莱克多巴胺的亲和层析-酶联免疫检测方法及其专用试剂盒 【技术领域】
本发明属于免疫分析技术领域。具体而言，涉及一种莱克多巴胺(RCT)亲和层析-酶联免疫检测方法及其专用检测试剂盒。
背景技术
莱克多巴胺(Ractopamine)是β2-肾上腺素能激动剂(BAA)成员之一，与“瘦肉精”同属儿茶酚胺类(肾上腺素和去甲肾上腺素BAA)物质。早在本世纪50年代末期就发现，儿茶酚胺类(肾上腺素和去甲肾上腺素)能刺激脂肪组织释放脂肪酸，并增加蛋白质沉积，但直到70年代初期，儿茶酚胺类物质及其类似物改善机体营养调配和胴体组成的能力，才首先由美国氰胺公司研究部所认识。随后便大规模用于畜禽生产以提高瘦肉率，减少脂肪沉积，及增加产奶量等。
BAA用作营养重分配剂的实用性开发研究始于70年代末期。二十几年来，以美国几家大公司和研究室为首，已开发出数百种结构类似药，经过对大鼠、牛、绵羊、猪、禽等的数百次逾万头(只)动物试验，筛选出促生长作用较强的BAA十余种。其中实用型BAA有莱克多巴胺(ractopamine)、克仑特罗(clenbuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、赛曼特罗(cimaterol)、吡啶甲醇类、脱脂BAA。其中菜克多巴胺、克仑特罗、沙丁胺醇因其口服效率高在生产中常用。
据Kuiper(1998)综述，1989年，西班牙中部发生135人因食用含β2-肾上腺素能激动剂残留物的牛肝而集体中毒的事件；1992年西班牙北部又有232人因同样原因而集体中毒；1995年西班牙的巴塞罗那地区发生15起β2-肾上腺素能激动剂中毒事件；1990-1991年，法国里昂地区有8个家庭因食用残留β2-肾上腺素能激动剂的牛肝而集体中毒；1996年，仅意大利就发生62起因食用残留有β2-肾上腺素能激动剂的牛肉和牛肝而集体中毒的事件；中毒症状有肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、肌肉疼、目晕、恶心、呕吐、发烧、战栗。进食40小时后病人尿中仍可检出β2-肾上腺素能激动剂。有心脏病史的人对食物残留β2-肾上腺素能激动剂尤为敏感(尹靖东等，1998)。因此欧盟采取了严密的措施，通过一系列法规条例严格控制莱克多巴胺、克仑特罗进入市场。除特殊情况外任何动物体内有β2-肾上腺素能激动剂残留都是违法的。
目前许多国家对莱克多巴胺提出了最高残留限量，如英国在动物可食性组织的最大残留量为0.5ng/g，荷兰规定肝组织最大残留量为1ng/g(G.A.Mitchell，et al，1998)。而我国也规定为1ng/g(肝组织)或1ng/ml(尿液)。
我国农业部1997年3月[农牧发(1997)]3号文严令禁止β2-肾上腺素能激动剂在动物生产中的应用。但由于资金、技术等方面的原因，滥用β2-肾上腺素能激动剂的行为一直未能得到有效的遏止，2001年，连续发生了广东河源、广东信宜、浙江等地十几起上百人集体中毒的事件。
因此，需建立一种灵敏、特异、操作简单、适于大批量样品筛选的检测方法，才能对莱克多巴胺、克仑特罗类物质的非法使用进行及时、有效的监测。
目前的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。这些仪器分析技术一般耗时，价贵，大批量检测困难，操作繁琐，均不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。
【发明内容】
本发明目的在于提供一种样品前处理简单，灵敏度高，特异性强，快速高效，适于大批量样品筛选地莱克多巴胺检测方法，并开发结构简单，使用方便，价格便宜，便于携带的莱克多巴胺检测试剂盒。
发明人主要采用亲和层析-酶联免疫吸附方法(IAC-ELISA)检测RCT；先利用免疫亲和层析方法将检测样品中的RCT加以富集纯化，再通过酶联免疫吸附方法对其进行定量检测；完成了本发明。
本发明提供了一种利用免疫亲和层析和酶联免疫吸附检测样品中莱克多巴胺RCT的方法，包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)制备酶标抗原：将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，制备酶标抗原；
