预诊癌症的方法和试剂盒.pdf

本发明涉及诊断和/或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法和试剂盒，通过测定患者癌症发生前发生改变的血液中癌症筛查抗原(CSA)的浓度进行检测。该诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法包括如下步骤：通过将血样品与半乳糖凝集素－3的单克隆抗体反应测定血样品中半乳糖凝集素－3的浓度；将测定的半乳糖凝集素－3浓度与正常人血样品中半乳糖凝集素－3浓度进行比较；如果测定浓度比正常人血液中半乳糖凝集素－3浓度高，则预诊具有感染癌症的危险。

权利要求书
1.  一种诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，其包括以下步骤：
通过将血样品与半乳糖凝集素-3的单克隆抗体反应测定血样品中半乳糖凝集素-3的浓度；
将测定的半乳糖凝集素-3浓度与正常人血样品中半乳糖凝集素-3的浓度进行比较；及
如果测定浓度比正常人血液中半乳糖凝集素-3的浓度高，则预诊为具有感染癌症的危险。

2.  权利要求1中的方法，其中所述测定血样品中半乳糖凝集素-3浓度的步骤是通过测定由酶联免疫吸附测定法(ELISA)形成的半乳糖凝集素-3与单克隆抗体复合物的吸收值进行的。

3.  权利要求2中的方法，其中所述单克隆抗体是M3/38单克隆抗体(大鼠IgG)，所述单克隆抗体作为第一抗体，将偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗大鼠IgG用作为第二抗体，其与所述第一抗体进行反应。

4.  权利要求1中的方法，其中所述测定血样品中半乳糖凝集素-3浓度的步骤包括以下步骤：
用缓冲液将血样品稀释到预定稀释比例；
将血样品中的半乳糖凝集素-3固定到固相上；
将作为第一抗体的半乳糖凝集素-3单克隆抗体与固定在固相上的半乳糖凝集素-3进行反应；
将作为第二抗体的偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗大鼠IgG与所述第一抗体进行反应；
对所述辣根过氧化物酶使用着色剂溶液；及
通过测定所述半乳糖凝集素-3和抗体复合物的吸收值来测定半乳糖凝集素-3的浓度。

5.  权利要求1中的方法，其中在以32-256的稀释比例稀释最初血样品时测定血样品中的半乳糖凝集素-3浓度。

6.  一种诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，包括以下步骤：
制备具有反应部分，样品注射部分及提供从样品注射部分转移到反应部分的通道的膜的检测条，其中将半乳糖凝集素-3的捕获抗体或半乳糖凝集素-3固定在反应部分；
将包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血液样品通过膜从样品注射部分转移到反应部分；及
根据反应部分颜色的变化预诊感染癌症的危险。

7.  权利要求6中的方法，其中直接将所述偶联金颗粒的示踪抗体与所述血样品混合，并注射到所述样品注射部分。

8.  权利要求6中的方法，其中所述检测条进一步包括以干燥状态定位于样品注射部分与反应部分之间的偶联金颗粒的示踪抗体。

9.  权利要求6中的方法，其中所述检测条进一步包括在所述样品注射部分的反向末端的膜上形成的控制线，其被设计为当血样品到达控制线时，其颜色发生改变。

10.  权利要求6中的方法，其中以32-256的稀释比例稀释所述血样品。

11.  一种诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的试剂盒，其包括：具有反应部分；样品注射部分及提供从样品注射部分转移到反应部分的样品通道的膜的检测条，
其中所述反应部分包括固定其上的半乳糖凝集素-3捕获抗体或半乳糖凝集素-3，当包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血液样品通过膜从样品注射部分转移到反应部分时，可根据所述血样品中半乳糖凝集素-3浓度测定反应部分的颜色。

12.  权利要求11中的试剂盒，其中所述偶联金颗粒的示踪抗体以干燥状态定位于样品注射部分与反应部分之间。

13.  权利要求11中的试剂盒，其中所述检测条进一步包括在所述样品注射部分反向末端的膜上形成的控制线，其被设计为当血样品到达控制线时，其颜色发生改变。

14.  一种诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的试剂盒，其包括：
一种用于固定血样品中半乳糖凝集素-3的微量培养板；及
一种与固定在所述微量培养板上的半乳糖凝集素-3反应以诱导微量培养板颜色变化的单克隆抗体。

15.  一种诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，其包括以下步骤：
测定在作为恶性癌症发展前期阶段的腺瘤或慢性炎症阶段出现的癌症筛查抗原；
通过将血样品与所述癌症筛查抗原的单克隆抗体反应测定血样品中癌症筛查抗原的浓度；
将测定的癌症筛查抗原的浓度与正常人血样品中癌症筛查抗原浓度进行比较；及
如果测定浓度实质上高于或低于正常人血液中癌症筛查抗原浓度，则预诊感染癌症的危险。

16.  权利要求16中的方法，其中所述测定癌症筛查抗原的步骤包括以下步骤：
测定抗原在正常，慢性炎症，腺瘤及恶性肿瘤阶段的组织中的出现程度；及
当在慢性炎症或腺瘤阶段的组织中抗原出现程度实质上高于或低于正常阶段的组织中抗原出现程度时，确定抗原作为癌症筛查抗原。

