内皮一氧化氮合成酶基因与原发性高血压的相关性 【技术领域】
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及内皮一氧化氮合成酶基因(endothelial nitric oxide synthase，NOS)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。
背景技术
高血压是指收缩压或舒张压升高的一组临床症侯群。血压的升高与冠心病、肾功能障碍、高血压心脏病及高血压并发脑卒中的发生存在明显的因果关系。高血压最新的诊断标准是收缩压≥19kpa(140mmHg)或舒张压≥12kpa(90mmHg)，符合其中一项者可确诊为高血压。
大多数的高血压患者在血压升高早期仅有轻微的自觉症状，如头痛、头晕、失眠、耳鸣、烦燥、工作和学习精力不易集中并容易出现疲劳等。随着病情的发展，特别是出现并发症时，症状逐渐增多并明显，如手指麻木和僵硬、多走路时出现下肢疼痛，或出现颈背部肌肉酸痛紧张感。当出现心慌、气促、胸闷、心前区疼痛时表明心脏已受累，出现夜间尿频、多尿、尿液清淡时表明肾脏受累、肾小动脉发生硬化。如果高血压患者突然出现神志不清、呼吸深沉不规则、大小便失禁等提示可能发生脑出血，如果是逐渐出现一侧肢体活动不便、麻木甚至麻痹，应当怀疑是否有脑血栓的形成。
高血压早期无明显异常体征出现。当脑、心、肾等重要器官出现轻度损害时可有异常的体征出现。常见的心脏异常表现有心尖搏动左移、心前区有抬举样搏动感，听诊心尖区第一心音增强、主动脉瓣区第二心音增强且有收缩期杂音和舒张期杂音，表明已发生动脉硬化和左心室肥厚，如果在心尖区听及奔马样心律可能表明有心力衰竭的出现。另外还常见耳垂出现折痕、毛细血管搏动、桡动脉出现硬脉或无脉及下肢间歇性跛行等。
此外，由于某些诱发因素或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，同时伴有脑、心、肾、视网膜等重要器官功能损害，严重危及生命，出现一系列临床特殊征象，称为高血压急症。高血压急症的发病率占高血压人群的5％，常见有高血压脑病、脑出血、急性左心衰竭、可乐宁急性停药综合征、急性心肌梗塞、急进型恶性高血压等。
高血压患者中约5％左右无自觉症状，也不知道血压何时升高，更不知道什么时候已产生了血管和器官损害地并发症，有些患者甚至在发生了心血管意外之后才知道自己患有高血压。所以，找出高血压发病的遗传原因，及早的进行预防以及检测，可以有效控制高血压的发病，将疾病对人体的伤害减到最小。
原发性高血压(essential hypertension，EH)也叫高血压病，是一种独立的疾病，有着自己的病因、发生发展转归的规律和临床表现。临床上主要表现为动脉血压的升高。占人群高血压患者的90％以上，目前发病机理尚未完全明了，主要依据排除了其他疾病导致的高血压后才能诊断为原发性高血压(高血压病)。动脉血压的升高主要是因外周小动脉阻力增高所致，同时有不同程度的血容量和心输出量的增加。晚期常导致心、脑、肾等脏器受累发生高血压心脏病、心力衰竭、肾功能障碍、脑出血等严重并发症。原发性高血压的治疗主要是降低血压同时防止并发症的发生。原发性高血压患者致死原因为脑血管意外、心血管意外和肾功能不全，我国以脑血管意外为多见，心力衰竭和尿毒症次之，而欧美国家以心力衰竭多见，脑血管意外和尿毒症次之。
原发性高血压作为最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。
虽然已有许多关于各种基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实NOS基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实NOS基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。
综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压的方法及检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。
本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：
检测该个体的NOS基因、转录本和/或蛋白，并与正常的NOS基因、转录本和/或蛋白相比较，
存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。
在另一优选例中，所述的方法中检测的是NOS的基因或转录本，并与正常NOS核苷酸序列比较差异。
在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：
20455位T→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在内皮一氧化氮合成酶基因NOS的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：
(a)用NOS基因特异性引物扩增样品的NOS基因，得到扩增产物；和
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：
20455位T→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。
在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ IDNO：1中第20455位。
在本发明的第三方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增NOS基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第20455位的扩增产物。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：
(a)与SEQ ID NO：1中第20455位的突变结合的探针；
(b)识别SEQ ID NO：1中第20455位的突变限制性内切酶。
在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：
20455位T→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的NOS蛋白以及药学上可接受的载体。
【具体实施方式】
本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了NOS的基因组序列与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：NOS的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在NOS第20455位的SNP(20455位T→G)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为检测高血压的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
NOS基因
内皮一氧化氮合成酶基因(endothelial nitric oxide synthase，NOS)的详细序列可参见登录号为D26607的核苷酸序列(可参见网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO：1所示。