(3)制备RCT抗体；
(4)制备偶联RCT抗体的凝胶；
(5)包被酶标板；
(6)免疫亲和层析纯化：将偶联抗体的凝胶装柱，加入样品过柱，洗脱，收集洗脱液；
(7)酶联免疫吸附检测：将洗脱液加入经抗体包被的酶标板上，温育后洗涤拍干；加入酶标抗原，温育后洗涤拍干；显色、终止；用酶标仪读取OD值；
(8)绘制标准曲线；
(9)根据标准曲线对洗脱液中的RCT含量进行定量计算。
优选地，样品前处理采用称取动物制品，加入HCl匀浆，冻融，离心取上清，加入NaOH调解pH值至11，加入异丁醇，振荡，静置，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入磷酸盐溶液溶解析出物，冻存待测；或取动物尿液，离心去除杂质，取上清待测。
优选地，制备酶标抗原采用将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，在碳酸缓冲体系中进行标记反应，之后加入硼氢化钠还原未结合位点；其中制备RCT抗体采用将RCT与牛血清白蛋白BSA或与卵清白蛋白OVA偶联作为抗原，制备多克隆RCT抗体或单克隆RCT抗体。
优选地，制备多克隆RCT抗体的方法采用将新西兰白兔接种免疫，免疫抗原为BSA-RCT或OVA-RCT，放血；分级沉淀血清中杂蛋白和抗体免疫球蛋白，离心后得含有多克隆RCT抗体的溶液，冻存备用。
优选地，制备单克隆RCT抗体的方法采用将小鼠接种免疫，免疫抗原为BSA-RCT或OVA-RCT，采血，测定抗体效价，取脾细胞；将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；筛选杂交瘤细胞，获得完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；在小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，采集腹水，经提纯后待用。
优选地，制备偶联RCT抗体的凝胶采用先活化凝胶；将活化后的凝胶与RCT抗体振荡混匀；离心洗涤以洗脱杂蛋白和未结合的抗体；依次用不同pH梯度溶液轮流洗涤封闭未结合的活性基团，再用磷酸缓冲液淋洗，冷藏保存备用。
优选地，包被酶标板采用将RCT抗体包被在酶标板上，冷藏过夜；洗涤拍干。
优选地，免疫亲和层析纯化采用将偶联抗体的凝胶装柱，加入样品，循环过柱，用甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液。
优选地，酶联免疫吸附检测采用将样品洗脱液加在包被后的酶标板上，温育后洗涤拍干；加入酶标抗原，温育后洗涤拍干；继而加入底物混合液显色；终止反应；用酶标仪读取OD值。
本发明还提供了一种用于所述方法的试剂盒，其特征在于它包括：
A试剂：标准RCT试剂；
C试剂：酶标抗原试剂；
K试剂：偶联RCT抗体的凝胶；
包被RCT抗体的酶标板。
优选地，所述的试剂盒还包括：
B试剂：稀释液；
D试剂：酶标抗原稀释液
E试剂：含吐温-20的磷酸盐PBS固体；
F试剂：邻苯二胺试剂；
G试剂：醋酸钠-柠檬酸缓冲液；
H试剂：30％H2O2；
I试剂：硫酸溶液；
J试剂：甘氨酸溶液。
本发明技术方案详述如下：
1、样品前处理：
动物制品(包括肝、肺、心、肾、肌肉)称取10g，加入50ml 0.1mol/LHCl进行组织匀浆，冻融两次，离心取上清，用10mol/L NaOH调节pH值到11，再加入异丁醇30ml，振荡30min，静置4h，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入1ml磷酸盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)溶解析出物，冻存待测；
动物尿样，离心去除杂质后，取上清待测。
2、制备酶标抗原：将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，在碳酸缓冲体系中进行标记反应，之后加入硼氢化钠还原未结合位点；
