CXCL1的适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及CXCL1适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用。
背景技术
所谓尿路上皮癌是指膀胱癌和肾盂癌、尿管癌等的总称，上述癌均由尿路的移行上皮细胞癌化产生，一般认为其性质是相同的。尿路上皮癌是在泌尿生殖器癌中继前列腺癌之后患病人数最多的癌症。
已经公开了用于膀胱癌的检查和确定的多种标记物及方法。例如可以举出通过核磷蛋白(nucleophosmin)/B23、HURP、CYP4B1或CYP4B2等基因表达水平的变化来确定膀胱癌的方法，通过尿样中特定蛋白质的存在或量来确定膀胱癌的方法，以血液中可溶性Fas浓度为指标确定膀胱癌的方法等。在现有技术中以CXCLl蛋白质作为肿瘤标记物，通过使用与其特异性结合的抗体、或者能够与编码该蛋白质的基因、其转录产物或其cDNA结合的核酸，能够有意义地检测出尿路上皮癌。
核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术(即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。
核酸适配子筛选的基本步骤如下:设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合尿路上皮癌中的CXCLl蛋白，可以来实现尿路上皮癌治疗药物运送的靶向性，可用于尿路上皮癌的诊断与治疗。
本发明采用以下技术方案：
体外合成一个含有40个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用CXCLl蛋白为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNAStructureProgram分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合CXCLl蛋白。所述适配子序列如下：
CXC-1：
GCTATCTAGCCTATCTGGAACACCCTCTCGCTTAACTATTACAATCTATTCATATGTTATCAGCGTAACGCAGCACTGCA
CXC-2：
GCTATCTAGCCTATCTGGAACCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACACACCGCACCTAAGCGTAACGCAGCACTGCA
本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合CXCL1蛋白的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为靶向尿路上皮癌细胞的诊断和治疗药物。
具体实施方式
实施例1CXCL1蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选
根据CN101297046A中公开的CXCL1抗原制备方法，制备的到CXCL1蛋白。也可以采用本领域常规的CXCL1蛋白表达的方法。根据已知的基因序列NP_001502，通过常规基因合成或者基因组调取的方式来获得相应的基因序列，采用酵母表达的方法体外表达CXCL1蛋白，获得了相应的蛋白，命名为CXCL1。
化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下：(5′-GCTATCTAGCCTATCTGGAAC----N40----AGCGTAACGCAGCACTGCA-3′)，其中N40为40个随机寡核苷酸；
引物P1：GCTATCTAGCCTATCTGGAAC；
引物P2：TGCAGTGCTGCGTTACGCT。
将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与3ugCXCL1蛋白37℃孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L醋酸铵，l.6mmol/LEDTA,0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行15轮。
实施例2特异性高亲和力的TS/MDEP结合适配子的获得
将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的CXCL1蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与CXCL1蛋白的解离常数。结果如下：
名称 解离常数Kd
CXC-1 13nM
CXC-2 15nM
PBS空白对照 无结合能力
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
从以上结果可以看出，本发明的二个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合CXCL1蛋白。
实施例3降解活性分析
分别采用人血白蛋白，RASAL1蛋白，CYP4B1，CYP4B2蛋白与2条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与CXC-1蛋白结合保持较高的特异性。
将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
序列表
〈110〉中国人民解放军第四军医大学
〈120〉CXCL1的适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用
〈210〉1
〈211〉80
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CXC-1
GCTATCTAGCCTATCTGGAACACCCTCTCGCTTAACTATTACAATCTATTCATATGTTATCAGCGTAACGCAGCACTGCA
〈210〉2
〈211〉80
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉CXC-2：
GCTATCTAGCCTATCTGGAACCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACACACCGCACCTAAGCGTAACGCAGCACTGCA。