IL-12在诊断和治疗非小细胞肺癌远处转移中的应用技术领域
本发明涉及肿瘤诊断及治疗领域。具体地，本发明涉及IL-12在诊断和治
疗非小细胞肺癌远处转移中的应用。
背景技术
肺癌是世界上许多国家最常见的恶性肿瘤之一，在我国，肺癌居恶性肿瘤
死因首位。肺癌可分为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)
和小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌
(NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％，包括鳞癌、腺癌、未分化癌、非小细胞
型肺癌和大细胞癌。鳞癌在肺癌中最为常见，约占肺癌的40％，而男性则占80％
左右。其中只有15-25％的非小细胞肺癌有手术治疗的机会，而即使接受根治性
手术治疗，仍然有50％的NSCLC患者会复发。
然而，目前的治疗手段中缺乏对原发性非小细胞肺癌预后的有效区分标志
物，导致不同预后的患者仍接受相同的治疗，即使手术，仍会有复发可能。因
此，本领域迫切需要开发一种能够区分非小细胞肺癌侵袭性高低的检测方法或
标记物，从而对患者的预后进行提前判断，并提供个性化治疗方案。
发明内容
本发明公开了IL-12与非小细胞肺癌转移的相关性。
本发明第一方面，提供了白介素-12(IL-12)或其检测试剂的用途，用于制备
预测或诊断非小细胞肺癌远处转移的试剂盒。
在另一优选例中，所述的IL-12来源于哺乳动物，较佳地，来源于人、小鼠、
大鼠。
在另一优选例中，所述的非小细胞肺癌包括肺鳞癌、肺腺癌、低分化肺癌、
大细胞肺癌；较佳地，为肺鳞癌。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有白介素-8(IL-8)、和/或白介素-1(IL-1)
的检测试剂。
在另一优选例中，所述的检测是测定组织样品、血液样品、血清样品或体液
样品，较佳地，所述的组织样品包括癌组织和/或癌旁组织。
在另一优选例中，所述的检测包括Bio-plex悬液芯片系统、酶联免疫反应法
(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。
在另一优选例中，所述的远处转移包括除肺部以外的其他器官的转移。
在另一优选例中，所述的远处转移包括脑转移、骨转移、肝转移、胸膜转移。
在另一优选例中，所述IL-12的检测试剂为IL-12的抗体。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有IL-12用于阳性对照。
本发明第二方面，提供了一种用于预测或诊断非小细胞肺癌远处转移的试剂
盒，所述的试剂盒含有一容器，所述的容器中含有IL-12的检测试剂；以及标签或
说明书。
在另一优选例中，所述的预测或判断非小细胞肺癌转移指判断肿瘤转移是否
发生，和/或判断发生肿瘤转移的可能性(易感性)大小。
在另一优选例中，所述预测或诊断的对象为非小细胞癌组织和/或癌旁组织。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
当检测样本中的IL-12表达量C1与对照样本中IL-12表达量C0相比，C1≥
1.3C0，较佳地C1≥1.5C0，更佳地，C1≥2.0C0，则表明该检测样本为有远处转移
的非小细胞肺癌概率大，或表面该非小细胞肺癌样本可能发生远处转移。
本发明第三方面，提供了一种IL-12抑制剂的用途，用于制备抑制非小细胞
肺癌远处转移和/或抑制非小细胞肺癌细胞侵袭或迁移的药物组合物。
在另一优选例中，所述的IL-12抑制剂包括IL-12特异性抗体、IL-12的活性
抑制剂和受体拮抗剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有IL-12抑制剂，和药学上可接受的
载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有任选的化疗剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物中IL-12的施用量为0.01-10mg/kg，较
佳地，为0.1-5mg/kg。
本发明第四方面，提供给了一种非诊断性的预测或判断非小细胞肺癌细胞株
是否为高侵袭性细胞株的方法，包括步骤：测定所述的非小细胞肺癌细胞株中
IL-12的表达量，当IL-12的表达量显著高于正常肺细胞内IL-12的表达量，则说
明所述非小细胞肺癌细胞株为高侵袭性细胞株。
本发明第五方面，提供了一种体外非治疗性的抑制非小细胞肺癌细胞侵袭或
迁移的方法，包括步骤：
在IL-12抑制剂存在的条件下，培养非小细胞肺癌细胞，从而抑制非小细胞
肺癌侵袭或迁移。
本发明第六方面，提供了一种筛选IL-12抑制剂的方法，包括步骤：
(a)在非小细胞癌肿瘤细胞培养体系中添加候选化合物，作为测试组，在相同
的细胞培养体系中不添加候选化合物，作为对照组；
(b)观察测试组中细胞的侵袭和迁移，其中，当测试组中细胞的侵袭和迁移程
度M1显著低于对照组中细胞的侵袭和迁移程度M0，则表明所述的候选化合物为
Il-12抑制剂。
本发明第七方面，提供了一种制备非小细胞肺癌远处转移动物模型的方法，
包括步骤：向非小细胞肺癌荷瘤动物施用IL-12，从而产生非小细胞肺癌远处转移
动物模型。
本发明第八方面，提供了一种治疗转移性非小细胞肺癌的方法，向需要的对
象施用IL-12抑制剂，从而治疗转移性非小细胞肺癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施
例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技
术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大样本的筛选，首次意外地发现，
