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1、(10)申请公布号 CN 103695433 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103695433 A (21)申请号 201410015297.9 (22)申请日 2014.01.14 C12N 15/115(2010.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明南路 422 号 (72)发明人 杨朝勇 朱玲 邹远 刘如迪 朱志 庄峙厦 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人 马应森 (54) 发明名称 黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 及其应用 (57)。
2、 摘要 黄曲霉毒素B1的核酸适体AFB1-01及其应用， 涉及一种核酸。所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 是通过基于琼脂糖微珠分离 - 流式细胞 术分析的亲和 SELEX 方法筛选制备。所述黄曲霉 毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 富含 G 碱基， 具有茎 环结构， 亲和力高， 稳定性好， 无毒， 易于合成和标 记， 可作为样品中黄曲霉毒素 B1的一种潜在检测 试剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 (10)申。
3、请公布号 CN 103695433 A CN 103695433 A 1/1 页 2 1. 黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 其特征在于其序列如下 ： ATACCAGCTTATTCAATTGCTATCGGTTGGGGGTAGGTGGTGGGTGGTAGTTGGGGCAATGTGAGATAGTAAG TGCAATCT。 2. 如权利要求 1 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 其特征在于其具有一种可能 的茎环结构。 3. 如权利要求 1 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 在制备样品中黄曲霉毒素 B1 检测试剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 10369。
4、5433 A 2 1/6 页 3 黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种核酸， 特别是涉及黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 及其应用。 背景技术 0002 在粮油食品的生物性污染问题中， 真菌毒素的污染是最主要的因素之一， 而黄曲 霉毒素 （Aflatoxins， AF） 是迄今发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。黄曲霉毒素是 由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等产生的一组化学结构类似的次生代谢产物， 具有二呋喃环和氧 杂萘邻酮 （香豆素） 的基本结构， 目前已发现 20 多种， 主要包括 B1、 B2、 G1、 G2、 M1和 M2等。其 中，。
5、 AFB1的毒性最强， 存在量最大， 稳定性也最高， 其毒性为氰化钾的 10 倍、 砒霜的 68 倍， 主要作用于肝脏等器官， 可诱发原发性肝癌、 胃癌和肺癌等， 并于 1993 年被世界卫生组织 癌症研究机构划定为一类致癌物。AFB1广泛存在于土壤和动植物中， 尤其是植物性食物， 如花生、 玉米、 大米、 小麦、 牛奶和各种坚果等。AFB1的理化性质比较稳定， 脂溶性， 耐热， 难以去毒， 对人和动物的健康产生极大的危害。AFB1含量是国际食品卫生和农产品贸易 中的必检指标， 许多国家均制定了其在食品中允许量的国家标准。因此， 对 AFB1开展有 效、 快速、 高灵敏检测具有重要的意义。 （。
6、1.Wogan,G.N.Chemical nature and biological effects of the aflatoxins.Bacteriol Rev1966,30,460-470;2.Shankaran,R.;Raj,H. G.;Venkitasubramanian,T.A.Biochemical changes in liver due to aflatoxin.Br J Exp Pathol1970,51,487-491） 。 0003 目前， 常用的 AFB1检测方法概况起来主要有化学分析法和免疫分析法。化学分析 法主要有薄层层析色谱法 （TLC） 、 高效液相色谱法 （。
