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通过在多孔性载体上实施 电泳法分析试样的阳性鉴定
    本发明涉及通过电泳对分析的试样进行阳性鉴定的装置的限定与使用。更确切地，本发明涉及在电泳载体上鉴定试样涂布器的装置，该装置能够使得一或多个系列分析试样的电泳图形与被使用的试样涂布器结合，因此能够可靠地鉴定主要试样的分析结果。

    在特别是以临床目的通过电泳进行分离后分析试样的情况下，而且特别是在用于确定疾病的常规分析时，为了使产生的结果具有稳定性，有必要能够以可靠的方式监测分析过程中每种试样的变化。特别地，有必要确保依照电泳分离得到的结果能够毫无疑问的归因于理论上该结果对应的试样(初始试样)。

    某一结果与良好的初始试样之间的因果关系具有不确定性，这不确定性例如由人工操作所造成，良好的操作本质上与操作者的注意力有关。在目前此类分析过程中，无法检测错误。

    因此，本发明提出能够在电泳分离后在电泳载体上识别及鉴定试样或一系列试样的鉴定装置。这些装置可借助任何适用于在载体上适合进行区带电泳的技术被用于任何电泳分离。

    本发明还涉及用于将被分析试样沉积在电泳载体上，而且具有本发明鉴定装置(称为“鉴定标记”)地试样涂布器。

    本发明还提出包含该鉴定装置的试剂盒。

    本发明范围内定义的装置可被整合在用于由试样采集直至结果传送之间所有分析阶段被分析试样的整体定位系统。

    并非试图局限于下述模式，应该指出，通常在琼脂糖凝胶上进行的区带电泳技术可分离含于生物试样如血清、血液、尿、脑脊髓液、眼泪等的蛋白质组份。在含有缓衡溶液的电泳介质中，使用试样涂布器将含有蛋白质的试样涂布在凝胶表面上，这些试样在该表面上被电离，而且在电场作用下根据其各自的电荷而以不同的速率迁移。在经过能够分离试样的蛋白质组份的迁移阶段后，这些蛋白质例如通过使用特定染料染色而显露，并且例如通过读取光密度计而定量。

    如同大部分现代分析技术，电泳已在很大程度上实现自动化，其目的一方面在于使利用该技术，另一方面在于使其具备可靠性。现在可自动地进行将试样装载至涂布器中、将涂布器沉积在凝胶上、使凝胶迁移并且进行干燥、将凝胶染色及脱色、及读取凝胶数据的步骤。相对地，将试样涂布器由试样装载装置转移至电泳仪器的步骤仍为人工步骤，因此易于发生操作错误。因此，例如，在同时使用2个电泳仪器的情形下，预期被用于第一仪器的涂布器可以被装载至第二个仪器之中，反之亦然。此外，更常发生的实例为许多涂布器必须沉积在相同凝胶之上的情形。最终可能导致这些涂布器无法沉积在预期的位置(2或更多层倒置)。在此情形，无法通过检测染色凝胶的最终图像确定得到的某一沉积层对应于那个涂布器。

    本发明提供通过简单检测试样层上的电泳图像，将一系列以试样层形式沉积在电泳载体上的试样供给特定试样涂布器的装置。

    本发明可通过检测在沉积、迁移、染色、及干燥操作后由涂布器的鉴定装置以及同时地由被分析试样获得的电泳图像来准确无误地鉴定涂布器并且因而鉴定一系列与该涂布器相关的有待被分析试样。

    在结合分析系统的不同组件、特别是试样管、涂布器与凝胶的常规鉴定方法(例如条形码或二维码如矩阵码)的条件下利用本发明可以在由含试样的主要管道至最终结果之间对试样进行鉴定与示踪。

    可用于本发明范围的试样涂布器可由能够装载待分析试样的任何类型装置构成，特别是通过由含有这类试样且能够在预定区域内装载本发明涂布器的鉴定标记的管道采集试样进行上述分析过程。试样涂布器可以人工地或优选自动地装载试样。

    适合的涂布器已叙述于先有技术，而且例如欧洲专利申请EP-A-0493 996及美国专利申请US-A-5 464 515与US-A-5 405 516描述了“隔膜”(或齿状)梳，“槽状”梳及“叶片”梳，或通常任何可用以装载并且随后在电泳载体上沉积待分析试样的装置。

