一种检测鸡肉组织中的地克珠利的荧光分析法技术领域
一种检测地克珠利的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于鸡肉组织样品中地克珠利的含量检测。
背景技术
地克珠利（Diclazuril）属三嗪苯乙腈化合物，为类白色或淡黄色粉末，在二甲基甲酰胺中略溶，在四氢呋喃中微溶，在水、乙醇中几乎不溶。地克珠利是一种高效、低毒的广谱驱球虫药，对鸡、火鸡、鸭、鹅、孔雀、鹌鹑、兔等各种球虫具有良好的防治效果，每吨饲料添加1g，能有效地控制球虫病的爆发。鸡球虫是养禽业的常见寄生虫，给养鸡业造成严重经济损失。目前预防鸡球虫病的主要手段是实用抗球虫药进行化学防治和疫苗接种，长期药物预防一直是鸡球虫病防治的有效手段，其用药量大，约占各种药物添加剂总量的1/4。地克珠利是主要使用的抗球虫药物之一，国内实用也较为混乱。
随着药物在食品动物中的广泛应用，其残留问题已引起了广泛的关注。药物残留不仅因其毒副作用对人造成直接危害，更严重的问题是食品动物中残留低浓度的药物容易又到人类致病菌产生耐药性，从而不利于药物在人医临床的应用。因为开展地克珠利的残留研究十分必要。
目前有关动物源性食品中地克珠利及其代谢物的测定方法主要为高效液相色谱法测定鸡肉中的地克珠利残留量，检出限为0.01ug/kg。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适用于大批量样品的检测，无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。而时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测地克珠利的试剂盒及其检测方法，用于水产品样品中地克珠利含量的检测。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测地克珠利。技术方案：该检测地克珠利的试剂盒是由：(1)96或48孔包被板；(2)缓冲液；(3)地克珠利标准；(4)地克珠利的抗体冻干品；(5)铕标记的羊抗鼠抗体；(6)洗涤液；(7)增强液所组成。
本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有地克珠利-OVA的微孔板，加入地克珠利标准或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入地克珠利抗体，振荡反应，游离的地克珠利与微孔板上的地克珠利-OVA竞争地克珠利抗体，洗涤液洗涤，没有连接的地克珠利抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3＋-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3＋-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。
附图说明
图1地克珠利-TRFIA反应示意图。
图2地克珠利-TRFIA标准曲线图。
图3检测地克珠利的试剂盒示意图：(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)地克珠利标准，(4))地克珠利的抗体冻干品，(5)铕标记的羊抗鼠抗体，(6)洗涤液，(7)增强液。
具体实施方案
实施例1
按下列步骤制备试剂盒和检测鸡肉组织样品：
(1)Eu3＋-羊抗鼠抗体的制备：
取溶解于50mmol/LPBSpH7.0的5g/L羊抗鼠抗体1.2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3＋-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3＋-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/LTris-HClpH7.8缓冲液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。
(2)包被板固相抗原制备：
将地克珠利-OVA用50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至5mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗两次，加150μl含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
(3)试剂的配制：
A.标准地克珠利：(0ng/ml，0.025ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.3ng/ml，0.6ng/ml)，从地克珠利纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3；
B.缓冲液：8mmol/LNaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3的Tris-HClpH7.8；
C.洗涤液：14.5mmol/LNaCl、0.2ml/LTween-80和0.2％NaN3的50mmol/LTris-HClpH7.8；
D.增强液的配制：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)，50μmol三正辛基氧化膦(TOPO)，1ml曲拉通X-100(TritonX-100)。
(4)试剂盒提供的试剂：
每一个盒中的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：
A.1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有地克珠利-OVA；
B.6×地克珠利标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为：(0ng/ml，0.025ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.3ng/ml，0.6ng/ml)；
C.1×地克珠利抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解；
D.1×Eu3＋-羊抗鼠抗体冻干品，用时0.5ml蒸馏水溶解；
E.1×增强液：15ml；
F.1×洗涤液：30ml，用时以蒸馏水1∶25稀释；
G.1×缓冲液：30ml。
(5)测定之前注意事项：
A.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)；
B.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃；
C.如果样品量大建议使用多通道移液器；
D.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔；
E.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。
(6)具体检测步骤如下：
取地克珠利-OVA板条，加入50μl的地克珠利标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶5000稀释的地克珠利抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1∶400稀释的Eu3＋-羊抗鼠抗体100μl，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗六次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的地克珠利含量，和图2，该例的样品浓度0.15ng/ml。
实施例2
按下列步骤制备试剂盒和检测猪肉样品：
(1)制备试剂盒同实施例1的(1)~(5)；
(2)具体检测步骤如下：
称取2.0±0.05g均质后的组织样品，加入8mL3%三氯乙酸溶液，涡旋5min，室温4000r/min离心10min；取出2mL上清液至另一个离心管中，用1MNaOH调pH值至7.0~7.5之间。取调pH值后的液体用样本复溶液1：4（即100mL样本液加400mL样本复溶液）稀释，混匀30s；取50mL用于检测分析。
取地克珠利-OVA板条，加入50μl的地克珠利标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加缓冲液1∶5000稀释的地克珠利抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃振荡1小时，洗涤液洗四次，加缓冲液1∶400稀释的Eu3＋-羊抗鼠抗体100μl，37℃振荡45分钟，用洗涤液洗4次，加200μl增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的地克珠利含量，如图2为地克珠利标准曲线图。