7、HPLC） 和微柱法等， 这些常规检测方法 具备了较高的检测灵敏度和准确度， 但存在繁杂的样品前处理、 分离检测耗时、 仪器设备昂 贵笨重而难以实现现场快速分析、 需要专业技术人员等缺点。免疫分析法主要是基于抗黄 曲霉毒素单克隆抗体的高亲和力和高特异性发展的一系列免疫学检测方法， 其中的酶联免 疫吸附法 （ELISA） 灵敏度高、 安全性好、 干扰少， 操作简便快速， 是目前最普遍实用的AFB1的 检测方法。但 AFB1是一种剧毒小分子， 其抗体的制备存在较大困难， 试剂寿命较短难保存， 批间差异也较大等， 这些瓶颈限制了免疫学检测方法的应用范围和快速发展 （3.Jin Hwan Do;Don。
8、g-Kug Choi.Aflatoxins:Detection,Toxicity,and Biosynthesis.Biotechnology and Bioprocess Engineering2007,12,585-593;4.Liu Z.;Gao JAdvances in research on detection methods for aflatoxins.Journal of Anhui Agricultural University2004,31,223-226） 。因此， 面向 AFB1的新型检测试剂和检测方法亟待发展。 0004 核酸适体 （aptamer）是一类新型功能性核。
9、酸分子探针， 基于指数富集配体系 统进化技术 （SELEX）从随机寡核苷酸文库中体外筛选获得， 被誉为 “人工抗体” ， 能与 靶分子高亲和力和高特异性结合， 具有筛选周期短、 化学合成便捷经济且无批量差异、 稳定性高、 易于精确定点修饰等诸多优点， 是潜在的抗体替代物， 在生化分析检测领域 显示出巨大的应用前景。目前， 基于核酸适体的识别与检测方法逐渐成为一种新的 普 遍 适 用 的 技 术 （5.Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.Functional nucleic acid sensors.Chem 说 明 书 CN 103695433 A 3 2/6 页 4 Rev2009,109。
10、,1948-1998;6.Clark,S.L.;Remcho,V.T.Aptamers as analytical reagents. Electrophoresis2002,23,1335-1340） 。核酸适体技术应用于真菌毒素检测分析的生物 传感器正处于积极开发研制中。例如， 赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A， OTA） 和伏马毒素 B1 （Fumonisin B1， FB1） 等多种真菌毒素的核酸适体已经筛选出来， 并发展了多种检测体系 （7.Screening and Initial Binding Assessment of Fumonisin B1Aptamers Int。
11、.J.Mol. Sci.2010,11,4864-4881.8.Determination of Ochratoxin A with a DNA Aptamer. J.Agric.Food Chem.2008,56,1045610461.9.Yang,C.;Wang,Y.;Marty,J.;Yang,X. Aptamer-Based Colorimetric Biosensing of Ochratoxin A using Unmodified Gold Nanoparticles Indicator.Biosens.Bioelectron.2010.10.Kuang,H.;Che n,W.;。
12、Xu,D.;Xu,L.;Zhu,Y.;Liu,L.;Chu,H.;Peng,C.;Xu,C.;Zhu,S.Fabricated Aptamer-Based Electrochemical“signal-Off” Sensor of Ochratoxin A.Biosens. Bioelectron.2010,26,710716） 。因此， 筛选 AFB1的特异性核酸适体并发展核酸适体技 术用于 AFB1的检测新方法具有重要的研究意义和市场应用价值。 发明内容 0005 本发明的第一目的在于提供黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 该核酸适体应用 基于琼脂糖微珠分离 - 流式细胞术分析的。