    在本发明的优选实施方案中，作为本发明目的的涂布器鉴定标记可以由在电泳载体上进行沉积、迁移、染色、及干燥步骤后易于在电泳载体上显露的任何化学物质构成。

    本发明的标记必须可直接通过检测电泳法后的电泳载体或通过检测借助电泳法分离的试样组份的技术而得到鉴别。

    用于本发明的名词“化学物质”表示任何可直接或间接地被检测的化学或生物个体，其中包括化学或生物官能或非官能化合物、分子、配合物、离子、结合体(例如，抗体-抗原型)。这些化学物质的特定实例为有色或可着色的化学物质，特别是蛋白质，或如抗体的官能物质。

    在本发明的优选实施方案中，使用的化学物质可在电场中迁移。

    所述标记可由属于相同或不同化学或生物类别，以及呈现相同或不同官能性质的上述物质的混合物。作为实例，标记可由可在电场中迁移的化学物质及不迁移但在其沉积区沉淀的物质的混合物组成。

    显然，这些组合物必须不会由于组合物生成的电泳图像与通过电泳分离的被分析试样相互混淆。因此，作为实例，人们提议使用有色化学物质或这些物质的混合物作为各试样涂布器的鉴定装置，上述混合物中存在多种化学物质而且其中每一种或某些种物质的电泳迁移率不同于其他物质或某些其他物质。

    为了在一种相同的电泳载体或多种电泳载体上有效地进行所希望的鉴定，所使用的载有不同系列的不同试样的各涂布器必须结合特定的预定标记，以便将其区别于其他涂布器，或作为变化形式，其必须结合适用于不同涂布器的共用标记，然而，其位于涂布器中的不同位置，这样，通过定位标记电泳载体的泳道而处在反应后的电泳载体上。共用标记可以由上述任一种化学物质或这些物质的混合物组成，其中包括生理盐水。

    在本发明的其他实施方式中，标记一系列试样是由于未装载试样涂布器区(井)造成的，此区通常被用于装载试样，而且各涂布器处在不同位置，以便在电泳载体上(由于不存在分离和显露的条带)产生不同的电泳图像。换言之，标记的特异性或者由于该组合物包含的化学物质的特性和/或浓度，或由于此组合物在涂布器的特定区域中的定位甚至由于以上参数的组合所造成，标记的特异性通过例如在电泳分析后与各标记在电泳泳道上得到的条带的颜色、位置、数量、或强度相关的各涂布器的不同电泳图像得到体现。标记亦可借助其在电泳载体上所占据的泳道与相同或其他载体上的其他标记占据的泳道进行比较得到鉴定。

    作为实例，可使用以下鉴定标记：

    ·染料或染料混合物，或任何其他有色物质，例如通过共价法得到的可迁移或不可迁移的染色蛋白质，各涂布器借助特定颜色或具有色条带的混合物鉴定；

    ·具有特定电泳迁移率呈现单体或聚合物形式的蛋白质或蛋白质结合体(或可迁移或不可迁移的并且在凝胶借助常规蛋白质染色剂：酰胺黑10B、酸性紫等染色时呈现颜色的任何其他化学物质)，各涂布器可借助位于外形上的特定位置的蛋白质条带(或化学物质条带)定位，此位置视鉴定剂而不同；还可以提到在溶解度极限使用的抗体-抗原结合，及聚合蛋白质，如牛γ-球蛋白；

    ·具有不同电泳迁移率的蛋白质(或者例如在使用常规蛋白质染色剂：酰胺黑10B、酸性紫等染色凝胶时可迁移及呈现颜色的任何其他化学物质)的混合物，各涂布器借助许多对应于被包含在鉴定剂中的蛋白质(或化学物质)数量的条带定位；

    ·在各标记中在可变浓度下存在的蛋白质(或者例如在使用常规蛋白质染色剂：酰胺黑10B、酸性紫等染色凝胶时可迁移及呈现颜色的任何其他化学物质)或蛋白质或化学物质的混合物。各涂布器借助对应于蛋白质(或化学物质)浓度的部分的强度被定位；

    ·上述鉴定标记的组合，其条件为，各组成标记可借助各自的电泳图像被鉴定；

    ·或者，选自上述类型的相同鉴定标记可用于所有使用的试样涂布器，其条件为，在各涂布器彼此不同的预设的加样孔中将此标记置于各涂布器上，以便能够在借助电泳分离试样后在对于各涂布器彼此不同的某一区域中定位相同标记的图像。作为变化形式，标记过程在此情况下是由于不存在对应于每一层试样的某一特定泳道的电泳图形造成的，这对应于闲置的涂布器的加样孔。