内皮一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，简称为NOS)在内皮细胞中可以将L-精氨酸合成为一氧化氮(NO)，NO对内皮细胞衍生舒张因子(EDRF)的活性有着重要作用(Furchgott and Zawadzki 1980，and Rapoport andMurad 1983)。EDRF抑制平滑肌收缩和血小板凝聚，是调节血管舒缩频率和血流量的关键。
内皮型一氧化氮合成酶(也称为eNOS)主要分布于冠状血管及心腔面的内膜，eNOS催化生成的一氧化氮(NO)具有舒张血管、调节血流、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制血小板和白细胞粘附等重要功能，参与了多种疾病的病理生理过程。在该基因第7外显子上，894位碱基G突变成T(G894T)，相应蛋白产物第298位上的谷氨酸则被替换成天冬氨酸(Glu298Asp)，这个位点的突变导致eNOS功能受损，NO产生减少，血管紧张性增高而引起高血压。内皮素2(ET-2)具有强烈的收缩血管和促进血管平滑肌增殖作用，该基因定在核苷酸序列中985位碱基A突变成G(A985G)，高血压严重程度增加。
Rodriguez等人曾经指出，过氧化物酶体增生物激活受体-γ2(Pro12Ala)和内皮氧化氮合成酶(4a/b)基因多态性与原发性高血压有关联(Rodrigue et al.JHypertens.2003 Sep；21(9)：1649-55)。过氧化物酶体增生物激活受体-γ2(PPAR-γ2)属于核激素受体家庭成员，在最近牵涉到的血管生物学研究中，发现PPAR-γ2基因多态性与肥胖症，身体质量指数和糖尿病有关联。内皮氧化氮合成酶(eNOS)(4a/b)基因多态性也会促成冠心病和高血压。为测试是否每一个多态性的差异都与高血压相关，设计了一个235个患有高血压的个体以及223个血压正常的个体的对照研究。通过PCR反应和多重逻辑回归分析，证明了两个分析过的多态性都与高血压有关联，复杂的基因型环境在高血压疾病中有着相互作用。
1997年，在日本Nakayama的研究中指出，在无左心室肥大症状的高血压患者和血压正常者中，NOS中等位基因CA重复片断出现频率有明显不同，p＝0.019(Clin.Genet.51：26-30，1997)。33-重复等位基因在无左心室肥大症状的高血压患者个体中出现频率较高。
本发明人对NOS基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与高血压易感性并不相关，然而关联研究表明20455位T→G却是与高血压易感性关联性非常高的SNP。该SNP位于NOS的第18号内含子中，提示对NOS的转录后的mRNA剪接有影响，进而导致影响NOS蛋白的表达，并最终导致携带者的高血压易感性明显高于正常人群。
基于本发明的新发现，NOS蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗NOS蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进NOS蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人NOS蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人NOS蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人NOS DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人NOS基因产物或片段。较佳地，指那些能与人NOS基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人NOS蛋白的分子，也包括那些并不影响人NOS蛋白功能的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人NOS基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人NOS蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人NOS蛋白功能的抗体以及不影响人NOS蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人NOS基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人NOS基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人NOS蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人NOS蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗NOS抗体是不识别正常NOS但识别突变NOS的抗体，或者识别正常NOS但不识别突变NOS的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。
利用本发明NOS蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与NOS蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明NOS蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。
正常的NOS多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明NOS蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明NOS蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的NOS蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人NOS蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于NOS蛋白的无表达或异常/无活性的NOS蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带NOS基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人NOS基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
本发明还涉及定量和定位检测人NOS蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括例如ELISA等。
一种检测检测样品中是否存在NOS蛋白的方法是利用NOS蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与NOS蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在NOS蛋白。
NOS蛋白的多聚核苷酸可用于NOS蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，NOS蛋白的多聚核苷酸可用于检测NOS蛋白的表达与否或在疾病状态下NOS蛋白的异常表达。如NOS DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断NOS蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用NOS蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测NOS蛋白的转录产物。