13、亲和 SELEX 技术筛选获得， 能够高亲和力识别黄 曲霉毒素 B1。 0006 本发明的第二目的在于提供黄曲霉毒素B1的核酸适体AFB1-01在制备样品中黄曲 霉毒素 B1检测试剂中的应用。 0007 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 其序列如下 ： 0008 ATACCAGCTTATTCAATTGCTATCGGTTGGGGGTAGGTGGTGGGTGGTAGTTGGGGCAATGTGAGATAG TAAGTGCAATCT 0009 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 利用 OligoAnalyzer3.1 在线软件模拟其 二级结构， 具有一种可能的茎环结构， 。
14、其茎环结构如下 ： 0010 0011 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01， 与靶分子黄曲霉毒素 B1结合之后形成的 复合物具有荧光偏振响应， 并且黄曲霉毒素 B1本身的荧光会被猝灭， 因此基于荧光偏振技 术或荧光光谱方法， 所述黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 可在制备样品中黄曲霉毒素 B1 检测试剂中应用。 说 明 书 CN 103695433 A 4 3/6 页 5 0012 本发明的优点在于 ： 1） 核酸适体通过基于琼脂糖微珠分离 - 流式细胞术分析的亲 和 SELEX 技术筛选获得， 体外筛选及检测简便快速 ； 2） 核酸适体本身是一段寡核苷酸， 可以 大量化。
15、学合成， 无批量差异， 稳定性好， 易于保存 ； 3） 核酸适体能高亲和力识别黄曲霉毒素 B1， 可与抗体媲美 ； 4） 核酸适体易于定点修饰标记， 应用形式灵活多样， 并且黄曲霉毒素 B1 为有机小分子， 本身具有荧光性质， 两者性质相结合可发展一系列生物传感器， 在检测分析 领域的应用前景广阔。 附图说明 0013 图 1 为 AFB1-beads 的荧光显微镜成像图。图 a 为对照组 Control-beads 的明场成 像， 图 b 为样品组 AFB1-beads 的明场成像， 图 c 为对照组 Control-beads 的荧光暗场成像， 图 d 为样品组 AFB1-beads 的荧。
16、光暗场成像。 0014 图 2 为 AFB1-beads 的荧光光谱扫描图。曲线 a 为样品组 AFB1-beads。曲线 b 为 对照组 Control-beads。 0015 图 3 为流式细胞术监测筛选进程中 DNA 初始文库对于靶分子 AFB1-beads 富集的 荧光偏移图。曲线 a 为空白 AFB1-beads， 曲线 b 为 DNA 初始文库， 曲线 c 为第 4 轮富集库， 曲线 d 为第 6 轮富集库， 曲线 e 为第 8 轮富集库， 曲线 f 为第 11 轮富集库。 0016 图 4 为流式细胞术监测筛选进程中 DNA 初始文库对于反筛分子 COOH-beads 富集 的荧。
17、光偏移图。曲线 a 为空白 COOH-beads， 曲线 b 为 DNA 初始文库， 曲线 c 为第 4 轮富集 库， 曲线 d 为第 6 轮富集库， 曲线 e 为第 8 轮富集库， 曲线 f 为第 11 轮富集库。 0017 图 5 为流式细胞术测定核酸适体 AFB1-01 对靶分子 AFB1-beads 的结合曲线图。 0018 图 6 为黄曲霉毒素 B1与核酸适体 AFB1-01 结合的荧光偏振响应图。a 为空白组自 由 AFB1， b 为对照组随机序列 Random， c 为样品组核酸适体 AFB1-01。 0019 图 7 为黄曲霉毒素 B1与核酸适体 AFB1-01 结合的荧光光谱。
18、扫描图。曲线 a 为空白 组 AFB1， 曲线 b 为对照组随机序列 Random， 曲线 c 为样品组核酸适体 AFB1-01。 具体实施方式 0020 实施例 1 靶标 AFB1-beads 的合成与表征 0021 以琼脂糖微珠作为靶分子的固相载体， 有利于分离未结合或弱结合及非特异性结 合序列， 并且适用于流式细胞术检测。将 AFB1偶联到琼脂糖微珠的合成路线具体如下 ： 0022 说 明 书 CN 103695433 A 5 4/6 页 6 0023 取 7.6mg AFB1溶于 4mL 吡啶， 加入 35mg 羧甲基羟胺盐酸盐， 80回流过夜， 经真 空浓缩和硅胶柱层析 （氯仿 / 。
19、甲醇 =10:1） ， 分离出 AFB1-oxime 并溶于 3mL 无水二氯甲烷， 加入5.4mg NHS、 9.6mg二环己基碳二亚胺和5mg二甲氨基吡啶， 磁转子搅拌过夜， 经过滤和 蒸发浓缩， 获得 AFB1-oxime 活化酯 （11.Chu,F.S.;Hsia,M.T.;Sun,P.S.:Preparation and characterization of aflatox-n B1-1-(O-carboxymethyl)oxime.Journal-Association of Official Analytical Chemists1977,60,791-4.） 。 取0.107。