3、制备RCT抗体
将RCT与牛血清白蛋白BSA或与卵清白蛋白OVA偶联作为抗原，制备多克隆RCT抗体或单克隆RCT抗体；
其中制备多克隆RCT抗体的方法：
将RCT与牛血清白蛋白(BSA)偶联或与卵清白蛋白(OVA)偶联制备抗原；免疫剂量每次1mg/ml BSA-RCT或OVA-RCT，首次免疫用1ml完全福氏佐剂乳化，加强免疫时用1ml不完全福氏佐剂乳化；将新西兰白兔饲养数周后接种免疫，每次免疫间隔两周，一共免疫5次。在最后一次直接肌肉注射，一周后采血检测抗体效价。之后颈动脉放血；以30％-60％的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白和抗体免疫球蛋白，离心后得含有多克隆RCT抗体的溶液；-70℃保存备用。
其中制备单克隆RCT抗体的方法：
将RCT与牛血清白蛋白(BSA)偶联或与卵清白蛋白(OVA)偶联制备抗原；采用小鼠作为免疫动物，免疫抗原剂量为50ug(0.1ml)加等体积的完全福式佐剂乳化，进行首次免疫；一月后，取同等量免疫抗原加不完全福式佐剂，乳化，进行加强免疫，二免后，十天采血，测定抗体效价，取脾细胞；将脾细胞按5∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株；在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹水，经提纯后待用。
4、制备偶联抗体的sepharose-4B凝胶
用溴化氰CNBr活化sepharose-4B琼脂糖凝胶；并用低浓度HCl溶液反复洗涤凝胶；在偶联抗体前先用磷酸缓冲液平衡sepharose-4B凝胶；将凝胶与适当稀释的RCT抗体振荡混匀，使抗体吸附到活化的sepharose-4B凝胶颗粒上；离心洗涤以洗脱杂蛋白和未结合的抗体；依次用不同pH溶液轮流洗涤封闭未结合的活性基团，再用磷酸缓冲液(加入0.02％NaN3)淋洗，4℃保存备用。
5、配制试剂
标准RCT试剂：RCT标准品加稀释液(PBS磷酸缓冲溶液pH7.4)混匀，配成梯度溶液。
酶标抗原试剂：酶标抗原加10ml酶标抗原稀释液(PBS磷酸缓冲溶液，含1％的明胶，pH7.4)溶解，混匀。
洗涤液配制：在含有0.1％吐温-20的磷酸盐(PBS)固体中加入200ml蒸馏水配制洗涤液，用于酶标板的洗涤。
底物混合液的配制：用20ml醋酸钠-柠檬酸缓冲液稀释40mg邻苯二胺，再加入6ul 30％H2O2，配制成底物混合液，现用现配。
6、包被酶标板：将RCT抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)包被在酶标板上，冷藏过夜；洗涤拍干；将抗体包被在酶标板上，100ul/孔，放入4℃冰箱过夜。再加入洗涤液，250ul/孔，洗涤3次，每次3min；放在吸水纸上拍干。
7、取5ml偶联抗体sepharose-4B凝胶装柱，先加入洗涤液平衡，直至流出液的OD280值小于0.5。再加入等体积待测样品溶液，4℃循环过柱。之后用0.1mol/L pH2.5甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液。
8、在酶标板中加入待测样品洗脱液和RCT标准溶液；37℃温育0.5h；之后洗涤拍干；加入100ul酶标抗原溶液，37℃温育0.5h；洗涤拍干；每孔加入150ul底物混合液，室温显色15min；每孔加入50ul终止液(硫酸溶液)；酶标仪读取各孔OD值。
9、绘制标准曲线：用RCT标准品所获各梯度溶液OD值，绘制标准曲线；
10、根据标准曲线对样品洗脱液中的RCT含量进行定量计算。
结果判定：标准对照孔的OD值随着RCT浓度的下降而升高，将样品检测孔OD值与标准对照孔的OD值比较，若OD值相同则被检样品中的RCT含量与对应标准溶液的RCT浓度相同。
本发明RCT检测试剂盒的组建：
试剂盒包含：包被RCT抗体的酶标板；A试剂：标准RCT试剂；B试剂：稀释液；C试剂：酶标抗原试剂；D试剂：酶标抗原稀释液；E试剂：含吐温-20的磷酸盐PBS固体；F试剂：邻苯二胺试剂；G试剂：醋酸钠-柠檬酸缓冲液；H试剂：30％H2O2)；I试剂：硫酸溶液；J试剂：甘氨酸溶液；K试剂：偶联抗体sepharose-4B凝胶。