检测NOS基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。NOS蛋白突变的形式包括与正常野生型NOS DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用NOS基因特异性引物扩增样品的NOS基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：20455位T→G，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
应理解，在本发明首次揭示了NOS基因的SNP与高血压的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在20455位T→G。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2和3的序列。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第20455位。
由于本发明的SNP与高血压具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期较准确地诊断原发性高血压，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.1研究对象
由于血压是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，必然在分析相关基因时要考虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材料将有助于降低遗传异质性的影响，同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平衡分析，还是从中选取家系进行家系分析，都有助于提高高血压易感基因位点的检测灵敏度。因此在本实施例中选定隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性，奠基者数目比较少的优点)。
在知情同意的基础上随机收集了324个年龄在50岁以上的汉族个体，均来自于安徽省岳西县大别山响肠镇。80％的个体只有6个姓，奠基者数目应该比较少，并且同一性别的个体来自于同一个奠基者。选用的高血压样本要求收缩压不低于140mmHg，舒张压不低于90mmHg，测量血压两次取平均值。
挑选其中的11％位于血压分布的最顶端(37例个体；SBP＞178mmHg)和有7％位于血压分布的最底端的(22个个体；SBP＜104mmHg)共59个个体，通过直接测序的方法进行SNP的检测。
1.2实验方法和结果
1.2.1 DNA提取
用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。
1.2.2 PCR及测序引物的设计
根据GenBank中NOS的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。
表1引物序列表引物名称序列(5′-3′)SEQ ID NO：有义引物gagaatggtggagcaggaaa 2反义引物atgtaccaggcaccaggaag 3
1.2.3 NOS基因的PCR扩增
以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。
结果，获得382bp的扩增产物。
1.2.4 SNP的发现和检测
PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISMTM377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http：//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。
结果，发现存在以下SNP：20455位T→G。
1.2.5 SNP基因分型和关联分析
用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在高血压病人和正常血压对照组中进行分型和关联分析。
等位基因的频率统计出来以后进行卡方检验，通过对血压最高的11％和最低的7％个体数据进行比较，初步确定是否等位基因的频率和血压水平连锁。
结果发现SEQ ID NO：1中20455位的T型SNP在高血压个体中的频率为39.6％，而在低血压人群中的频率为52.4％。两者之间的频率差为12.8％，证实了SEQ IDNO：1中20455位的T/G型SNP与高血压的发生存在着相关性。
实施例2
原发性高血压易感性检测试剂盒
如实施例1所述，SEQ ID NO：1中20455位T→G的突变与高血压疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计NOS基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有：名称序列浓度有义引物SEQ ID NO：2100pmol反义引物SEQ ID NO：3100pmolPCR反应液含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液
抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到lìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出20455位T→G。
检测结果，含20455位T→G的检测对象的高血压易感性高于正常人群。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>复旦大学
上海人类基因组研究中心
<120>内皮一氧化氮合成酶基因与原发性高血压的相关性
<130>040147
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>23142
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
ggatcccatg ccctgcctca ctgggaaggc gaggtggtgg ggtggggtgg ggcctcaggc 60
ttggggtcat gggacaaagc ccaggctgaa tgccgccctt ccatctccct cctcctgaga 120
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gaacaggaca gtctgggagg ctcagaaagg agaccaggat cagagtcggc aggtgaagct 1800
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atatggcaat acttactcca tggggaagta agtttctagc tcacagcaag ccttcaacag 1980
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tgggcgctgc aggtgggatg cgaacttagc ctcgggtcag gggctcagga gctcagcacc 2640
agcagcccct gcagcccagg accctggtct ataaacggag gcacagctcg cctctagctc 2700