20、g NHS-beads分散在900L 磷酸氢二钾缓冲液 （50mM， pH9.0） 中， 加入 100L 乙二胺， 磁转子搅拌过夜。离心去上清， 并用 PB 缓冲液 （0.1M， pH8.0） 清洗微珠得到 NH2-beads。将 AFB1-oxime 活化酯溶于 0.8mL DMF， NH2-beads 分散于 0.8mL 磷酸氢二钾缓冲液 （50mM， pH9.0） 中， 两者混合， 磁转子搅拌过 夜， 然后用 50%DMF 和 PB 缓冲液清洗微珠获得 AFB1-beads， 4避光保存。通过荧光光谱扫 描 （Ex ： 365nm ； Em ： 380 600nm） 和荧光显微镜成像对 。
21、AFB1-beads 进行表征 （参见图 1 和图 2） 。 0024 实施例 2 黄曲霉毒素 B1的特异性核酸适体的筛选 0025 （1） 随机寡核苷酸文库的设计与合成 0026 设计并合成两端固定区域为 18 个核苷酸、 中间随机区域为 45 个核苷酸的随机 寡核苷酸文库如下 ： 5-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-N45-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3， 库容量在 1015。所用引物序列分别为正向引物 （FP） ： 5-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3， 反向引物 （RP） ： 5-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3，。
22、 荧光标记引物 （FFP） ： 5-FAM-ATA CCA GCTTAT TCA ATT-3， 生物素标记引物 （BRP） ： 5-Bio-AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3（12. Shangguan,D.;Li,Y.;Tang,Z.;Cao,Z.C.;Chen,H.W.;Mallikaratchy,P.;Sefah,K.;Yang, C.J.;Tan,W.Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancer study.Proc Natl Acad Sci USA2006,103,。
23、11838-11843） 。 0027 （2） 核酸适体的筛选 0028 AFB1-beads 作为靶分子， 水解 NHS-beads 形成的 COOH-beads 作为反筛分子。 0029 取10nmol初始文库溶于200L结合缓冲液 （20mM Tris-HCl， pH8.0， 100mM NaCl， 5mM KCl， 2mM MgCl2， 1mM CaCl2） 中， 95 5min， 冰浴 5min， 室温 30min。次一级文库均使用 200pmol。反筛操作从第三轮开始， 将变性处理的文库与 2L COOH-beads 室温孵育 5min。 其过滤收集液与2L AFB1-beads室。
24、温孵育60min。 使用结合缓冲液清洗微珠， 将结合了DNA 说 明 书 CN 103695433 A 6 5/6 页 7 的AFB1-beads直接进行PCR放大 （使用FP和BRP， 943min ； 9415s ； 5015s ； 7215s ； 72 3min） ， 并用链酶亲和素微珠吸附和经 0.1M 的 NaOH 洗脱得到单链核酸文库， 用于下一 轮筛选。筛选过程逐轮增加筛选强度， 共进行 11 轮。通过流式细胞术检测文库的富集情况 （参见图 3 和 4） 。最后将富集收敛库进行克隆测序 （13.Hu,J.;Wu,J.;Li,C.;Zhu,L.;Zhan g,W.Y.;Kong,G。
25、.;Lu,Z.;Yang,C.J.A G-quadruplex aptamer inhibits the phosphatase activity of oncogenic protein Shp2in vitro.Chembiochem.2011,12,424-430） 。 0030 实施例 3 核酸适体的亲和力表征 0031 将核酸适体分子在 5 端标记羧基荧光素 （FAM） ， 在 200L 结合缓冲液中配制 0-7000nM 梯度溶液， 热变性处理， 与 0.4L AFB1-beads 室温孵育 30min。用结合缓冲液清 洗之后， 悬浮于结合缓冲液中， 用流式细胞仪测定微珠表面荧光强。