    本发明还涉及一种电泳分析方法，其中使用多个涂布器将一系列试样沉积在一个或多个电泳载体上，这些涂布器一方面预先被加入待分析试样，另一方面被加入用于各涂布器的特定标记或装载至各涂布器不同区域中的共用标记。

    试样、特别是由患者体内采集的生物试样组份的电泳分析方法，其中包含以下步骤：

    ·使用多个试样涂布器将生物试样沉积在一或多个电泳载体上，各涂布器包含可通过检测经过电泳后的电泳载体而鉴定的鉴定装置(鉴定标记)；

    ·施加电场以便使试样组份迁移；

    ·检测通过电泳分离的试样组份以及各涂布器的鉴定标记。

    如此定义的用于电泳分析待分析试样组份的方法可被整合至下述系统中，该系统中的涂布器的鉴定装置在通过比较依照电泳法得到的结果鉴定待分析试样的过程中与完全鉴定分析系统中所有组件的全面定位系统结合。

    随试样同时沉积在电泳载体上且进行电泳的各鉴定标记产生必须在不同的分析步骤：迁移、染色及干燥之后可以在电泳载体上定位，特别是可见的特定的电泳图像。此定位过程例如在借助光密度计分析电泳载体时可由操作员人工地或自动地进行。

    标记的定位过程可记录于用于分析系统中不同组件的鉴定系统中，如条形码、二维码(或任何其他鉴定系统)。然后借助码定位包含试样管、涂布器的标记管、涂布器、及分析载体的系统的不同组件。

    在特别是通过自动装置装载涂布器的步骤中，读取试样的不同主要管、标记管、及涂布器的码。然后，优选特别是通过自动装置将标记及试样装载在相应的涂布器的定位位置上。在此步骤后，各涂布器及其所载有的对应试样因此已完全得到鉴定。在读取各码后，将装载的涂布器及电泳载体引入电泳装置中。此时，各电泳载体结合一或多个涂布器。在此迁移、染色及干燥步骤后，在读取其码后将载体引入光密度计。光密度计或操作者定位各层上的标记，这使得该系统能够准确无误地鉴定此层上的试样并且因此将结果归因而无错误。此系统因此能够确保在主要管至最终结果之间对试样进行全面示踪。

    在本发明的第一个优选实施方案中，为了检测分离组份和/或涂布器鉴定标记，电泳分析法包含在电泳后显露分离组份的步骤。

    在本发明的特定实施方案中，使用不同的试样涂布器将多个不同试样层沉积在相同的电泳载体上。

    在上述本发明的其他实施方案中，使用不同的试样涂布器将多个不同试样层沉积在不同的电泳载体上。在此情形下，可在不同的并联仪器上同时进行多个电泳步骤。

    在按照上述方式限定的分析方法中，其中包括以上提议的特定实施方式的组合形式，各涂布器的鉴定标记由各涂布器的特定组合物组成，该组合物与试样同时沉积在电泳载体的预定泳道上。

    作为可供选择替代的方式，各涂布器的鉴定标记由所有涂布器共用的组合物组成，对于各涂布器、因此对于各电泳载体而言，该组合物与试样同时沉积在电泳载体的不同泳道上。

    在实施本发明方法时，试样涂布器的鉴定标记由任何如上定义的组合物组成。

    上述不同标记可用于包含以下步骤的方法中：

    ·使用多个试样涂布器将生物试样沉积在一或多个电泳载体上，各涂布器包含可通过在电泳后检测电泳载体鉴定的鉴定装置(鉴定标记)；

    ·施加电场以便使试样组份迁移；

    ·干燥电泳载体；

    ·染色电泳载体；

    ·将电泳载体脱色；

    ·干燥电泳载体。

    在此方法中，鉴定标记可在电泳载体染色步骤之前或者在不涉及有色标记的条件下通过在检测试样组份的步骤中进行染色(其包含将电泳载体染色)而被鉴定。

    在本发明的其他实施方式中，有色化学物质为抗体，优选为单克隆抗体，以得到独特的条带，及在使用单克隆抗体混合物的假设条件下，各抗体的迁移率使得其形成与借助该混合物中其他抗体得到的条带不同的条带。这些抗体可通过适用于包含电泳分离过程的分析过程的任何已知方法检测。

    类似地，可以上述方法中添加通过定量分析不同的分离组份完成的检测步骤。

    电泳分离在任何类型电泳载体、特别是在如凝胶之类载体上、尤其是琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或在乙酸纤维素隔膜上实施。通常，可使用能够使试样在其中扩散并且迁移以使分离试样中所含组份的任何多孔性载体。