说明书预诊癌症的方法和试剂盒
发明领域
本发明涉及一种以简单且容易的方式预诊癌症的方法和试剂盒。更具体的说，本发明涉及通过测定患者癌症发生前将产生变化的血液中癌症筛查抗原(CSA)的浓度，来预诊和/或诊断癌症发生或感染癌症危险的方法和试剂盒。本发明特别适用于(1)患有癌症但没有主观症状的患者，(2)患有良性肿瘤，慢性炎症或胃炎但没有主观症状的患者及(3)正常人。上述(1)和(2)中的患者可用本发明的试剂盒及方法预测癌症的发生或感染癌症的危险，并进行更精确的医学检查，其有助于在早期诊断癌症。
发明背景
早期癌症的检测对治愈癌症是最重要的。在多数情况下，由癌症产生的主观症状是在癌症恶化后才显现出来的。而通常医院中进行的癌症医学检查对普通人来说是不太容易的，因此难以在早期发现癌症。因此需要一种以简单且容易的方式预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，以使普通人可以方便的对癌症的发生和在癌症发展早期阶段进行自检。
.为了开发一种简单且容易的方法诊断和治疗癌症，免疫学家尝试寻找肿瘤特异性移植抗原(TSTA)。然而，由于肿瘤来源于人的正常细胞的特征事实，因此，除了某些恶性上皮癌外，TSTA未被鉴定。同时，也尝试使用肿瘤相关移植抗原(TATA)，例如，α—甲胎蛋白(AFP)及存在于正常细胞中但在肿瘤细胞中增加的癌胚抗原(CEA)来诊断癌症。但是，TATA的过量表现仅在肿瘤恶化后才产生。因此，用TATA诊断肿瘤的方法对癌症的早期诊断作用不大。
半乳糖凝集素(Galectin)是一种β-半乳糖苷结合凝集素，存在于多数植物与动物中，包括海绵动物(poriferan)，线虫，哺乳动物(mammamlia)等，并对动物细胞外基质(ECM)的层粘连蛋白具有高亲和性，并且已知与肿瘤转移密切相关[26，27]。另外，也已知半乳糖凝集素与细胞的生长和转化，以及肿瘤的转移密切相关。迄今为止，已鉴定出9种半乳糖凝集素，形成一个半乳糖凝集素家族。半乳糖凝集素的分子量为14-36kDa，以单体或二聚体形式存在。半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3及半乳糖凝集素-8存在于各种内脏器官中，而半乳糖凝集素-2，半乳糖凝集素-4，半乳糖凝集素-5及半乳糖凝集素-7存在于特异的内脏器官或细胞中[2，10，15，17，25]。
半乳糖凝集素-3也称为CBP-35，Mac-2，εBP，RL-29，L-34，L-31等，由Ho和Springer[12]在巯基乙酸盐活化的巨噬细胞中发现，是一种分子量约为26-32kDa的蛋白质[27]。半乳糖凝集素-3与细胞的生长，分化，恶性退化及胚胎形成相关，而且也与IgE介导的细胞超敏反应相关，并在细胞-细胞之间及细胞-基质之间的连接中起重要作用。半乳糖凝集素-3促进人Jurkat-T细胞中钙离子的吸收[8]，并与T细胞的凋亡相关[29]。半乳糖凝集素-3可以核糖核蛋白(RNP)/半乳糖凝集素-3复合体的形式存在，作用于前体-mRNA底物及RNA剪接过程[7]。
也已知半乳糖凝集素-3在无信号肽的条件下从细胞中释放出来[31]。白介素-1(IL-1)和成纤维细胞生长因子(FGF)是与其具有相同释放特性的生物物质，但仍没有鉴定出确切的释放机制。该释放特性与真核细胞中一般的可溶性蛋白有很大不同。
已知半乳糖凝集素-3蛋白与恶性肿瘤密切相关，存在于结肠癌，皮肤癌，甲状腺癌，乳腺癌等中[5，6，9，14，18，19，20，23，24，28]。但在胃癌领域的研究比结肠癌，肺癌，乳腺癌及恶性黑素瘤的研究少得多。半乳糖凝集素-3在正常肝细胞中不出现，但在肝癌和心肌硬变中出现[13]。已知对甲状腺癌来说，半乳糖凝集素-3的出现可作为癌症手术前的标志物[20]。对胃癌而言，已报道半乳糖凝集素-3在正常胃组织中不出现，但在胃癌中出现[30]。总之，先前的研究表明半乳糖凝集素-3的出现与恶性肿瘤密切相关。但仍没有阐明半乳糖凝集素-3与肿瘤发展，特别是胃癌发展的确切关系。另外，也没有关于应用半乳糖凝集素-3预诊和/或诊断癌症发生或感染癌症危险的报道。
发明概述
综上所述，本发明人鉴定了半乳糖凝集素-3的出现与肿瘤发展的关系，发现半乳糖凝集素-3在肿瘤发展的前期或初始阶段—良性肿瘤或慢性炎症和胃炎阶段是过量出现的。因此，本发明涉及利用肿瘤发展前期阶段及初始阶段半乳糖凝集素-3过量出现的简单且容易的方法。
因此，本发明的一个目标是提供在肿瘤发展前期阶段及初始阶段，通过测定血液中半乳糖凝集素-3的浓度诊断和/预诊癌症发生或感染癌症的风险的方法和试剂盒，半乳糖凝集素-3在作为恶性肿瘤(癌)前期或初始阶段的良性肿瘤(腺瘤)或慢性炎症阶段是过量出现的。根据本发明中的试剂盒和方法检测癌症发生或感染癌症危险的用户可到医院进行更精确的医学检查，其导致进行癌症地早期和精确诊断。
换句话说，依照本发明的试剂盒和方法有助于用户在肿瘤发展初始阶段自检其感染癌症的危险，从而有助于在肿瘤发展的早期及早发现癌症，特别是胃癌。因此，本发明的另一个目标是提供对没有主观症状的用户诊断和/或预诊癌症发生的方法和试剂盒。
为了达到以上及其他优势，本发明提供了诊断和/或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，包括以下步骤：通过将血液样品与半乳糖凝集素-3的单克隆抗体反应测定血液样品中半乳糖凝集素-3的浓度；将测定的半乳糖凝集素-3浓度与正常人血样品中半乳糖凝集素-3浓度进行比较；如果测定浓度比正常人血中半乳糖凝集素-3的浓度高，则预诊为感染癌症的危险。