26、度。 以荧光强度对核酸适 体浓度作图， 使用公式 Y=Bmax X/(Kd+X) 进行结合曲线的拟合测定核酸适体的结合解离常 数 Kd（参见图 5） 。 0032 实施例 4 荧光偏振与荧光光谱研究核酸适体与黄曲霉毒素 B1间的相互作用 0033 用 结 合 缓 冲 液 （20mM Tris-HCl， pH8.0， 100mM NaCl， 5mM KCl， 2mM MgCl2， 1mMCaCl2） 配制 2M 无标记核酸适体溶液， 进行热变性处理， 95 5min， 冰浴 5min， 室温放 置 30min。然后向其中加入黄曲霉毒素 B1使其终浓度为 0.2M， 并在室温下孵育 30min。 。
27、空白组为相同条件下单独的黄曲霉毒素 B1溶液， 对照组为随机序列 Random。测定各组溶 液体系的荧光各向异性值 （Ex ： 365nm ； Em ： 442nm） ； 对各组溶液体系进行荧光光谱扫描 （Ex ： 365nm ； Em ： 380-650nm） （参见图 6 和 7） 。 0034 结果 0035 实施例 1 按照在 AFB1上加一个羧基， 与 NH2-beads 通过形成稳定的酰胺键的 基本思路进行偶联成功合成 AFB1-beads， 并通过荧光显微镜成像和荧光扫描光谱对其 形貌和偶联含量进行表征。如图 1 所示， 在暗场荧光成像中， 相对于没有经 AFB1修饰 的 Con。
28、trol-beads， AFB1-beads 发出明显的荧光 ； 如图 2 所示， 在 365nm 紫外光照射下， AFB1-beads 在 425nm 处发出荧光， 比 Control-beads 的荧光值高 6 倍左右。由此可知， AFB1-beads 偶联成功。琼脂糖微珠上 AFB1的偶联含量通过基于荧光扫描光谱建立标准工 作曲线进行测定， 估测为 4.5fmol AFB1/beads。 0036 实施例 2 基于琼脂糖微珠分离 - 流式细胞术分析的亲和 SELEX 技术筛选成功获得 能够高亲和力识别黄曲霉毒素 B1的核酸适体。如图 3 所示， 对于正筛靶分子 AFB1-beads， 初。
29、始库没有明显的荧光偏移， 基本上不与AFB1-beads结合， 随着筛选轮数的增加， 第4、 6、 8、 11 轮富集库的荧光偏移逐渐增大， 第 11 轮富集库的荧光偏移强度达到初始库的 300 倍， 说 明富集库中与 AFB1-beads 结合的序列在筛选过程中逐渐富集 ； 如图 4 所示， 对于反筛分子 COOH-beads， 初始库、 第 4、 6、 8、 11 轮富集库都没有明显的荧光偏移， 都不与 COOH-beads 结 合。说明从随机寡核苷酸文库中筛选富集得到了与 AFB1-beads 结合的核酸序列， 因此将第 11 轮富集库送去克隆测序。 0037 实施例3通过流式细胞术测定。
30、了核酸适体对靶分子AFB1-beads的结合能力。 如图 5 所示， 黄曲霉毒素 B1的核酸适体 AFB1-01 的结合解离常数 Kd为 1.540.15M， 具有较高 的亲和力。 0038 实施例 4 通过荧光偏振分析和荧光光谱扫描分析研究了核酸适体与靶分子黄曲 说 明 书 CN 103695433 A 7 6/6 页 8 霉毒素 B1之间的结合相互作用， 因而验证了所述核酸适体可以作为样品中黄曲霉毒素 B1 的一种潜在检测试剂。如图 6 所示， 不存在核酸适体 AFB1-01 时， 自由的黄曲霉毒素 B1由 于其本身是有机小分子， 分子量仅为 312.27g/mol， 转动很快， 测得其荧。
31、光各向异性值约为 0.013 ； 当核酸适体 AFB1-01 存在时， 测得其荧光各向异性值增加到约为 0.046 ； 而当对照随 机序列Random存在时， 其荧光各向异性值约为0.016， 没有明显增加。 由此说明所述核酸适 体与靶分子黄曲霉毒素B1之间的特异结合相互作用。 如图7所示， 在所用缓冲体系条件下， 黄曲霉毒素 B1在紫外光 365nm 照射下， 在 442nm 处发射荧光 ； 当核酸适体 AFB1-01 存在时， 其最大发射波长处荧光值出现了非常显著的降低 ； 而当对照随机序列 Random 存在时， 相应 的荧光值仅稍有降低。由此说明述核酸适体与靶分子黄曲霉毒素 B1结合之后， 荧光猝灭。 说 明 书 CN 103695433 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 103695433 A 9 1/3 页 10 图 1图 2 图 3图 4 说 明 书 附 图 CN 103695433 A 10 2/3 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103695433 A 11 3/3 页 12 图 7 说 明 书 附 图 CN 103695433 A 12 。