炎症细胞因子IL-12参与了非小细胞肺癌(鳞癌)远处转移的发生和发展，即
IL-12在非小细胞肺癌中具有促进转移、侵袭的作用，因此当在非小细胞肺癌
组织(或血清)中检测出具有表达量过高的IL-12时，可以认为该肿瘤组织是具
有(或患者患有)高侵袭性的非小细胞肺癌。此外，本发明人还发现，通过IL-12
的抑制剂降低IL-12的表达量，能够减弱非小细胞肺癌的侵袭性、降低癌细胞
的转移能力。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“侵袭”、“转移”、“迁移”均指的是非小细胞肺癌
细胞的远处转移能力，例如在transwell侵袭实验中，发现或证实的肿瘤细胞
的侵袭能力；或在体内，原发性的非小细胞肺癌在除肺部以外的其他组织、器
官的生长与增殖。术语“高侵袭性细胞株”指的是易发生远处转移或迁移的细
胞株。
非小细胞肺癌
肺癌从病理分型上可以分为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,
NSCLC)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)两大类，其中非小细胞
肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％，包括鳞癌、腺癌、未分化癌(低分化
癌)、非小细胞型肺癌和大细胞癌。其中，未分化癌(低分化癌)指的病理上确
定该类型细胞癌为原始的肺癌细胞；而非小细胞型肺癌指的是病理上无法归为
鳞癌、腺癌、大细胞癌或未分化癌任意一种，且也不属于小细胞肺癌的非小细
胞肺癌。
白介素-12
白介素-12(IL-12)是具有广泛生物学活性的细胞因子，主要由B细胞和巨
噬细胞产生；IL-12主要作用于T细胞和NK细胞，刺激活化型T细胞增殖，诱
导NK细胞的细胞毒活性并促进其分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等细胞因子；
增强对肿瘤细胞的杀伤效应。
通常认为，IL-12有助于对肿瘤细胞的杀伤作用，据报道，在胃癌、结直
肠癌、宫颈癌中，IL-12的表达量均有不同程度的降低。然而，本发明人通过
病理样本筛选以及实验验证发现，IL-12在非小细胞肺癌(尤其是鳞癌)中呈高
表达表现，且与癌症的侵袭程度密切相关，即高表达IL-12的非小细胞肺癌表
现出远处转移的能力更强。
此外，本发明人还通过实验证明，在降低了IL-12的表达后，非小细胞肺
癌的侵袭能力也有显著下降。这不仅提示了在非小细胞肺癌的发生和转移中，
炎性反应及炎症因子IL-12起到了重要的作用，更是可以将IL-12作为治疗非
小细胞肺癌，尤其是转移性非小细胞肺癌的治疗靶点。
检测方法和试剂盒
本发明涉及定量和定位检测人IL-12蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。
这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人IL-12蛋白水平，可以用于诊断非
小细胞肺癌转移或迁移。
一种检测样品中是否存在IL-12蛋白的方法是利用IL-12蛋白的特异性抗体
进行检测，它包括：将样品与IL-12蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合
物，形成了抗体复合物就表示样品中存在IL-12蛋白。
IL-12蛋白或其多核苷酸可用于IL-12蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的
多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中
基因的差异表达分析和基因诊断。抗IL-12的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于
检测样品中的IL-12蛋白。
本发明还提供了一种检测非小细胞肺癌的试剂盒，它含有特异性扩增IL-12
的引物对和/或IL-12特异性抗体以及标签或说明书。
其中，所述的标签或说明书注明以下内容：当检测对象的IL-12相对-肌动蛋
白的mRNA表达量与癌旁组织的IL-12相对-肌动蛋白的mRNA表达量之比>2，则提
示该检测对象肿瘤转移的几率高于普通人群。
一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人非小细胞肺癌组织样品或血液样
品。
抑制剂
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与IL-12蛋白发生相互
作用的物质，尤其是抑制剂等。
本发明IL-12的抑制剂(包括抗体以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给
药)时，可抑制IL-12蛋白的表达和/或活性，进而抑制非小细胞肺癌的转移或迁移。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其
中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待
治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包
括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
可用于本发明的抑制剂包括：IL-12的抗体、或L-12的活性抑制剂。典型地，
将IL-12基因作为制备预防或治疗非小细胞肺癌转移迁移的药物的靶点的技术方
案，例如.获得能够特异性抑制IL-12表达量和/或活性的多肽、单克隆抗体，从而
