除草剂2,4-D的免疫胶体金检测卡及其制备方法技术领域
本发明涉及环境激素检测技术领域，特别是涉及2,4-D的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
近些年来，科学家不断发现一些来源于环境中的化学物质能够模拟内分泌激素功能从而引起生物体内分泌系统紊乱，称其为环境激素或环境荷尔蒙。环境激素已成为继臭氧层、地球气候变暖之后全球的第三大环境问题，成为环境科学研究领域中的热门课题。美国环境保护局给出的环境激素的定义，是指一类干扰体内与生物体的正常行为及与生殖、发育相关的正常激素的合成、贮存、分泌、体内运输、结合及清除等过程的外源性化合物。
环境激素是环境中的激素类似物，它能通过与激素受体结合，干扰生物体正常的生理代谢、内分泌和生殖机能，引起种种负面的生物学效应。环境激素通过环境介质和食物链进入人体或动物体内，干扰其内分泌系统和生殖功能系统，影响后代的生存和繁衍。
现代工农业生产在不断满足人类的生活需要的同时也给环境带来了沉重的负担，并且已经威胁到人类的生殖健康，甚至物种的繁衍。我国是世界上的农药生产与使用大国，资料显示2011年我国农药原药产量为264.87万吨，其中杀虫剂原药产量为70.9万吨，占总产量的44.35%；除草剂产量为117.5万吨，占总产量的26.77%；杀菌剂原药的产量为15万吨，占总产量的5.67%。此类农药除部分出口外，大部分在国内销售和使用。据相关数据估算我国每年约有50~60万吨有机氯农药直接排放至环境中，如除草剂2,4-滴(2,4-DichlorophenoxyaceticAcid，2,4-D)。而多数有机氯农药具有较强的内分泌干扰作用。此类农药一旦进入环境就会通过多种暴露途径进入生物体内，富集于生物体的脂肪组织内进而危害人和动物的生殖健康。
目前，环境激素污染物的分析方法主要分为以GC-MS、HPLC与LC-MS技术为代表的仪器分析方法以及基于抗原抗体反应的免疫分析技术，这些常规的残留分析技术通常操作程序复杂，效率较低，分析成本较高，不利于推广使用，难以适应大量样本和现场检测的要求。基于环境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究热点，本发明涉及一种除草剂2,4-D检测卡及其制备方法。本发明的检测卡具有简便快捷、易于操作、成本低廉等优点，并且能同时检测水样中这二种环境激素污染物质，产生了良好的社会效益和经济效益。
本发明的2,4-D胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了2,4-D-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。
本发明的2,4-D胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：
(1)胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
(2)抗体的预处理：将要标记的2,4-D抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成2,4-D单克隆抗体胶体金标记物；
(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)2,4-D蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含2,4-D蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、2,4-D蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；
所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；
本发明可有效用于测定2,4-D，方法简单，方便、快捷，结果准确。
附图说明
图1为本发明2,4-D的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳。
图2为本发明2,4-D的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9.PVC胶板10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。
具体实施方式
实施例1
图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了2,4-D-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。
在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。
在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和2,4-D-BSA检测线2。
在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。
实施例2
2,4-D胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：
胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；
抗体的预处理：将要标记的2,4-D抗体在1000r/min,4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀释成1mg/ml，过0.22μm滤膜；
胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3调节胶体金溶液pH至8.5，电磁搅拌器250r/min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min；逐滴加入4mL10%BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成2,4-D单克隆抗体胶体金标记物；
胶体金膜的制备：将步骤(3)2,4-D蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含2,4-D蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；
包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、2,4-D蛋白质偶联物稀释成1mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；
样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；
检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。