本发明也提供诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，包括以下步骤：制备具有反应部分，样品注射部分及提供从样品注射部分通过反应部分的通道的膜的检测条，其中半乳糖凝集素-3的捕获抗体或半乳糖凝集素-3固定在反应部分；将包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血液样品通过膜从样品注射部分转移到反应部分；根据反应部分颜色的变化预诊感染癌症的危险。
本发明进一步提供诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的试剂盒，包括具有反应部分，样品注射部分及提供从样品注射部分到反应部分的样品通道的膜的检测条，其中反应部分包括固定于其上的半乳糖凝集素-3的捕获抗体或半乳糖凝集素-3，使得当包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血样品通过膜从样品注射部分转移到反应部分时，可根据血样品中半乳糖凝集素-3的浓度测定反应部分的颜色。
本发明进一步提供诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的试剂盒，包括：一种用于固定血样品中半乳糖凝集素-3的微量培养板；一种与固定在微量培养板上的半乳糖凝集素-3反应以诱导微量培养板颜色变化的单克隆抗体。
本发明进一步提供诊断或预诊癌症发生或感染癌症危险的方法，包括以下步骤：测定在作为恶性肿瘤发展初始阶段的腺瘤或慢性炎症阶段出现的癌症筛查抗原；通过将血样品与癌症筛查抗原的单克隆抗体反应测定血样品中癌症筛查抗原浓度；将测定的癌症筛查抗原浓度与正常人血样品中癌症筛查抗原浓度进行比较；如果测定浓度实质上高于或低于正常人血液中癌症筛查抗原浓度，则预诊感染癌症的危险。
参考以下详细描述，并结合相应附图及照片，如同更容易理解，更完整地理解本发明及其很对附带的优势将相当明显，其中：
图1A所示的是由正常细胞环绕的奥厄巴赫氏神经丛处半乳糖凝集素-3出现的显微照片(放大比例：200)；
图1B所示的是半分化指环状细胞处半乳糖凝集素-3纯现的显微照片(放大比例：200)；
图2A所示的是肠组织转化处半乳糖凝集素-3出现的显微照片(放大比例：100)；
图2B所示的是管状癌处半乳糖凝集素-3出现的显微照片(放大比例：200)；
图3所示的是分化良好的肿瘤组织及半分化指环状细胞处半乳糖凝集素-3出现的显微照片(放大比例：200)；
图4所示的是根据半乳糖凝集素-3出现的程度得到的5年存活比例的图表；及
图5所示的是正常人，胃癌患者及慢性胃炎患者血液中半乳糖凝集素-3的浓度的图表。连续稀释的血样品中半乳糖凝集素-3的浓度以通过ELISA方法测定的吸收值表示。在图5中，x轴代表血样品的稀释比例，y轴代表490nm处的吸收值。图5中每个标记均以平均值±标准偏差的方式表示。
图6是形成依照本发明一个实施方案的试剂盒的检测条的平面图。
为了更好的理解本发明，对以下内容及后附的权利要求进行详细描述。
本发明提供了在肿瘤发展前期或初始阶段诊断或预诊癌症发生或感染癌症的危险的方法，所述例如胃癌，肝癌，甲状腺癌等。迄今为止，癌症的诊断均是通过测定存在于正常细胞中，但在肿瘤细胞中增加的肿瘤相关移植抗原(TATA)的浓度进行的。但是，TATA的过量出现仅在肿瘤恶化后，即在肿瘤发展初始阶段之后才发生。因此，用TATA诊断肿瘤的方法对癌症的早期诊断帮助不大。
相反，本发明涉及一种早期诊断癌症发展的新概念。根据本发明的方法，用恶性肿瘤(癌)发展前在血液中过量出现的抗原来诊断和/或预诊感染癌症的危险，而不是用癌症发展后过量出现的抗原进行诊断。本发明中所用的抗原定义为癌症筛查抗原(CSA)。
本发明也提供一种利用癌症筛查抗原(CSA)的特性，可使普通用户在癌症发展早期阶段并以简单且容易的方式诊断和/或预诊癌症发生的试剂盒，所述癌症例如胃癌，肝癌，甲状腺癌等，优选胃癌。根据本发明，合适的癌症筛查抗原是半乳糖凝集素-3。半乳糖凝集素-3在正常组织，例如正常胃组织，肝组织及甲状腺中不出现，但在作为恶性肿瘤(癌)前期阶段的良性肿瘤(腺癌)或慢性炎症阶段过量出现。因此，半乳糖凝集素-3可用于早期诊断胃癌。另外，由于肝癌及甲状腺癌与胃癌具有相同的特征，因此半乳糖凝集素-3也可用于早期诊断肝癌及甲状腺癌。
利用半乳糖凝集素-3预诊肿瘤，例如胃癌发生的方法包括以下步骤：获得用户血样品，通过抗原—抗体反应测定血样品中半乳糖凝集素-3浓度，将测定的半乳糖凝集素-3浓度与未处于良性肿瘤(腺瘤)，慢性炎症或恶性肿瘤(癌)阶段的正常人血液中半乳糖凝集素-3浓度进行比较。半乳糖凝集素-3在正常血液中不出现，但在作为癌症前期阶段的腺癌或慢性炎症阶段是过量出现，并且在癌症阶段维持过量出现。因此，如果用户血样品中半乳糖凝集素-3浓度高于正常人，则该用户可能处于疾病初始或前期阶段，并很有可能感染肿瘤。
由于根据本发明的方法是通过测定血样品中半乳糖凝集素-3的浓度来诊断癌症，而不是直接检测胃，肝及甲状腺组织，因此对癌症的特异类型，例如胃癌，肝癌及甲状腺癌的区别可能不全面。但如果检测结果为阳性，则用户可进行更精确的医学检查，其导致早期和精确诊断癌症。
根据本发明的方法，诊断肿瘤的第一步是通过将血样品与半乳糖凝集素-3单克隆抗体反应，测定血样品中半乳糖凝集素-3浓度。血样品中半乳糖凝集素-3浓度可通过免疫检测方法进行测定，优选地通过利用抗原—抗体反应的酶联免疫检测方法进行测定。