ctaaggcatg gggaacgcca gaaggcatgc ggcaggtggg ctgtgagatc gccagtgctg 2760
taacaggggc ctccgggtga catctgggaa ggctgaaagg aaacaaaccc ttcctgatga 2820
ccctatccct ggctcccaac agccccccga gctccccgct aacccagccc ccagaggggc 2880
ccaagttccc tcgtgtgaag aactgggagg tggggagcat cacctatgac accctcagcg 2940
cccaggcgca gcaggtaagg ccggcatgcc ctgtccccat cgtctccagg gaaagggtgg 3000
gtaaggcctg gcctcagatg gggccggaga gggaagctca acccttcttt gaattggtcc 3060
cttgtttcca aaaagaggag aggactggga agaaccagag gagttgaggg acatgcacgg 3120
gacttgggtg accctcagcc tccagcctta cccccaaccc tggctcaaac ttttccccca 3180
tcccacccct gcaccccttt tccccctccc acccctgcac ccttcctccc tctcccccac 3240
cccacccctg ccccccctcc catcccagct ctaaacccct cctccctctc ccccgtccca 3300
cccctaaacc ccacctccct gtccccctct aaacccctcc tccctgtccc cctctaaacc 3360
ccacctccct ctccccatcc cacccctgca cccttcctcc ctctgccccc gtcccacgcc 3420
tgtactcctc ctccctctcc cccgtcacac ccctgcaccc ctcctccctc tccccatccc 3480
atccctgcac ccctcctccc tctgcccccg tcccacccct aaacccctcc tccctctgcc 3540
ccaccccacc cttgcacccc tcctccctct tcccccgtcc cctgcctgca ttcctcctcc 3600
ctctccccat ctcacccctg cacccctctt ccctctccca cccctgcacc cctcctccct 3660
ctccccgtcc caccctgcac tcccgccctc tccagcgtcc cacccctaca cccctcctcc 3720
ctctgcccca ttccacccct gcaccccctc ctccctctgc cccgacccac ccctgcaccc 3780
ctcctccctc tcccccgtcc cacccctgca tccctcctcc ctctgccccg tcccacccct 3840
acacccctcc tccctctccc ccatcccacc cctaaacccc tcctccctct cccctgtccc 3900
atccctgcac ccttcctccc tctccccgtc ccatccctgc acccttcctc cctctccccg 3960
tcccatccct gcacccctcc tccctctgct cccatcccac ccctgcaccc ctcctccctc 4020
tgcccctacc ccacctctgc acccctcctc cttctcccca tcccacccct gcacccctcc 4080
tccctctgcc cctaccccac ccctgcaccc ctcctccttc tccccatccc acctctgcac 4140
ccctcctccc tctcccctct cccacccctg tacccttcct ccttctcccc gtcccacccc 4200
tgcacttctc ctccctctaa cccatcccac ccctgcaccc ttcttccctc tcccccatcc 4260
caccactgca cccctcctcc ctctccccct gttccacccc tgcacccctc ctccctgccc 4320
ccaactccca tcccacccct gcaccctggc ctgtcctgac ctttgcactc cctcgaccca 4380
ggatgggccc tgcaccccaa gacgctgcct gggctccctg gtatttccac ggaaactaca 4440
gggccggccc tcccccggcc ccccggcccc tgagcagctg ctgagtcagg cccgggactt 4500
catcaaccag tactacagct ccattaagag gtgacagctt cccggacgcc acagcctccc 4560
ttgtcccact gaggccccag aaaccccgtg acgaccttcc catgaccccc tcccttccca 4620
gatcctaaca ccacgtgggc ccctcccgcc ctcccccagc acttgcacaa agcctggagg 4680
agggcctccc tgtcccacac aacttcctgc ttgtcccctt cccacccctc tcctccccag 4740
gagcggctcc caggcccacg aacagcggct tcaagaggtg gaagccgagg tggcagccac 4800
aggcacctac cagcttaggg agagcgagct ggtgttcggg gctaagcagg cctggcgcaa 4860
cgctccccgc tgcgtgggcc ggatccagtg ggggaagctg caggtgcggc tggccagcga 4920
ctgagagacc cgggcgctac caaaagggga gcggggtggc ggggcagttc ctaaggcttc 4980
ccgggggctg ggaggtccca aactgtgggg gagatccttg ccttttccct tagagactgg 5040
aaaggtaggg ggactgcccc accctcagca cccaggggaa cctcagccca gtagtgaaga 5100
cctggttatc aggccctatg gtagtgcctt ggctggagga ggggaaagaa gtctagacct 5160
gctgcagggg tgaggaagtc tagacctgct gcaggggtga ggaagtctag acctgctgca 5220
ggggtgagga agtctagacc tgctgcgggg gtgaggaagt ctagacctgc tgcgggggtg 5280
aggacagctg agcggagttc cctgggcggt gctgtcagta gcaggagcag cctcctggaa 5340
aagccctggc tgctgcttct cccccaagag agaaggcttc tcccgccagg ccagtccagt 5400
gcagcccctc acccacaccc actgctaccc cagttcccct gcttcggccc gcaccctccc 5460
tcacacccca gcccacagac tcggggctgg ccttagttac tggaacgcct gtgaccacag 5520