    在本发明的其他实施方案中，此方法为其中分离的试样组份通过抗体以任何已知方法显露的免疫固定法，该方法将试样涂布器鉴定标记加入待分析试样的沉积步骤中。

    本发明还涉及一种阳性鉴定试样以便使被分析试样的电泳图像与采集试样相结合的方法，其中包含使用可通过其电泳图像鉴定的鉴定标记将试样涂布器标记的步骤，及利用标记试样涂布器将待分析试样沉积在电泳载体上。

    为了进行此方法，可使用所有上述可用于本发明电泳分析法的标记。

    本发明还涉及用于通过电泳分析试样组份的试剂盒，其中包含：

    ·包含适合接收被分析试样及试样涂布器鉴定标记并且能够使试样发生电泳迁移的多孔性材料的电泳载体；

    ·一或多种由化学物质组成的组合物，适用于试样涂布器的鉴定过程中的电泳分析过程，此组合物可以通过其电泳图像鉴定。

    用于此试剂盒的试样涂布器标记满足以上单独地或组合地述及的定义。

    此外，此试剂盒可包含任何通常用于电泳分析的试剂，特别是全部或部分以下试剂：

    ·一或多种用于显露分离的试样组份的试剂；

    ·一或多种用于显露涂布器鉴定标记的试剂。

    本发明的其他具体特性及优点可以通过以下实施例及附图得到体现。

    图1至7：许多试样系列的电泳分析图形，其与实施例1至7所述不同的试样涂布器标记相关联。

                             实施例

                             实施例1

    标记由以下溶液组成：

    ·标记1：苏丹红7B于二甲基甲酰胺中的溶液，5毫克/毫升；

    ·标记2：苏丹黑于二甲基甲酰胺中的溶液，5毫克/毫升。

    使10微升的各标记沉积在专利EP-A-0 493 996、US-A-5 464 515与US-A-5 405 516所述型式的2个沉积涂布器的第一齿的加样孔中。使10微升各待分析血清沉积在其他加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒，以分析血清蛋白。在能够将温度调整至20℃的仪器上，通过电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    在迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B(amidoschwarz)染色，染色后，将凝胶脱色及再度干燥。图1显示在各层的第一行呈现相应的标记：

    ·下层，第1行；红条带，标记1；

    ·上层，第16行；黑条带，标记2。

                             实施例2

    标记由以下溶液组成：

    ·标记1：3毫克/毫升处于生理盐水中的anti apo B clone 1单克隆抗体；

    ·标记2：3毫克/毫升处于生理盐水中的血红蛋白；

    ·标记3：2.5毫克/毫升处于生理盐水中的牛血清白蛋白。

    10微升各标记沉积在3个专利EP-A-0 493 996、US-A-5 464 515与US-A-5 405 516所述类型沉积涂布器的第一齿的加样孔中。10微升各待分析血清沉积在各其他加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒，以分析血清蛋白。在能够将温度调整至20℃的仪器上通过电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B染色。染色后，将凝胶脱色及再度干燥。图2显示在各层的第一行呈现相应的标记：

    ·下层，第1沉积：1个条带，标记1；

    ·中层，第19沉积：1个条带，标记2；

    ·上层，第37沉积：1个条带，标记3。

    在此情形，标记通过各条带的不同位置而彼此相区别。

                             实施例3

    标记由以下溶液组成：

    ·标记1：2毫克/毫升处于生理盐水中的血红蛋白；

    ·标记2：处于生理盐水中的2毫克/毫升血红蛋白与10毫克/毫升卵清蛋白；

    ·标记3：处于生理盐水中的2毫克/毫升血红蛋白、10毫克/毫升卵清蛋白与2.5毫克/毫升牛血清白蛋白。

    10微升各标记沉积在3个专利EP 0 493 996、US 5 464 515与US 5405 516所述类型沉积涂布器的第一齿的加样孔中。10微升各待分析血清沉积在其他的加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒，以分析血清蛋白。通过在能够将温度调整至20℃的仪器上电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B染色。在染色之后，将凝胶脱色及再度干燥。图3显示在各层的第一行呈现相应标记；

