蛋白质测定方法、蛋白质测定用指示剂及蛋白质测定用试验片 【技术领域】
本发明涉及用于测定含蛋白质试样(例如血液和尿等体液、含蛋白质饮料、工厂废水)中存在的蛋白质的技术。
背景技术
测定生物体试样中的蛋白质，在病理学的诊断方面是重要的。例如，在肝脏功能低下的情况下，血清白蛋白量下降，而另一方面，在肾炎、肾变病综合症、结石、肿瘤等的肾-尿路疾病、循环系统及中枢神经系统的疾病等的情况下，尿中的蛋白质的量增加。因而，测定白蛋白等蛋白质，在这些疾病的诊断中可以成为重要的指标。
在蛋白质测定的领域中，已知使用蛋白质误差指示剂的简便的测定方法。在该测定方法中，作为蛋白质误差指示剂，例如使用着四溴酚蓝(TBPB)，如果举一个例子，使用TBPB的尿试纸，作为一次性筛选用被广泛地使用着。当存在蛋白质时，在pH3附近，TBPB的酚性羟基就会解离，从黄色变为蓝色，因此就可以检测出蛋白质。
但是，将TBPB作为指示剂使用的试纸，因为对于临床必须的10～20mg/dL的低浓度蛋白质的检测灵敏度不够，所以有时不能正确地检测蛋白质。例如，在与色表比较而进行的目测判断中，因为阴性蛋白质与痕迹蛋白质的颜色相近，所以难以区别而判断有困难。另一方面，即使在使用尿试纸的测定装置时，因为TBPB的灵敏度低，而经常有判断错误地情况。
为此希望有可以以更高灵敏度定量地测定低浓度蛋白质的技术，特别希望开发出TBPB以外的新型指示剂。
【发明内容】
本发明者对用于以高灵敏度测定低浓度蛋白质的指示剂进行了筛选，结果发现将特定的卤化氧杂蒽类色素作为目的指示剂是合适的，从而完成了本发明。
即，本发明提供一种具有用下述化学式(1)表示的化学结构的蛋白质测定用指示剂、使用该蛋白质测定用指示剂的蛋白质测定方法和蛋白质测定用试验片。
在化学式(1)中，X1是卤素、硝基或亚硝基，X2是卤素，X3是卤素或氢，X4是羟基或其盐，X5是羧基或其盐。在本发明中，作为蛋白质测定用指示剂，在化学式(1)中，优选为，X1是碘、溴、氯或硝基，X2是碘或溴，X3是氯、溴或氢，最优选为，X1与X2是碘或溴，X3是氯。作为X4及X5中的盐来说，典型的可以列举Na盐。
作为本发明的蛋白质测定用指示剂来说，典型的可以列举下述化学式(1)-1～(1)-5所表示的指示剂。其中，特别优选下述化学式(1)-1及(1)-2所表示的蛋白质测定用指示剂。
这些卤化氧杂蒽类色素，在该色素的pKa以下的pH中，如果没有蛋白质共存，是无色～淡橙色，而如果有蛋白质共存，就变色为红～紫色。因此，如果与如TBPB那样从黄色变为蓝色的情况相比，因为原来的颜色是无色～淡色，所以容易检测颜色的变化。因此，如果使用上述的卤化氧杂蒽类色素，不论是目测判断、或是使用测定装置判断，都变得可以适当地检测低浓度蛋白质。
本发明的蛋白质定量用试验片，可以使吸收性载体浸入含有上述卤化氧杂蒽类色素、缓冲剂、增感剂等的含浸液中，通过使其干燥来制造。试验片可以直接使用，也可以粘接于非吸收体上来使用。
含浸液中的卤化氧杂蒽类色素的浓度，没有特别的限制，典型的是0.1～10mM，优选的是0.5～2mM。
含浸液的pH值，例如比本申请的卤化氧杂蒽类色素的pKa值稍稍低的值即取为1.5～4.5，优选的是2.0～3.5。
作为缓冲剂来说，在pH1.5～4.5的范围中，具有良好的缓冲能力，只要是不阻碍卤化氧杂蒽类色素与蛋白质的反应的物质，什么物质都可以。作为缓冲剂来说，可以使用例如甘氨酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、苹果酸缓冲液或酒石酸缓冲液。含浸液中的缓冲剂浓度，没有特别的限制，典型的是0.1～1.5M、优选0.3～1M。
作为增感剂来说，可以使用例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚碳酸酯或聚乙烯醚，优选使用聚乙二醇或聚丙二醇。含浸液中的增感剂的浓度，没有特定的限制，典型的是0.05～5wt％、优选为0.1～1wt％。
作为吸收性载体来说，可以使用不含蛋白质成分的多孔性物质，例如可以使用片状或膜状形态的材料。作为多孔性物质来说，可以列举例如纸状物、泡沫(发泡体)、织布状物、无纺布状物与编织状物。作为用于形成吸收性载体的材料来说，可以列举例如棉、麻、纤维素、硝基纤维素、乙酸纤维素、石棉、玻璃纤维、二氧化硅纤维、碳纤维、硼纤维、聚酰胺、芳族聚酰胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、再生纤维素(人造丝)、聚酯、尼龙、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚烯烃。这些吸收性载体的形状，没有特别的限定，通常是矩形、长方形、圆形或椭圆形。