cactaagaga agcaagctgc cccatggggg acttggtccc catggccttg gcctccttca 5580
ccatcactgg ccgccaaaga gtttgaaata aagccacgtg cccagtgaat cccaaaggaa 5640
cctcaactaa aataaaaaca atcctatctg acacttgcct gaccctctaa gtcattcaaa 5700
gctttagctc aacttcgatc catctgagct gccatagtgg accccactca gagctgcgtc 5760
cctcccttga ccccaggttg gtccctgcca ctcccctgcc cctgtcactg acacatgttt 5820
cctcctccct caggcaggag tgggacctcc cagcctcctc ctggggcctc cactcagaat 5880
gtcaggatga gcagggtcct aggaggcctc tggtgcagcc ttcccttccc accatccatg 5940
tgctcaaaga gaatcacccg tcctttcttg aatgccatgg atcatggggg atttgctgcc 6000
cacactccta ggcggcctct tagacatccg ttggtgccta acccaagcat cagtttggca 6060
gaggccgagt ccctcctctg tactggatac caagtcagct tccataggga tggggagaca 6120
cctggcccag ggaggagatg agaagcagcc cggatggtgc tacatatgtc agagagcagg 6180
gcaggaaggg atcagtgtgg ctgccaatgg tcaggagggc gccatggagt gaaccatggc 6240
ccctgcctcc tcaaccaaga agtcctctgg agctgatact caagaccccc cgtctctctc 6300
ctcaccctcc tctcccgctg cctcggctgg ctcaggtgtt cgatgcccgg gactgcaggt 6360
ctgcacagga aatgttcacc tacatctgca accacatcaa gtatgccacc aaccggggca 6420
accttcggtg agtgcccccc accatgccag gccccagcct tcttccccaa ggcagggaag 6480
gcggggctct gaccagctct ttccccatgc gtgccagctc ggccatcaca gtgttcccgc 6540
agcgctgccc tggccgagga gacttccgaa tctggaacag ccagctggtg cgctacgcgg 6600
gctaccggca gcaggacggc tctgtgcggg gggacccagc caacgtggag atcaccgagg 6660
tgggcaccga gggccaccca tgagggtgtc cccaaggtgg agaatgagga aaccagtggg 6720
agaaggctcg ggggatccag gcaggaagag gggagcctcg gtgagataaa ggatgaaaaa 6780
caccaaagga ggggtgcctg ggtggtcacg gagacccagc caatgaggga ccctggagat 6840
gaaggcagga gacagtggat ggaggggtcc ctgaggaggg catgaggctc agccccagaa 6900
ccccctctgg cccactcccc acagctctgc attcagcacg gctggacccc aggaaacggt 6960
cgcttcgacg tgctgcccct gctgctgcag gccccagatg agcccccaga actcttcctt 7020
ctgccccccg agctggtcct tgaggtgccc ctggagcacc ccacgtgagc accaaaggga 7080
ttgactgggt gggatggagg gggccatccc tgagcctctc aagaagggcc tgcaaggggg 7140
tgctgatccc acaccccaac acccccaggc tggagtggtt tgcagccctg ggcctgcgct 7200
ggtacgccct cccggcagtg tccaacatgc tgctggaaat tgggggcctg gagttccccg 7260
cagccccctt cagtggctgg tacatgagca ctgagatcgg cacgaggaac ctgtgtgacc 7320
ctcaccgcta caacatcctg gaggtgaggt gcgggatggg gctcgggcac cgaatgcacc 7380
tgtccaaggc aggagtctgg ctctcactcc atccccaaaa tgccagccac ggggacaatc 7440
agagcaggtc cagggttgcc tcctaaatgg gaactgagga caagctctag aaccactgaa 7500
gcaaaggggt agggggtggc aggggtgtgt gtgggggtgt gagtgggtga gtgtgagagt 7560
gtgggtttct ggggtgtgca gtgggtgaga gtgtgggctt gtggggtgtg tagtgggtgt 7620
gagactgtgg gtttgtaggg gtgggtgagt gtgggtgtgt gggggtaggt gggtgtgggt 7680
ttgtgggtgt gtataggcag tgactgtgag actgtgggtt tgtgggggta ggtgactgtg 7740
ggtttgtggg gtgtgtaggg gtgagtgtgt gtgggtttgt aggggtaggc gagtgtgggt 7800
ttgtggggtg tgtaggggtg agtgtgtgtg agtttgtagg ggtaggcgag tgtgggtttg 7860
tggggtgtgt aggggtgagt gtgtgtgagt ttgtaggggt aggtgagtgt gggtttgtgg 7920
ggtgtgtagg gggtgtgtgt gggcttgtag gggtaggcga gtgtgggttt gtggggtgtg 7980
taggggcgag tgtgagagtg taggtatgtg ggtgtgagtg tggatgtgtg taggcggtga 8040
gtgtgaaatt gtgggtttgt gggggtgggt gggtgtgagt gtgtgggttt gtgggtgggt 8100
gtgggtgtga gtgggtgggt gaggggggca tggggatggg tgtgaacatg tagttgttct 8160
ttcaggcata ggacccatag ctctagagct ttcatcagat tctcaaaggg gaccttgact 8220
cggaaaaggt taagacccat tttagagatg agaaattaaa gcctggagct gaggagcgac 8280
