[f为1.032，W为多糖提取物的重量(μg)，C为多糖中葡萄糖浓度(μg·mL-1)，D为稀释体积(mL)] 计算样品中多糖含量。 
本发明以小鼠自主活动次数、阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠只数和阈上剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间为药理指标，确定了酸枣仁汤中具有镇静催眠作用多糖分子量范围为小于50kDa。 
具体实施方式
实施例1：精密称取酸枣仁汤各组成药味，即酸枣仁(54g)、茯苓(18g)、川芎(18g)、知母(18g)、甘草(9g)，置100ml圆底烧瓶中，置索氏提取器用10倍石油醚(60～65℃)脱脂4h，残渣取出，干燥、研碎、过40目筛后，用25倍70％的乙醇回流提取3h除去皂苷、黄酮等杂质，残渣再经过干燥等处理，分别加10倍，8倍体积水浸提两次(60～65℃)，每次1h。提取液静置过夜后将上清液离心，上清液依次用50，10kDa的超滤膜进行超滤处理。超滤温度20～60℃，操作压力0.02～0.2MPa，pH1～13，料液浓度为原始提取液浓度，所得截留液分别收集，浓缩至一定浓度，得到不同分子量范围的酸枣仁汤多糖原液。抽滤，溶液经旋转蒸发器浓缩(60～65℃)后，加80％乙醇醇沉得到絮状沉淀，4℃冷藏过夜，3000r/min离心10min得到沉淀，室温下干燥后溶于水再经过三次醇沉，得到M<10kD、10kD<M<50kD、M>50kD三段不同分子量酸枣仁汤多糖黄褐色多糖样品，得率分别为5％，14.6％，35.6％。 
实施例2：精密称取酸枣仁汤各组成药味，即酸枣仁(54g)、茯苓(18g)、川芎(18g)、知母(18g)、甘草(9g)，置100ml圆底烧瓶中，置索氏提取器用10倍石油醚(60～65℃)脱脂4h，残渣取出，干燥、研碎、过40目筛后，用4倍50％的乙醇回流提取3h除去皂苷、黄酮等杂质， 残渣再经过干燥等处理，分别加10倍，5倍体积水浸提两次(60～65℃)，每次0.5h。提取液静置过夜后将上清液离心，上清液依次用50，10kDa的超滤膜进行超滤处理。超滤温度20～60℃，操作压力0.02～0.2MPa，pH：1～13，料液浓度为原始提取液浓度，所得截留液分别收集，浓缩至一定浓度，得到不同分子量范围的酸枣仁汤多糖原液。抽滤，溶液经旋转蒸发器浓缩后，加90％乙醇醇沉得到絮状沉淀，4℃冷藏过夜，12000r/min离心5min得到沉淀，室温下干燥后溶于水再经过三次醇沉，得到M<10kD、10kD<M<50kD、M>50kD三段不同分子量酸枣仁汤多糖黄褐色多糖样品，得率分别为4.1％，12.2％，30.1％。 
实施例3：采用实施例1制得的酸枣仁汤多糖提取物，进行药理活性实验。 
3.1对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响 
取小鼠120只，雄性，随机分成12组，每组10只。各给药组分别灌胃给予30、60、90g/kg的酸枣仁汤多糖M<10kD、10kD<M<50kD、M>50kD及30g/kg的酸枣仁颗粒、4mg/kg的安定。空白对照组给予同容积的蒸馏水。每天1次，连续5d。于末次给药前8h禁食，前1h禁水，给药30min后，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，观察并记录发生睡眠小鼠的只数，以注射戊巴比妥钠后15min内翻正反射消失达1min以上者确定为阳性。与空白对照组比较，M<10kDa、10kDa<M<50kDa、M>50kDa不同分子量酸枣仁汤多糖30g/kg能增加小鼠入睡只数，表明酸枣仁汤对小鼠具有明显的催眠作用，其中分子量范围小于50kDa多糖催眠效果显著。 
表1酸枣仁汤多糖提取物对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数的影响(n＝10,x±s) 

*P<0.05,**P<0.01 
3.2对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响 
取小鼠120只，雄性，随机分成12组，每组10只。分组及给药方法同“3.1”条。给药30min后，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg，观察并记录各组小鼠睡眠持续时间。与空白对照组比较，M<10kDa、10kDa<M<50kDa、M>50kDa不同分子量酸枣仁汤多糖30g/kg能增加小鼠睡眠时间，表明分子量范围小于50kDa的酸枣仁汤多糖提取物对小鼠具有明显的催眠作用，其中分子量范围小于10kDa多糖催眠效果显著。 
表2酸枣仁汤多糖提取物对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响(n＝10,x±s) 

*P<0.05,**P<0.01 
3.3对小鼠自主活动次数的影响 
取小鼠120只，雄性，随机分成12组，每组10只。分组及给药方法同“3.1”条。给药30min后，将小鼠置小动物自主活动测定仪中，使其适应3min后，记录5min内活动次数。与空白对照组比较，M<10kDa、10kDa<M<50kDa、M>50kDa不同分子量酸枣仁汤多糖30g/kg能减少小鼠小鼠自主活动次数，表明分子量范围小于50kDa的酸枣仁汤多糖提取物有明显的镇静作用，其中分子量范围小于10kDa多糖镇静效果显著。 
表3酸枣仁汤多糖提取物对小鼠自主活动次数的影响(n＝10,x±s) 

*P<0.05,**P<0.01 。