现实抑制非小细胞肺癌细胞转移或迁移的目的。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明IL-12抑制剂
以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、
葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药
物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液
通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行
制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给
药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
抗体
本发明还包括对人IL-12蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其
是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人IL-12，较佳地，指那些能
与人IL-12结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以
通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。同样，表达人IL-12因子或它的
抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗
体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv
分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体包括可以抑制IL-12功能的抗体，也可以是不影响人IL-12功
能的抗体。每一类抗体都可以通过对人IL-12基因产物的片段或功能域致免疫而产
生，而人IL-12基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。
与非修饰形式的IL-12基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞(如E.coli)中
产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化IL-12
蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物
来免疫动物而得到。
可用于本发明的IL-12抗体可以是抗人IL-12蛋白抗体。本发明的抗人IL-12
蛋白抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人IL-12因子。
药物组合物和给药方式
本发明提供了含有活性成分(a)IL-12抑制剂；(b)药学上可接受的载体；以及
任选的(c)化疗剂的药物组合物。
在本发明的药物组合物中，IL-12抑制剂IL-12抑制剂的含量没有特别限制，
通常为0.01-95wt％,较佳地为0.1-90wt％。
本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。
在复方制剂中，除了含有IL-12抑制剂之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，
例如化疗剂。代表性的化疗剂包括(但并不限于)：烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、
嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、
抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代
的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、
抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包
括：5一氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉
醇和多西紫衫醇。
本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用
的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服
制剂(如片剂)和注射剂。
在本发明中，IL-12抑制剂或含IL-12抑制剂的药物制剂可用于预防和治疗非
小细胞肺癌细胞的转移、侵袭或迁移。
在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔
内或皮下等途径给药。
本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。
优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺
应性。
服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人1mg～200g，较佳地为
10mg～100g。
本发明的有益效果
本发明发现IL-12在非小细胞肺癌(尤其是鳞癌)的转移中起到重要的作
用，IL-12高表达的非小细胞肺癌发生转移的概率更高，而降低IL-12的表达
则有助于减少非小细胞癌的转移。因此IL-12不仅可以作为预测或判断非小细
胞肺癌是否转移的分子标记物，还可以作为治疗非小细胞癌或其转移的分子靶