tggcccaaag tccctctctg ctctgaggtg cttcgcaggc aaaaacctga accagccccc 8340
taggcagcca ggcctcccaa tggacaccac tcacctcact ccttccagcc atgtacggga 8400
aacagagata gtctccccac cccacccccg tgatcacctc tgtccctacc gatgccacac 8460
acccttctgc cccaggatgt ggctgtctgc atggacctgg atacccggac cacctcgtcc 8520
ctgtggaaag acaaggcagc agtggaaatc aacgtggccg tgctgcacag ttaccaggtg 8580
cagaggccca gactggccag gaaggcaaag ggtttgcata cgggggcagc aggggcgggg 8640
gatggaggag aggcagccat ttagaaacta gggcaggatt tggacaggca gaagaagttc 8700
cgtagtccca gtgccatggc gcacactggc tgcggttcgg ggacagggca ggtactattc 8760
caggcgctgt catctggtgg cttactgtgt gccagggacc ttgctgttta ctgcatgccc 8820
agtcatgctg attctcaggg catattgggt attgcagttt gtgggacccg ctggatcctg 8880
gaaacaaata ccaggatcaa gggcacacca ggagtcgtag tttgaggaag ccggggcctg 8940
ctgagaattt ctgtgggcta tttggtttgg ggaccaggca tgcagatgct ggagattaga 9000
gctgcttgtt gcatgttgaa cctgcagcat gaccatgcat gatgtggttt ggggtgaggg 9060
tgacattgtg gtttgagggg acacagggtg tgttagatat ggggtaatcg agggcacatg 9120
tggtttgggg tgaccggagt ggtggaggaa gaatgggcga ggtctgtggg tctggtttga 9180
gcctctcccc ctctctctcc cttccagcta gccaaagtca ccatcgtgga ccaccacgcc 9240
gccacggcct ctttcatgaa gcacctggag aatgagcaga aggccagggg gggctgccct 9300
gcagactggg cctggatcgt gccccccatc tcgggcagcc tcactcctgt tttccatcag 9360
gagatggtca actatttcct gtccccggcc ttccgctacc aggtgcccac cctaatggct 9420
ctgccagcct gggcccagct ctaattctaa gcagcccctg gggacctcta acctttcctt 9480
ttctttacct cccctcccaa ccccatcatc tctctgcagc cagacccctg gaaggggagt 9540
gccgccaagg gcaccggcat caccaggaag aagaccttta aagaagtggc caagtgggtc 9600
ccctgggagc cccgctctcc cacacacacc ctgggggccc cactctcccc cacacaccct 9660
gggggaccct gccccagcag tgttctggac ctaccactca gtatcccaaa accctgttgt 9720
gagggggttg gacccttgcc tggggaggcc ctgcctctgt gcacccggga caccctcaca 9780
ccttcctctc ccgcagcgcc gtgaagatct ccgcctcgct catgggcacg gtgatggcga 9840
agcgagtgaa ggcgacaatc ctgtatggct ccgagaccgg ccgggcccag agctacgcac 9900
agcagctggg gagactcttc cggaaggctt ttgatccccg ggtagggctg agcccagggg 9960
agcagggagc tagaaagagg gggctctatc agcatcttca ggggtgccct ggaggacagg 10020
aagtgttaca agtcaggact catgaggaac ccggaaccac aggtgttcag agatcaagtt 10080
ggggcctgaa tcttgcactg ccagggaggc cagagtgagg agggcagggc ctccgggggc 10140
cacagcaccc aggacatctg tcttcccacc cacaggtcct gtgtatggat gagtatgacg 10200
tggtgtccct cgaacacgag acgctggtgc tggtggtaac cagcacattt gggaatgggg 10260
atcccccgga gaatggagag gtgagaactt ccaggaaagg ggctgctggg aatgaggaga 10320
gactcagaat tggagtgact gggcaggaac ctctgcccaa cacacacaca cacacacaca 10380
cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cgccaggatg 10440
gaaagggaga tgctaagaga cccctggagc ctgaaacccc acacaacgta cgctcccagc 10500
ccacccatgt ggctgcctcc ctgcaagcac atttgcttaa ctgcgcgtcc ccaagtcatt 10560
tccattatca gtgcaagttt ttaatacaag gaaggcacat cctggctgac caagaggtta 10620
gactgtgctc gggcactgac aagaaaaaca gggatacgtc actgagggcg gcttctagga 10680
tgcgggtaat gtttcttaat gggatactgg ttacacaggt gtgttcagtt tgtaaaaatc 10740
cacagagctg tacatttaca acatgtacaa cactattcca gcattttatt ttatttgttt 10800
tatttatttt gataacctat ttacgttgcc caggctggcc ttgaactcct agcctcaaga 10860
gatcctcctg ccgcaggctc ctttttcaaa agaagaaatt gagcgctgtt tagatgccaa 10920
catagattaa ataacttcac tttttaaaaa gaaacacaaa gctagagtac catcattgaa 10980
ttccttctct tgcaagctta ggtatctctg aggtgcccca ggctaggctc atttctgagt 11040
cttacctgct ccagcttcta ggtgttaaag gccttattag cactaagtac ttcctcagta 11100