对使用作为酶联免疫检测方法之一的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来说，是将血样品中的抗原(半乳糖凝集素-3)固定在固相上。例如，抗原包被在固相，例如微量培养板上。优选地，在固定前用缓冲液以32-256的稀释比例稀释血清样品。抗原固定后，对固相进行洗涤和封闭。
然后，向固相中加入单克隆抗体(半乳糖凝集素-3的第一抗体，例如M3/38单克隆抗体(大鼠IgG))，与抗原反应，并进行洗涤，然后加入第二抗体(例如，偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗大鼠IgG)，与作为第二抗体抗原的第一抗体反应。优选地，第二抗体用酶进行标记。标记酶的第二抗体与第一抗体结合后，对第二抗体加入着色剂溶液(colorantsolution)，以诱导酶反应及清晰的颜色变化。
终止酶反应后，测定半乳糖凝集素-3与单克隆抗体复合物的光吸收，从而得到血样品中半乳糖凝集素-3的浓度。由于第一抗体，第二抗体，酶及着色剂在本领域中均是已知的，因此本领域中熟练人员可很容易地进行选择，优选地，可以仅使用标记酶的第一抗体，而不用第二抗体。
选择性地，可用一种试剂盒，例如一种与检测怀孕，糖尿病或血液中胆固醇含量的传统试剂盒具有相同构造的免疫色谱检测条测定半乳糖凝集素-3浓度。
该试剂盒具有本领域已知的多种构造。如图6所示，该试剂盒最简单的构造是包括反应部分10，样品注射部分20及提供从样品注射部分20到反应部分10的通道的膜30的检测条100。该检测条100可用具有至少一个用于观察反应部分10及注射样品的窗口的塑料容器进行保护。
在一个实施方案中，半乳糖凝集素-3捕获抗体固定在反应部分10上，包括抗原(半乳糖凝集素-3)及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血样品通过膜30从样品注射部分20转移到反应部分10。在该实施方案中，如果半乳糖凝集素-3在血样品中是过量出现，则更多的半乳糖凝集素-3与偶联金颗粒的示踪抗体反应，从而在反应部分10捕获更大量的抗体—抗原复合物，其导致反应部分10的颜色变化。相反，如果半乳糖凝集素-3在血样品中没有过量出现，则偶联金颗粒的示踪抗体不能与抗原反应，从而不能在反应部分10上被捕获。在这种情况下，反应部分10的颜色不发生变化。因此，用户可以根据反应部分10的颜色变化测定半乳糖凝集素-3浓度。
偶联金颗粒的示踪抗体可直接与血样品混合，并注射到样品注射部分20。选择性地，偶联金颗粒的示踪抗体可以以干燥状态定位于样品注射部分20及反应部分10之间。在后一种情况下，当血样品从样品注射部分20转移到反应部分10时，干燥的偶联金颗粒的示踪抗体与之混合，并与血样品中的半乳糖凝集素-3发生反应。
在另一个实施方案中，半乳糖凝集素-3固定在反应部分10，包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血样品通过膜30从样品注射部分20转移到反应部分10。当包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的示踪抗体的血样品到达反应部分10时，固定在反应部分10的半乳糖凝集素-3和血样品中的半乳糖凝集素-3与偶联金颗粒的示踪抗体发生竞争性反应。因此，如果血样品中的半乳糖凝集素-3过量出现，则固定在反应部分10的半乳糖凝集素-3不能与偶联金颗粒的示踪抗体发生反应。因此，反应部分10的颜色不发生变化。相反，如果血样品中的半乳糖凝集素-3没有过量出现，则固定在反应部分10的半乳糖凝集素-3捕获大量偶联金颗粒的示踪抗体，其导致反应部分10的颜色发生变化。
总之，反应部分10包括固定其上的半乳糖凝集素-3的捕获抗体或半乳糖凝集素-3，使得当包括半乳糖凝集素-3及偶联金颗粒的半乳糖凝集素-3示踪抗体的血样品通过膜30转移到反应部分10时，可根据血样品中半乳糖凝集素-3的浓度测定反应部分10的颜色。
为了清晰地检测反应部分10的颜色变化，可根据传统方法，例如将血样品与氧化剂混合，从而对血样品进行脱色。选择性地，可在样品注射部分20与反应部分10之间形成一个对血样品中有色物质进行过滤的过滤器。优选地，可在样品注射部分20的反向末端在膜30上形成一条传统的控制线40，将控制线40设计为：当血样品到达控制线40时，其颜色发生改变，从而使用户确定检测已完成。
一般来说，甚至正常组织中也包括少量的半乳糖凝集素-3。因此，应对该试剂盒的颜色变化进行控制，以使血样品中半乳糖凝集素-3的浓度比正常血液高时才发生颜色变化。另外，由于半乳糖凝集素-3浓度而产生的颜色变化依赖于样品的稀释比例(参见以下实施例)。因此，应控制样品稀释比例，以使反应部分的颜色对正常血液不发生改变，而对异常血液可发生改变。根据本试剂盒构造可正确控制稀释比例。另外，美国专利5,616,467中公开的任何传统试剂盒的构造均可作为本发明中试剂盒的构造。
为了更详细举例说明本发明的优选实施方案，给出以下实施例。
实施例
1.材料与方法
(1).胃癌组织与血液的制备
从韩国Aju大学医院获得100个胃癌组织切片。100个在1994-1996年间通过病理诊断确诊为胃癌的患者在胃切除术期间收集组织切片。组织切片包括晚期癌，早期胃癌(EGG)，癌症前期损伤及正常胃粘膜组织。正常外周血从随机挑选的正常人中获得，胃癌或胃炎患者的外周血从韩国Aju大学医院及天主教大学文森医院(Catholic University Vincent Hospital)获得。
(2).胃癌组织中半乳糖凝集素-3蛋白的免疫组化染色