作为非吸收体来说，可以使用例如片状或膜状形态的非吸收体。作为用于形成非吸收体的材料来说，可以列举例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯与聚苯乙烯。
【具体实施方式】
实施例
(实施例1)
在本实施例中，对能够检出低浓度蛋白质的指示剂进行了筛选。筛选是如下这样进行的，即，在筛选液中添加对象化合物，使其成为0.5mM，通过目测其发色性进行观察。作为筛选液来说，使用了在0.7M苹果酸缓冲液(pH2.2)中溶解了白蛋白15mg/dL、聚乙二醇0.5wt％这样的溶液。作为对象化合物来说，使用了市场销售的各种色素。其结果是，对于下述化学式(2)-1～(2)-5所示的5种化合物，看到良好的发色。关于这些化合物的销售厂商，如表1所示。
表1 化学式编号 商品名 制造厂商 (2)-1 フロキシンB 東京化成株式会社 (2)-2 ロ一ズベンガル 東京化成株式会社 (2)-3 エリスロシンB 東京化成株式会社 (2)-4 エオシンY 和光纯薬工業株式会社 (2)-5 エオシンB 東京化成株式会社
(实施例2)
在本实施例中，评价了筛选过的指示剂的灵敏度。灵敏度是通过分别测定使白蛋白浓度为0.3mg/dL(阴性)或15mg/dL(阳性)的尿含浸于试验片之后的反射率来进行。试验片是通过将表2所示的组成的含浸液含浸于滤纸(Whatman社製“3MMChr”)之后再使其干燥而形成。使用色差计测定了反射率。各样品的测定结果，示于表3中。在表3中，也同时表示各样品的测定波长。
表2 指示剂 缓冲液 增感剂 溶剂 样品1 フロキシンB (0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH2.2) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 样品2 フロキシンB (0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH2.2) 无 乙醇 (40wt％) 样品3 ロ一ズベンガル (0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH2.6) 聚丙二醇 0.5wt％ 乙醇 (40wt％) 样品4 ロ一ズベンガル (0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH2.6) 无 乙醇 (40wt％) 样品5 TBPB(0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH3.4) 聚乙二醇 0.5wt％ 乙醇 (30wt％) 样品6 TBPB(0.5mM)苹果酸缓冲液0.7M(pH3.4) 无 乙醇 (30wt％)
注TBPB＝四溴酚蓝
表3
由表3可知，使用化学式(2)-1所示的フロキシンB作为指示剂的样品1、2和使用化学式(2)-2所示的ロ一ズベンガル作为指示剂的样品3、4，与使用TBPB作为指示剂的样品5、6相比，白蛋白浓度为0.3mg/dL(阴性)时的反射率大，白蛋白浓度为15mg/dL(阳性)时的反射率小。也就是说，フロキシンB或ロ一ズベンガル在这些pH条件下，因为是无色的，所以与TBPB相比，非发色时(阴性)的光吸收量少，其反面，发色时(阳性)的光吸收量变大。因此，フロキシンB或ロ一ズベンガル在阴性的尿与阳性的尿的反射率的差分大，该差分就成为TBPB的两倍。因此可以说，フロキシンB或ロ一ズベンガル，针对フロキシンB的灵敏度高，即使白蛋白的浓度是10～20mg/dL左右的低浓度，也能够适当地检出白蛋白。
本发明人还对各样品是否能目测判定作了进一步的研究。其结果是，使用フロキシンB或ロ一ズベンガル的样品1～4，在白蛋白浓度为15mg/dL时，从无色发色为红色，可以容易确认其发色(阳性)。与此相对，使用TBPB作为指示剂的样品5、6，在白蛋白浓度为15mg/dL时，与阴性时的黄色几乎没有差别，以目测检出有无发色是困难的。这样，在使用フロキシンB或ロ一ズベンガル作为指示剂时，即使是白蛋白浓度低的情况下，也可以由目测容易地检出白蛋白。
另外，实施例2中的实验结果是关于尿样的，但本发明不限于尿，也可以适用于定量测定含有蛋白质的各种试样例如血液、含蛋白质饮料、工厂废水中的蛋白质的情况。