其中RCT抗体可以是多克隆RCT抗体或单克隆RCT抗体。
酶联免疫吸附检测法(ELISA)是一种快速检测方法，不需要复杂的仪器设备，灵敏度高，特异性强，样品前处理简单，非常适合大量样品的检测，便于现场监控。目前已经广泛应用于各个研究领域。免疫亲和层析纯化技术(IAC)是一种富集纯化物质的高效技术，IAC与ELISA的结合大大的提高了检测的灵敏度。
用ELISA方法实现了对莱克多巴胺的检测，该项研究填补了国内该领域的研究空白。最后创造性将IAC技术与ELISA技术结合起来实现了莱克多巴胺的特异性检测。
使用IAC-ELISA检测技术对样品中的莱克多巴胺可以达到1ng/mL的检测限。
本发明所述方法优点如下：
1、灵敏度高，检测限低，回收率高，结果重复性好；
2、特异性强：IAC和ELISA方法均建立在抗体和抗原的特异性结合，且所得抗体交叉反应率极低；
3、检测成本低廉，无需大型仪器设备，适于推广；
4、样品预处理简单，无需无菌化处理，样品提取方便快捷；
5、通过酶标仪判读，结果具有客观性和不可更改性；
6、简单易行，操作人员只需最基本的实验知识，可标准化为产品；
7、检测时间短，整个操作过程不到2.5个小时；
8、可以进行大批量检测。
【附图说明】
图1：多克隆抗体检测RCT的标准曲线图。
图2：单克隆抗体检测RCT的标准曲线图。
【具体实施方式】
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
1、样品前处理：
猪肉制品(包括肝、肺、心、肾、肌肉)称取10g，加入50ml 0.1mol/LHCl进行组织匀浆，冻融两次，离心取上清，用10mol/L NaOH调节pH值到11，再加入异丁醇30ml，振荡30min，静置4h，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入1ml磷酸盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)溶解析出物，冻存待测；
猪尿样，离心去除杂质后，取上清待测。
2、制备酶标抗原：将活化的辣根过氧化物酶与纯化的RCT混合，在碳酸缓冲体系中进行标记反应，之后加入硼氢化钠还原未结合位点；
3、制备RCT抗体
将RCT与牛血清白蛋白BSA偶联制备抗原；免疫剂量每次1mg/ml BSA-RCT，首次免疫用1ml完全福氏佐剂乳化，加强免疫时用1ml不完全福氏佐剂乳化；将新西兰白兔饲养数周后接种免疫，每次免疫间隔两周，一共免疫5次。在最后一次直接肌肉注射，一周后采血检测抗体效价。之后颈动脉放血；以30％-60％的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白和抗体免疫球蛋白，离心后得含有多克隆RCT抗体的溶液；-70℃保存备用。
4、制备偶联抗体的sepharose-4B凝胶
用CNBr活化sepharose-4B凝胶；并用低浓度HCl溶液反复洗涤凝胶；在偶联抗体前先用磷酸缓冲液平衡sepharose-4B凝胶；将凝胶与适当稀释的多克隆RCT抗体振荡混匀，使抗体吸附到活化的sepharose-4B凝胶颗粒上；离心洗涤以洗脱杂蛋白和未结合的抗体；依次用不同pH溶液轮流洗涤封闭未结合的活性基团，再用磷酸缓冲液(加入0.02％NaN3)淋洗，4℃保存备用。
5、配制试剂
标准RCT试剂：RCT标准品加稀释液(PBS磷酸缓冲溶液，pH7.4)混匀，配成梯度溶液。
酶标抗原试剂：酶标抗原加10ml酶标抗原稀释液(PBS磷酸缓冲溶液，含1％的明胶，pH7.4)溶解，混匀。
洗涤液配制：在含有0.1％吐温-20的磷酸盐(PBS)固体中加入200ml蒸馏水配制洗涤液，用于酶标板的洗涤。
底物混合液的配制：用20ml醋酸钠-柠檬酸缓冲液稀释40mg邻苯二胺，再加入6ul 30％H2O2，配制成底物混合液，现用现配。
6、包被酶标板：将RCT多克隆抗体包被在酶标板上，冷藏过夜；洗涤拍干；将抗体包被在酶标板上，100ul/孔，放入4℃冰箱过夜。再加入洗涤液，250ul/孔，洗涤3次，每次3min；放在吸水纸上拍干。