为了除去制备切片中的石蜡及水化切片，将组织切片浸泡在二甲苯溶液中5分钟，浸泡过程重复进行3次。然后将切片依次浸泡在100％乙醇溶液，另一个100％乙醇溶液，90％乙醇溶液，80％乙醇溶液及70％乙醇溶液中，每次浸泡5分钟。然后将切片在蒸馏水中浸泡10分钟，在3％过氧化氢溶液中浸泡5分钟，并用含1％Triton X-100的PBS洗涤3次，每次5分钟。洗涤后的切片转移到湿润的容器中以防止非特异性结合反应，并用10％正常山羊血清处理，在室温下反应30分钟。
反应完成后，将产M3/38单克隆抗体(大鼠IgG，第一抗体)的细胞株培养上清加到湿润的容器中，并在4℃过夜反应，用含1％Triton X-100的PBS洗涤3次，每次5分钟。用含3％BSA的PBS以1∶800的稀释比例稀释作为第二抗体的偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗大鼠IgG(Pierce co.)，并加到湿润的容器中，室温下反应1小时，并用含1％Triton X-100的PBS洗涤3次，每次5分钟。然后将组织与3，3’-二氨基联苯胺(DAB)进行反应，洗涤，染色，以Harris’苏木精作为对照，并进行脱水。
(3).外周血中半乳糖凝集素-3浓度的测定
外周血中半乳糖凝集素-3浓度通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)如下。
分别用100μl含有等量0.5M碳酸盐和0.5M碳酸氢盐(pH＝9.6)的缓冲液包被两块96孔板。然后用50μl缓冲液和50μl含有抗原(半乳糖凝集素-3)的血样品分别包被96孔板的一个。将混合物均匀混合，并将100μl混合物转移到第二个96孔板中，以使样品稀释2倍。重复进行稀释过程，将混合物稀释2048倍，在某些实验中，稀释到131072倍。
稀释的混合物在4℃过夜反应，从而将抗原(半乳糖凝集素-3)包被到96孔板上。然后包被的抗原用洗液(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次，并用含3％BSA的PBS进行封闭，在37℃培养1小时。然后对微量培养板进行洗涤。
然后，向包被的抗原中加入第一抗原。详细地，制备的半乳糖凝集素-3单克隆抗体用具有下述组成的EIA缓冲液以1∶1稀释比例进行稀释，并接种到微孔中(100μl/孔)，37℃温育2小时，洗涤。
<EIA缓冲液组成(100ml)>
0.01M tris-HCl缓冲液  75ml
Tween-20              0.1ml
胎牛血清              25ml
EDTA                  200mg
硫柳汞                5mg
然后用第二抗体进行反应。详细地，山羊抗大鼠IgG-HRP以1∶1,500稀释比例进行稀释，并接种到微孔中(100μl/孔)，37℃温育2小时，洗涤。第二步是向孔中接种色原溶液(100μl/孔)。同时制备储液，以使OPD终浓度为0.5mg/ml，OPD底物的缓冲液由0.05M柠檬酸钠及0.05M Na2HPO4(pH 5.0)组成。通过混合1ml OPD储液(邻苯二胺储液)，9ml OPD缓冲液及3.3μl30％H2O2制备HRP底物，混合物在室温温育1小时。然后加入2.5M H2SO4(50μl/孔)终止反应，测定490nm处板的光吸收。
(4).病理解释
以胃部奥厄巴赫氏神经丛中半乳糖凝集素-3的出现作为对照。根据以下标准解释病理诊断。
(-)：半乳糖凝集素-3不出现
(1+)：半乳糖凝集素-3在少于5％的肿瘤细胞中出现
(2+)：半乳糖凝集素-3在5-50％的肿瘤细胞中出现
(3+)：半乳糖凝集素-3在多于50％的肿瘤细胞中出现
(5).分组及统计学分析
根据半乳糖凝集素-3的出现，将上述四个标准分为如下2组，以对病理参数进行比较。
A组：3+
B组：-，1+，2+
通过Chi-square检测法分析两组之间根据UICC分类方法确定的病理参数，例如侵入深度，淋巴结转移数目及TNM阶段，并用Kaplan-Meier法测定根据半乳糖凝集素-3出现而得到的两组的存活比例。当P值小于0.05时，认为该数据是统计学上有意义的。
2.结果
(1).免疫组化染色
由奥厄巴赫氏神经丛处半乳糖凝集素-3的出现(参见图1A和1B)清楚表明半乳糖凝集素-3在正常细胞中很少出现，仅有少量半乳糖凝集素-3在粘膜颈部出现。如图2A和2B所示，半乳糖凝集素-3在作为肿瘤前期阶段的肠组织转化阶段更强烈出现。如图3所示，半乳糖凝集素-3在肿瘤组织中广泛出现，但出现程度随细胞的分化程度而增加。因此，细胞分化阶段的出现程度高于恶性肿瘤阶段的出现程度。
(2).根据半乳糖凝集素-3的出现对两组进行的比较
100个胃癌患者中包括72个男性及28个女性，平均年龄为53.7(年龄范围为27-78)。其中64个人划分到A组，36个人划分到B组。对两组的病理参数进行比较，结果如表1所示。对B组而言，肠型和弥散型(diffuse type)的数目几乎相同，但对A组而言，肠型的数目大于弥散型的数目(p＜0.05)。对侵入深度而言，在两组中T3的比例均是最大的(p＜0.05)，淋巴结转移数目的范围为1-6(p＜0.05)
在I-IV阶段中，阶段III的比例是最大的，但P值大于0.05，因此认为该检测结果没有统计学意义。
表1：根据半乳糖凝集素-3的出现分组患者的病理分析病理参数A组数目(％)B组数目(％)P值Lauren肠型52(81.3)17(47.2)＜0.05弥散型12(18.8)19(52.8)侵入深度T18(12.5)3(8.3)＜0.05T26(9.4)7(19.4)T350(78.1)23(63.9)T40(0)3(8.3)阳性LNs数目017(26.6)3(8.3)＜0.051-622(34.4)20(55.6)7-1514(21.9)10(27.8)多于1611(17.2)3(8.3)阶段I8(12.5)3(8.3)0.648II16(25.0)6(16.7)III29(45.3)20(55.6)IV11(17.2)7(19.4)