ctcttttttc ttttttcctt tgagacaggg tctcactttg tggcccaggc tggagtgcag 11160
tagtacaatc acggctcact gcagcctcaa cctcctagac tcaagcaatc ctcccacttc 11220
aacctcccaa gtagttggga ctacaggcgc atgccatgat gcctagctaa tttttgtatt 11280
ttttatagag atggggtttc gccatgttgc ccaggctggt ctctaactcc tgggttcaag 11340
caatccacct gcctcggcct cccaaagtgc tgcgattata gacgtgagcc actgcacctg 11400
gcccgcagta tcttaagcaa gttggaatct cgtgaaaccc tttttgctgc cttagtgtcc 11460
gtttcagccc tcattcttac ctaccttttc aagaaaaata gcaccagcaa ttgacttttt 11520
tttagcataa aggtgtatag aacccatata acctacagcc ttcacaaggc atagcacatt 11580
ttcaccaccc tggaaagttc cctcatcagt tcctcacgtg aatcccttcc cagtctgtct 11640
ccctgccaga agtgtctgtc accacagaat agtttcgcct gctctagaac ggcacctaga 11700
tggaagcacg cagtgttgcg gcgtctcctg ctgaggctgt ttttgaggcg cactcgtgtt 11760
gctgcgtgac tcagtatttc actcattctg ctgctgagtg ccgttcattg tgtgaatatc 11820
cccagtttgt ttacccattc tcttgttggt gacacttggg ctgtttccag gtcggggcta 11880
ttatgaataa acctgttatg aacattctgt acccggcttt tgtgggctta tgtttttatt 11940
tctcttgggt aaaacctagg agtagaattg gtaggtcata gggtagatgc atgtttaatc 12000
tttcactttt ttaaaaaata aaactgccag gccaggcgcg gctgctcacg cctgtgatcc 12060
cagcactttg ggaggcccag gtgggtggat cacttgaggt cagaagctca agaccagcct 12120
ggccaacatg gcaaaaccct gtctctacta aaaatacaaa aattagctgg gcatggtggc 12180
gcacgcctat agtcctagct actcaggagg ctaggcggga gaattgcttg aacctgggag 12240
gtggaggttg cagtgagccg agatcacgcc actgcactcc agcctgggtg acagagcaag 12300
aattctactt aaaataaaat acaaataaat aaaataaaac tgtcaaacag caaagcaaat 12360
taaactgccc tttaacatct gtgcagttca atgtatgtta attttatccc aaatttttaa 12420
caaatctagg aatacagctc acagaaaatg gggtatattc actaaaaata aggaatattt 12480
atagcaaatt tgtttgtaat accccacact ggaaacaatt caaatgacca tcgacaaata 12540
ctgataaatt gtggtatatt caagtgccat atcgcactaa gtgtgaacga aacacaacca 12600
cacacaacag tgcaggtgaa tctgaaaaaa tgtgaagaga agaaaaagcc agaccaaaga 12660
atacatactg tactacaggg ttcactttat ataaagttca gaaacaggca gaactaatcc 12720
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cggctcactg caacctccgc ctccccggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag 12960
tagctgggat tacaggtgcc cgccaccatg gccagctaat ttttgtgttt ttagtagaga 13020
cgcgtttcac catgttggcc aggctggtct tgaatccctg acctcagcct cccaaagtgc 13080
tgggattaca ggcgtgagcc accacgccca gccacgggta atgtttctcg atgggatgct 13140
ggttgcacag gtgtgttcag tttgtgaaaa cttacagagt tgtacattta caacatgtgt 13200
gcacctctgg acttgtgttg cacgttgaca aaacattcaa aaatgaaatt caaatcgttc 13260
ttgctaactc tggcgcactt gggaaccagc acccagaggc atctgcagtt gagcaccaga 13320
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agcacaaaca aggccatggt cttctgagga gggcaacctg cacaatgtct gctagtgacc 13440
aggacactgc tgaaggaact gagagtttgt ccacccatga aatccactaa aacaggaaag 13500
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aggccagact gaacaacaca gcgagactcc atctcttcag aaaatttaaa aattaaccaa 13860
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ctttacacat ttctgtaatg tcatttttca aaaacatcag atcgcttttg aaattttcaa 14280
aacaaataaa aattaagtga caaatcaata ataatgagga tcagctggta cagttttaaa 14340
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agccagggct ccaggatgcc ctccattcca ggctgcaatg gcagtccaga cctgcctgct 14640
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aggctcggaa ccccagggat gctggccctc agcccctccc aagggcaggg cctttcctgt 14760
ccagaggcag agaccctgaa gccgtccctg gggctgggtc tgggcctagc ctgtatcccc 14820