点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说
明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方
法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:
ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂
商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.蛋白提取：
(1)把组织剪切成细小的碎片。
(2)取适当量的Western及IP细胞裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF
和cocktail，使终浓度为1mM。
(3)按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。
(4)匀浆器匀浆(15000转/min)，直至充分裂解。
(5)充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续
Bio-plex悬液芯片系统细胞因子测定。
2.Bio-plex悬液芯片系统测定细胞因子。
1)材料：
Bio-plexProtmHumanCytokineGrpIPanel27-Plex,
Cat.#50-0KCAF0Y购自Bio-Rad公司。
2)方法：
1.以100uLBio-PlexAssayBuffer润湿96孔板，再用真空吸板机吸去所
有buffer；
2.每孔加入50uL磁珠，真空吸去buffer；用100uLBio-Plexwashbuffer
洗2次，分别真空吸去buffer；
3.轻弹样品和标准管3-5次，每孔加入50uL，用铝薄盖住，先1100转室
温摇床30秒，再以300转摇30min；
4.然后轻轻移去铝薄，避免溅出，真空抽去buffer，再100uLBio-Plexwash
buffer洗3次，分别真空吸去buffer；
5.检测抗体加入前漩涡混合，每孔加入25uL，盖上铝薄，先1100转室温
摇床30秒，再以300转摇30min；
6.然后轻轻移去铝薄，避免溅出，真空抽去buffer，再以100uLBio-Plex
washbuffer洗3次，分别真空吸去buffer；
7.Streptavidin-PE荧光色素加入前漩涡混合，每孔加入50uL，用铝薄盖
住，先1100转室温摇床30秒，再以300转摇10min；
8.然后轻轻移去铝薄，避免溅出，真空抽去buffer，再100uLBio-Plexwash
buffer洗3次，分别真空吸去buffer；
用125uLBio-Plexassaybuffer重悬微珠，以密封袋盖住，1100转室温
摇床30秒，便可放入仪器中进行读盘检测。
实施例1非小细胞肺癌病例收集
自东方医院收集了22例非小细胞肺癌病例，其中包括了病理结果经确认
的鳞癌、腺癌、低分化癌(包括非小细胞型癌)类型。
此外，还提供了按淋巴转移和远处转移进行分离的22个转移病理数据。
实施例2非小细胞肺癌中细胞因子的测定
2.1采用通用方法，对这些病例中的IL-12的表达量进行了测定，结果发
现，在非小细胞肺癌中，IL-12的表达显著高于癌旁组织(T/N比值远大于1.5,P
＜0.05)。
此外，出乎意料是的，鳞癌的T/N比值(平均值)为2.4，显著高于腺癌的
T/N比值1.9。这表明，与腺癌相比，IL-12在非小细胞肺癌的鳞癌中表达差异
性更显著。
更出乎意料的是，通过数据的分析，T/N比值在无淋巴或远处转移的病例
中保持相对较低水平，而在有远处转移的病例中，T/N比值显著高于癌旁组织。
按转移程度分的T/N比值结果见表1：
表1
远处转移程度
平均值项：T/N
M0
0.85
M1
2.12
M2
2.35
2.2非小细胞癌中IL-8和IL-1b的测定
采用相同方法，对IL-1b和IL-8的表达量也进行了测定，结果表明，IL-1b
和IL-8在非小细胞肺癌中也有非常显著的高表达。其中，IL-8的T/N平均值
为5.1，IL-1b的T/N平均值为8.2。
实施例3扩大样本量的验证
采用相同方法，根据以上的预实验结果，扩大样本量至各60例，分别测
定发生远处转移和未转移的非小细胞肺癌中，IL-12的表达量。
结果表明，在发生远处转移的非小细胞肺癌中，IL-12的表达量(T/N平均
值约2.2)显著高于未转移的非小细胞肺癌(T/N平均值约0.8)。
实施例4过表达IL-12对非小细胞癌细胞系侵袭性的影响
先将人白血病单核细胞系THP-1,经过佛波酯刺激后分化成为巨噬细胞，检
测细胞因子IL-1b、Il-8和IL-12的表达量；然后将非小细胞肺癌细胞系于六
孔板小室中与巨噬细胞共培养,观察其生物学形态改变；应用Transwell侵袭
小室检测共培养体系中非小细胞肺癌细胞侵袭能力的改变。
结果发现，IL-12能够使非小细胞肺癌细胞系的侵袭性显著增加。
实施例5抑制IL-12对非小细胞肺癌细胞系侵袭性的影响
先将人白血病单核细胞系THP-1,经过佛波酯刺激后分化成为巨噬细胞，检
测细胞因子IL-1、Il-8和IL-12的表达量；然后将非小细胞肺癌细胞系于六
孔板小室中与巨噬细胞共培养，同时加入IL-1、Il-8和IL-12的抗体，观察
其生物学形态改变；应用Transwell侵袭小室检测共培养体系中非小细胞肺癌
细胞侵袭能力的改变。
结果发现，抑制IL-12能够使非小细胞肺癌细胞系侵袭性得到抑制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献
被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申
请所附权利要求书所限定的范围。