A组半乳糖凝集素-3出现程度(n＝64)：3+
B组半乳糖凝集素-3出现程度(n＝36)：-，1+，2+
图4所示的是根据半乳糖凝集素-3出现而得到的5年存活比例，A组的5年存活比例是64.06％，B组的5年存活比例是63.89％(p值＝0.9153)。因此，发现半乳糖凝集素-3的出现与患者的预期生命时间无关。
(3).外周血中半乳糖凝集素-3的检测
分别从正常人，慢性胃炎患者，良性肿瘤患者及胃癌患者组中获得外周血。测定半乳糖凝集素-3浓度，结果如图5所示。如图5所示，慢性胃炎，良性肿瘤及胃癌组中半乳糖凝集素-3的出现比正常人的高。因此，半乳糖凝集素-3可更有效地用作预测癌症或预诊抗原，而不是用作癌症诊断试剂。出现的分辨能力在血样品稀释100倍时最大。
3.讨论
从上述实验中，测定了肿瘤发展各阶段半乳糖凝集素-3的出现程度，并发现了其与肿瘤发展的关系。总结来说，半乳糖凝集素-3在正常细胞中很少出现，但在作为肿瘤前期阶段的肠组织转化及腺瘤阶段强烈出现。实验中获得的最出人意料的结果是半乳糖凝集素-3在肠组织转化和腺瘤阶段的出现比在肿瘤阶段更强烈。半乳糖凝集素-3的出现在分化的肿瘤细胞中比在未分化的肿瘤细胞中更强烈。这表明半乳糖凝集素-3的出现在肠组织转化和腺瘤初始阶段开始增加，在肠组织转化和腺瘤阶段达到最大，并在肠组织转化和腺瘤发展为肿瘤时仍得到维持。
从病理参数的分析发现，半乳糖凝集素-3的出现与侵入深度及淋巴结转移数目相关性不大。该结果与乳腺癌的研究结果类似，但与半乳糖凝集素-3的出现与恶性肿瘤发展密切相关的结肠癌，肺癌，黑素瘤等的研究结果不同。从胃癌实验发现，半乳糖凝集素-3的出现与患者的存活比例相关性不大(p＝0.9153)，这表明半乳糖凝集素-3作为恶性肿瘤特异诊断标志物并不如此有效。
然而，在本发明中，半乳糖凝集素-3主要用作肠组织转化和腺瘤，而不是恶性肿瘤的诊断试剂。由于半乳糖凝集素-3主要在胃癌发展的前期或初始阶段出现，因此期望半乳糖凝集素-3在癌症发展的初始或中间阶段起作用。因此，半乳糖凝集素-3的出现可用作胃癌早期预诊及感染胃癌可能性的筛查标志物。
4.结论
报道了半乳糖凝集素-3的出现在恶性肿瘤，例如结肠癌，甲状腺癌，肺癌及黑色上皮癌中增加，而在乳腺癌中降低。对胃癌而言，报道了半乳糖凝集素-3在正常胃组织中很少出现，而在胃癌组织中有出现[30]。在以上报道中，研究了半乳糖凝集素-3在正常胃组织和胃癌中的出现，但没有阐述癌症发展过程中半乳糖凝集素-3的出现，因此，在以前报道中没有关于使用半乳糖凝集素-3作为抗原对肿瘤进行早期预诊的报道。相反，在本发明中研究了半乳糖凝集素-3在正常组织和血液，胃癌前期阶段，良性瘤初始阶段及恶性瘤恶化阶段的出现，而且发现半乳糖凝集素-3的过量出现可作为恶性肿瘤初始阶段的信号，即用于检测肿瘤发展前期及初始阶段的信号。
在本发明中，仅显示并描述了本发明的优选实施例，但如前所述，可以理解，本发明可以使用各种其他组合和环境，并且可在此处表述的发明主旨的范围内进行修改或修饰。
参考文献
1.Barondes，S.H.，Cooper，D.N.W.，Gift，M.A.and Leffler，H.：Galectins：structure and function of a large family of animal lectins，J.Biol.Chem.，269：20807-20810，1994.
2.Barondes，S.H.，Castronovo，V.，Cooper，D.N.W.，Cummings，R.D.，Drickamer，K.，Feizi，T.，Gitt，M.A.，Hirabayashi，J.，Hughes，C.，Kasai，K-I.，Leffler，H.，Liu，F-T.，Lotan，R.，Mercurio，A.M.，Monsigny，M.，Pillai，S.，Poirer，F.，Raz，A.，Rigby，P.W.J.，Rini，J.M.and Wang，J.L. Galectins：afamily of animal β-galactoside-binding lectins，Cell，76 597-598，1994.
3.Blaser，C.，Kaufmann，M.，Muller，C.，Zimmermann，C.，Wells，V.，Mallucci，L.and Pircher，H.：β-galactoside-binding protein secreted byactivated T-cells inhibits antigen-induced proliferation of T-cells，Eur.J.Immunol.，28：2311-2319，1998.
4.Bresalier，R.S.，Yan，P-S.，Byrd，J.C.，Lotan，R.and Raz，A.：Expression of the endogenous galactose-binding protein galectin-3 correlateswith the malignant potential of tumors in the central nervous system，Cancer，80 776-787，1997.