7、取5ml偶联抗体sepharose-4B凝胶装柱，先加入洗涤液平衡，直至流出液的OD280值小于0.5。再加入等体积待测样品溶液，4℃循环过柱。之后用0.1mol/L pH2.5甘氨酸溶液洗脱，收集洗脱液。
8、在酶标板中加入待测样品洗脱液和RCT标准溶液；37℃温育0.5h；之后洗涤拍干；加入100ul酶标抗原溶液，37℃温育0.5h；洗涤拍干；每孔加入150ul底物混合液，室温显色15min；每孔加入50ul终止液(硫酸溶液)；酶标仪读取各孔OD值。
9、绘制标准曲线：用RCT标准品所获各梯度溶液OD值，绘制标准曲线；结果见图1。
10、根据标准曲线对样品洗脱液中的RCT含量进行定量计算。
结果判定：标准对照孔的OD值随着RCT浓度的下降而升高，将样品检测孔OD值与标准对照孔的OD值比较，若OD值相同则被检样品中的RCT含量与对应标准溶液的RCT浓度相同，检测结果如下：
样品 肌肉 肝 肾 尿检测结果(ng/mL) 5.4 8.7 7.5 4.8
实施例2：
RCT检测试剂盒的组建：
试剂盒包含：包被单克隆RCT抗体的酶标板；A试剂：标准RCT试剂；B试剂：稀释液；C试剂：酶标抗原试剂；D试剂：酶标抗原稀释液；E试剂：含吐温-20的磷酸盐PBS固体；F试剂：邻苯二胺试剂；G试剂：醋酸钠-柠檬酸缓冲液；H试剂：30％H2O2)；I试剂：硫酸溶液；J试剂：甘氨酸溶液；K试剂：偶联单克隆RCT抗体的sepharose-4B凝胶。
实施例3：
RCT检测试剂盒的组建：
试剂盒包含：包被多克隆RCT抗体的酶标板；A试剂：标准RCT试剂；B试剂：稀释液；C试剂：酶标抗原试剂；D试剂：酶标抗原稀释液；E试剂：含吐温-20的磷酸盐PBS固体；F试剂：邻苯二胺试剂；G试剂：醋酸钠-柠檬酸缓冲液；H试剂：30％H2O2)；I试剂：硫酸溶液；J试剂：甘氨酸溶液；K试剂：偶联多克隆RCT抗体的sepharose-4B凝胶。
实施例4：应用实施例2试剂盒检测
以猪肉制品和猪尿样RCT的检测为例，说明试剂盒的具体检测步骤。
1、样品前处理：
称取猪肉制品(包括肝，肺，心，肾，肌肉)10g，加入50ml，0.1mol/L HCl进行组织匀浆，冻融两次，离心取上清，用10mol/L NaOH调节pH值到11，再加入异丁醇30ml，振荡30min，静置4h，定量吸取异丁醇，水浴蒸干，再加入1ml磷酸盐溶液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)溶解析出物，冻存待测。
猪尿样，离心去除杂质后，取上清待测。
2、试剂的配制
标准RCT试剂：A试剂加B试剂混匀，配成梯度溶液。
酶标抗原试剂：C试剂加10ml D试剂溶解，混匀。
E洗涤液配制：在E试剂中加入200ml蒸馏水配制E洗涤液，用于酶标板的洗涤。
底物混合液的配制：用20ml G试剂稀释40mg F试剂，再加入6ul H试剂，配制成底物混合液，现用现配。
3、取5ml K试剂装柱，先加入E洗涤液平衡，直至流出液的OD280值小于0.5。再加入等体积待测样品溶液，4℃循环过柱。之后用J试剂洗脱，收集洗脱液。
4、在包被单克隆RCT抗体的酶标板中加入待测样品洗脱液和RCT标准溶液；37℃温育0.5h；之后洗涤拍干。
酶标板，第1排标准对照，在前11孔加入RCT梯度溶液，加入量100ul，第12孔加入空白对照。其余各孔则加入待测的样品洗脱液，加入量100ul。
5、加入100ul酶标抗原溶液，37℃温育0.5h；洗涤拍干；每孔加入150ul底物混合液，室温显色15min；每孔加入50ul I试剂终止；酶标仪读取各孔OD值。
6、绘制标准曲线：用RCT标准品所获各梯度溶液OD值，绘制标准曲线；此方法的检测限为0.2ng/mL。结果如图2。
7、根据标准曲线对样品洗脱液中的RCT含量进行定量计算。
结果判定：标准对照孔的OD值随着RCT浓度的下降而升高，第12孔OD值应最高；将样品检测孔OD值与标准对照孔的OD值比较，若OD值相同则被检样品中的RCT含量与对应标准溶液的RCT浓度相同，检测结果如下：
样品 肌肉 肝 肾 尿检测结果(ng/mL) 5.8 9.1 7.9 5.2