agggccctgt gacaaccttg tctttgtcct ctcttgccag gagttataag atccgcttca 14880
acagcatctc ctgctcagac ccactggtgt cctcttggcg gcggaagagg aaggagtcca 14940
gtaacacaga cagtgcaggg gccctgggca ccctcaggtc agggcctcac caagaggggt 15000
gcaacgggtg ggcaagctgc ctgggcaaac gtggcctgca aagggagctc cactgacgac 15060
ccctgcaccc caggttctgt gtgttcgggc tcggctcccg ggcatacccc cacttctgcg 15120
cctttgctcg tgcggtggac acacggctgg aggaactggg cggggagcgg ctgctgcagc 15180
tgggccaggg cgacgagctg tgcggccagg aggaggcctt ccgaggctgg gcccaggctg 15240
ccttccaggt gagcccagcc cagcccctgc tctgactcct gccccctggg atgcctcctc 15300
ctgcctcact ctgccctgat tctgtttggt tctttggtcc cttcctgttc cttccaaaat 15360
ccaccctcat ctctccatgg catagccagc tcttctgggt caggggcaga ggatgacatg 15420
gccctgccga ccacaggggt gcctagccca ggcagaagtg cagccgaaag agagcaggca 15480
gggccctggc aggagggagc ttcagccagg cacaggctgg gcctcacaag tgggcgcaca 15540
aagggagggg gtgcagggca gggcagggga ccccacccag gatgggcagg atggagggag 15600
aaggaaggga cagagagaag gtcagacaga ggcaagggct gaagctgagg ccagcacaga 15660
agccacagga agccagaggc cagacagcct ggggcggtgc ctgcaccaga actggtccgg 15720
gccaggcaag caagcacagg gagaggtgga tccctggggg ctgtggcttt ttaagcctgg 15780
gcttcctcag gggcagtgct gcctgtctgg ggatcatgtc tgcagttgac aagggctcgg 15840
tctccccagt gccacactgt tcagggcagt gctgctgtcc cggggcccag gctggagctc 15900
agcagatttg ccttgattgg aggaggaggg catcctagga ggagagggag tgggggctac 15960
ctcagggacg gggaggtcag gctgcagaaa cacataggcc ctgattggga agaagggaca 16020
cggtaaaata agctctaaaa gaatttaaaa caaaaagagc cattgcagcg ggatgagacc 16080
acatcatcag gttttgggaa taggacttta gaggcgtagg atccattaca gcatcaccga 16140
accagaagca ggaaggctga gctaagcaga gcagcagcag tggagatagg aaggaaggga 16200
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cctcccaggg atctgccccg tggggtcccc tctgccgccc gaattgtgcg tcccttccca 16440
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taagtacggg attcggaatt tgaatgcagg tctgaacaca cagacgcctt cacagagcta 16620
ccgtgtgcca agcactatgc ttctcggatc acgggattaa cacgcaccag ataaggaacg 16680
atgcaccaat caggacgtgc agagaaagag ccagccgggt ccctgggccc agcggccaat 16740
ccatgaaatg ggctggcgga aaaggtgctg tccttggcgc cggcctcagc cactggggct 16800
gccaaccccc caggagcaag acgcagtgaa gccgcccagg cgcctcacta gggcgacccc 16860
tggtggcggg aggtcctcag ccctcaccgg cctgtcccgc aggccgcctg tgagaccttc 16920
tgtgtgggag aggatgccaa ggccgccgcc cgagacatct tcagccccaa acggagctgg 16980
aagcgccaga ggtaccggct gagcgcccag gccgagggcc tgcagttgct gccaggtggg 17040
ccctgcctca ccctaacccg gctggttctc tgaggccccc acaccccggg actaaagcac 17100
tctggggcca ggccctgctc cctagctcag gctgcctcat ttgcccctcc ccgcccccag 17160
gtctgatcca cgtgcacagg cggaagatgt tccaggctac aatccgctca gtggaaaacc 17220
tgcaaagcag caagtccacg tgaggacgac ggctttaccg ccccccaacc cctgtcctga 17280
acaccctgac cctggaccct cctcctccca cattctcccg cccccacccc tctctgactc 17340
cccataagtg cccctctccc cacccccagg agggccacca tcctggtgcg cctggacacc 17400
ggaggccagg aggggctgca gtaccagccg ggggaccaca taggtgtctg cccgcccaac 17460
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tgctgcccac tgccgggctg gccttgttgc tggaccatcc ccacaccctc aaatgcaccc 17760
ccaccaaaag gctgtcccct ccctctgggc tcctctccaa ggctccccta gcaatctagc 17820
ttgctctgga gctggcactg gggctatttg ctgccacatc aatgcctggg ctttatttaa 17880
aataaggggg tggagtcaga ggcagaggag cccagaccaa cccagtccgg ccaggggccc 17940
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