5.Bresalier，R.S.，Mazurek，N.，Stemberg，L.R.，Byrd，J.C.，Yunker，C.K.，Nangia-Makker，P.and Raz，A.：Metastasis of human colon cancer is alteredby modifyng expression of the β-galactoside-binding protein galectin-3，Gastroenterology，115：287-296，1998.
6.Castronovo，V.，Van den Brule，F.A.，Jackers，P.，Clausse，N.，Liu，F-T.，Gillet，C.and Sobel，M.E.：Decreased expression of galectin-3 is associatedwith progression of human breast cancer，J.Pathol.，179：43-48，1996.
7.Dagher，S.F.，Wang，J.L and Patterson，R.J.：Identification of galectin-3as a factor in pre-mRNA splicing，Proc.Natl.Acad.，92：1213-1217，1995.
8.Dong，S and Hughes，C.：Galectin-3 stimulates uptake of extracellularCa2+in human Jurkat T-cells，FEBS Letters，395：165-169，1996.
9.Fernandez，P.L.，Merino，M.J.，Gomez，M.，Campo，E.，Medina，T.，Castronovo，V.，Sanjuan，X.，Cardesa，A.，Liu，F-T.and Sobel，M.E.：Galectin-3 and laminin expression in neoplastic and non-neoplastic thyroidtissue，J.Pathol.，181：80-86，1997.
10.Gitt，M.A.，Wiser，M.F.，Leffler，H.，Herrmann，J.，Xia，Y-R.，Massa，S.M.，Cooper，D.N.W.，Lusis，A.J. and Barondes，S.H.：Sequence andmapping of galectin-5，aβ-galactoside-binding lectin，found in rat erythrocytes，J.Biol.Chem.，270：5032-5038，1995.
11.Hermanek，P and Sobin L.H.：TNM classification of malignant tumors，4th ed.Geneva：Union lnternationale Contrele Cancer(UICC)，1987
12.Ho，M-K.and Springer，T.A.Mac-2，a hovel 32,000 Mr mousemacrophage subpopulation-specific antigen defined by monoclonal antibodies，J.Immunol.，128：1221-1228，1982
13.Hsu，D.K.，Dowling，C.A.，Jeng，K.C.G.，Chen，J-T.，Yang，R-Y.andLiu，F-T.：Galectin-3 expression is induced in cirrhotic liver andhepatocellular carcinoma，Int.J.Cancer，81：519-526，1999
14.Irimura，T.，Matsushida，Y.，Sutton，R.C.，Carralero，D.，Ohannesian，D.W.，Cleary，K.R.，Ota，D.M.，Nicolson，G.L. and Lotan，R.：Increasedcontent of an endogenous lactose-binding lectin in human colorectalcarcinoma progressed to metastatic stages，Cancer Res.，51：387-393，1991
15.Leffler，H.and Barondes，S.H.：Specificity of binding of three solublerat lung lectins to substituted and unsubstituted mammalian β-galactosides，J.Biol.Chem.：261：10119-10126，1986
16.Lotan，R.，Ito，H.，Yasui，W.，Yokozaki，H.，Lotan，D.and Tahara，E.：Expression of a 31 kDa lactoside-binding lectin in normal human gastricmucosa and in primary and metastatic gastric carcinomas，Int.J.Cancer，56：474-480，1994
17.Madsen，P.，Rasmussen，H.H.，Flint，T.，Gromov，P.，Kruse，T.A.，Honore，B.，Vorum，H.and Celis，J.E.：Cloning，expression and chromosomemapping of human galectin-7，J.Biol.Chem.，270：5823-5829，1995