    ·下层，第1沉积；1个条带，标记1；

    ·中层，第19沉积；2个条带，标记2；

    ·上层，第37沉积；3个条带，标记3。

    在此情形，标记通过存在的条带数而彼此相区别。

                           实施例4

    标记由以下溶液组成：

    ·标记1：处于生理盐水中的3毫克/毫升anti apo B clone 1单克隆抗体；

    ·标记2：处于生理盐水中的3毫克/毫升anti apo B clone 1与clone2单克隆抗体；

    ·标记3：处于生理盐水中的3毫克/毫升anti apo B clone 1、clone2与clone 3单克隆抗体。

    10微升各标记沉积在3个专利EP-0 493 996、US 5 464 515与US5 405 516所述类型沉积涂布器的第一齿的加样孔中。10微升各待分析血清沉积在其他加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒，以分析血清蛋白。通过在能够将温度调整至20℃的仪器上电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B染色。在染色之后，将凝胶脱色及再度干燥。图4显示在各层的第一行呈现相应标记：

    ·下层，第1沉积；1个条带，标记1；

    ·中层，第19沉积；2个条带，标记2；

    ·上层，第37沉积；3个条带，标记3。

    在此情形，标记通过存在的条带数而彼此相区别。

                           实施例5

    标记由以下溶液组成：

    ·标记1：2.5毫克/毫升处于生理盐水中的牛血清白蛋白；

    ·标记2：13.5毫克/毫升处于生理盐水中的牛血清白蛋白；

    ·标记3：80毫克/毫升处于生理盐水中的牛血清白蛋白。

    10微升各标记沉积在3个专利EP 0 493 996、US 5 464 515与US 5405 516所述类型沉积涂布器的第一齿的加样孔中。10微升各待分析血清沉积在其他加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒，以分析血清蛋白。通过在能够将温度调整至20℃的仪器上电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B染色。在染色之后，将凝胶脱色及再度干燥。图5显示在各层的第一行呈现相应标记：

    ·下层，第1沉积；1个条带，低浓度；

    ·中层，第19沉积；1个条带，中等浓度；

    ·上层，第37沉积；1个条带，高浓度。

    在此情形，标记通过相应条带的强度而彼此相区别。

                                  实施例6

    如下进行鉴定：

    ·梳1：在第1齿上不存在试样或生理盐水；

    ·梳2：在第2齿上不存在试样或生理盐水；

    ·梳3：在第3齿上不存在试样或生理盐水。

    10微升生理盐水(或什么都没有)分别沉积在专利EP 0 493 996、US 5 464 515与US 5 405 516所述类型第一沉积涂布器的第一齿、第二沉积涂布器的第二齿及第三沉积涂布器的第三齿的加样孔中。

    10微升各待分析血清沉积在其他加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面30秒以分析血清蛋白。通过在能够将温度调整至20℃的仪器上电泳约6分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，将凝胶干燥然后以酰胺黑10B染色。染色后，将凝胶脱色及再度干燥。图6显示在各层的第一行呈现相应标记：

    ·下层，第1沉积；无外形；

    ·中层，第20沉积；无外形；

    ·上层，第39沉积；无外形。

                                  实施例7

    标记为部分聚合牛γ-球蛋白(与戊二醛)于生理盐水中的2.5毫克/毫升溶液，而且如下进行鉴定：

    ·梳1：在第1齿(左侧泳道)沉积标记；

    ·梳2：在第8齿(中央道)沉积标记；

    ·梳3：在第15齿上(右侧泳道)无任何试样。

    10微升标记溶液分别沉积在专利EP 0 493 996、US 5 464 515与US 5 405 516所述类型的第一沉积涂布器的第一齿、第二沉积涂布器的第二齿及第三沉积涂布器的第三齿的加样孔中。

    IgA、IgM、IgK、Igλ泳道的待分析试样被稀释3倍而在IgG泳道则被稀释6倍，而且将10微升各稀释液沉积在各对应加样孔中。这些涂布器然后以彼此间隔预定距离而涂布于凝胶表面1分钟以便完成免疫固定。通过在能够将温度调整至20℃的仪器上电泳约8分钟以20瓦功率分离试样。

    迁移后，通过以特定抗血清(抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗IgK、抗Igλ)培养各迁移泳道以及以蛋白质固定溶液培养对应于电泳外形的泳道，而将病变蛋白分型。标记泳道未进行任何特殊处理。排除过量试剂，将凝胶干燥且以酸性紫染色。各梳由对应于标记的有色条带的位置定位：

    ·下层，左侧沉积；存在有色条带；

    ·中层，中央沉积；存在有色条带；

    ·上层，右侧沉积；存在有色条带。