18.Marer，N.L.and Hughes，R.C.：Effects of the carbohydrate-bindingprotein galectin-3 on the invasiveness of human breast carcinoma cells，J.Cell.Physiol.，168：51-58，1996
19.Ohannesian，D.W.，Lotan，D.，Thomas，P.，Jeesup，J.M.，Fukuda，M.，Gabius，H-J.and Lotan，R.：Carcinoembryonic antigen and otherglycoconjugates act as ligands for galectin-3 in human colon carcinoma cells，Cancer Res.，55：2191-2199，1995
20.Orlandi，F.，Saggiorato，E.，Pivano，G.，Puligheddu，B.，Termine，A.，Cappia，S.，Giuli，P.D.and Angeli，A.：Galectin-3 is a presurgical marker ofhuman thyroid carcinoma，Cancer Res.，58：3015-3020，1998
21.Perrillo，N.L.，Marcus，M.E.and Baum，L.G.：Galectins：versatilemodulators of cell adhesion cell proliferation and cell death，J.Mol.Med.，76：402-412，1998
22.Raimond，J.，Roulex，F.，Monsigny，M.and Legrand，A.：The secondintron of the human galectin-3 gene has a strong promoter activitydown-regulated by p53，FEBS Letters，363：165-169，1995
23.Sanjuan，X.，Fernandez，P.L.，Castells，A.，Castronovo，V.，Van DenBrule，F.，Liu，F-T.，Cardesa，A.and Campo，E.：Differential expression ofgalectin-3 and galectin-1 in colorectal cancer progression，Gastroenterology，113：1906-1915，1997
24.Schoeppner，H.L.，Raz，A.，Ho，S.B.and Bresalier，R.S.：Expression ofan endogenous galactose-binding lectin correlates with neoplastic progressionin the colon，Cancer，75：2818-2826，1995
25.Sparrow，C.P.，Leffler，H.and Barondes，S.H.：Multiple solubleβ-galactoside-binding lectins from human lung，J.Biol.Chem.，262：7383-7390，1987
26.Woo，H-J.，Lotz，M.M.，Jung，J.U.and Mercurio，A.M.：Carbohydrate-binding protein 35(Mac-2)，a laminin-binding lectin，formsfunctional dimers using cysteine 186，J.Biol.Chem.，266：18419-18422，1991
27.Woo，H-U.，Shaw，L.M.，Messier，U.M.and Mercurio.A.M.：Themajor non-integrin laminin binding protein of macrophages is identical tocarbohydrate binding proein 35(Mac-2)，J.Biol.Chem.，265：7097-7099，1990
28.Xu，X-C.，EI-Naggar and Lotan，R.：Differential expression ofgalectin-land galectin-3 in thyroid tumors，Am.J.Pathol.，147：815-822，1995
29.Yang，R-Y.，Hsu.D.K.and Liu，F-T.：Expression of galectin-3modulates T-cell growth and apoptosis，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：6737-3742，1996
30.Joo，H-G.，and Woo，H-J.：Studies on the expression of galectin-3 ingastric cancer，Kor.J.Immunol.，18：583-590，1996
31.Woo，H-J.：Secretion of macrophage differentiation antigen，Mac-2，Kor.J.Immunol.，15：61-68，1993