线粒体DNA11778点突变检测方法及试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种基因检测方法及试剂盒，更具体地说，本发明涉及一种基于分子荧光探针PCR线粒体DNA11778点突变检测方法及试剂盒。
背景技术
Leber’s病，即Leber’s遗传性视神经病变(LHON)，是一种主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的遗传性疾病。该病的传递方式不符合孟德尔遗传，至今遗传方式及发病机理还一直有争论。临床上多为青壮年发病，双眼同时或先后表现为急性或亚急性的视功能严重损害，目前尚无特效治疗，由此所引起的不及时进行明确诊断或开展不恰当治疗将给社会、家庭和患者带来诸多的不良后果。临床上开展LHON明确的分子遗传学诊断处理不仅能避免昂贵的、重复的、损伤性检查，节省了资源，给社会和个人减少了不必要的浪费，也能避免给患者不必要的可能有害的治疗；而且有助于易感人群及个体的确定，对有目的地进行预防和早诊早治起重要作用，在分子水平进行产前基因诊断，也给女性携带者的高危妊娠进行选择性流产提供客观依据，从而为优生优育，开展遗传咨询，对该病的产前诊断提供新的方法和指导。
自从Wallace等在1988年首先发现该病是由线粒体DNA(mtDNA)突变造成以来，其主要发现有mtNd4*LHON11778A、mtND1*LHON3460A、mtND6*LHON14484C这三个原发突变位点。我国及同属蒙古人种的日本等人群中mtND4*LHON11778A尤其高发，有报道约占90％左右。临床上在散发的不明原因的视神经病变病人群中，经分子遗传学诊断为LHON患者比例在美国、欧洲、日本分别为50～80％、50％、40％，我国也有相当一部分(有报道近40％)实际是LHON病人。mtDNA，作为唯一的胞质遗传物质，当今许多学者对其在一些疾病发病机理中的作用已进行了长期的探索，现在对不明原因视神经病变患者行mtDNA主要原发点突变的检测以确诊为Leber’s病这一点上已达成共识。但目前通用MSP(等位基因特异性PCR)检测11778突变位点稳定性及准确性欠佳，酶切、SSCP及直接测序等方法耗时花费高，不适宜于临床推广，如何在临床中准确简便检测视神经病变的mtDNA突变仍然是国内外需重点解决的问题之一。同时，对线粒体DNA突变比例和发病之间的相互关系，是否存在突变阈值和同(异)质性与疾病的发生问题在方法学上也一直是个不能很好解决的问题。一方面人体各组织间可能存在有线粒体DNA突变比例地差异，个体眼视神经组织的取材也不可能，所以对外周血样的准确检测也就现得非常重要。目前由于用来定量的方法均是通过PCR产物电泳灰度扫描来实现半定量，所以相对精确性差。
近年来迅速发展起来的荧光PCR技术是在对PCR产物的检测原理做了很大的改进，荧光PCR技术不同于其它PCR之处在于利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光的采集与分析来实现对初始模板的定量，同时可动态实时监测核酸产物的形成，无须后处理过程，这样在一定程度上避免了扩增产物的污染，既缩短了检测时间，又节省了特殊仪器及专业人员的配备。Applied Biosystems公司推出最新TaqMan MGB荧光探针合成技术，使SNP(single nucleotide polymorphism)筛选检测有了更好的方法。TaqMan MGB荧光探针与常规TaqMan荧光探针相比，有两个主要的不同：一是探针3‘端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的Tamra荧光标记。这一新技术使荧光本底降低，荧光光谱分辩得以大大改善，尤其是SNP分析时不同报告荧光光谱之间的分辨得以大大改善。二是探针3‘端另结合了Minor groove binder结合物，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。因此用TaqMan MGB荧光探针检测SNP，其探针长度一般在13至18个碱基范围，而常规TaqMan探针在AT碱基含量较多时其探针长度将达30-40个碱基，探针长度越长，则其SNP识别率越低。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种基于分子荧光探针PCR线粒体DNA11778点突变的检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于分子荧光探针PCR线粒体DNA11778点突变检测方法的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种线粒体DNA11778点突变检测方法，包括下述步骤：
(1)细胞基因组DNA的提取，包括外周血单个核细胞分离和DNA提取；
(2)在分子探针的存在下，对提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增；
(3)测定PCR反应体系的荧光强度，判定标本中是否存在线粒体DNA11778点突变；
所述PCR扩增使用了PCR引物，在线粒体基因组保守区设计引物序列为：
MT-1：5’-CATCCTCATTACTATTCTGCCTAGCA-3’；
MT-2：5’-GGAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGA-3’；
所述分子探针：在线粒体11778位点设计与靶序列互补的分子探针，5’端用FAM标记，另一端用MGBNFQ标记，其序列为：
MT-3：5’-FAM-CACTCACAGTCACATCA-MGBNFQ；
MT-4：5’-VIC-AGGATTATGATGCGACTGT-MGBNFQ。
本发明所述PCR扩增的条件为：
95℃120秒→93℃10秒→60℃40秒，
其中：93℃10秒→60℃40秒之间进行40次循环。
本发明所述测定PCR反应体系的荧光强度时，荧光采集通道选择FAM和VIC双通道。
本发明还提供了一种用于分子灯标(MGB)荧光探针PCR线粒体DNA11778点突变检测方法的试剂盒，该试剂盒包括：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer：
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各0.1μMol/L～2μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各0.1μMol/L～5μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
1.5mMol/L～2.5mMol/L的氯化镁或硫酸镁；
余量为蒸馏水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、定量功能：在PCR扩增过程中，探针被Taq酶(具有5’外切酶活性)降解，荧光基团远离淬灭基团，反应体系中荧光报告基团所产生的荧光强度随着PCR反应进行，逐渐增强，通过荧光定量PCR仪检测到荧光信号。检测所得的循环数阈值(Cycle threshold，Ct值)与反应初始模板量对数值呈线形负相关。反应过程中引入标准参控品，可以建立Ct值与样品浓度的标准曲线。未知样品可以根据Ct值换算成样品含量。
2、准确性好：与核酸序列测定分型比较，两者结果吻合率100％。
3、有效防污染：PCR反应和分析在完全闭管条件下进行，有效防范PCR产物污染，提高检测结果的可靠性。
4、操作简单、耗时短、结果判断直观明确。在荧光PCR检测仪上进行扩增和分析，不需进行电泳、核酸纯化、紫外灯观测、测序反应等步骤。只需0.5～1.2小时即可完成PCR过程，有利于提高报告速度。只需根据双通道荧光增长曲线或Ct值即可直接判断变异类型。
【附图说明】
图1为LHONmtDNA野生型试验图谱；
图2为LHONmtDNA变异型试验图谱；
图3为LHONmtDNA变异株和野生株混合型试验图谱；
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。
具体实施例1：
配制本发明所述试剂盒的原料选用如下：。
PCR引物，由Biosearch.INC公司合成，引物序列为：
MT-1：5’-CATCCTCATTACTATTCTGCCTAGCA-3’；
MT-2：5’-GGAGTAGAGTTTGAAGTCCTTGAGAGA-3’；
分子探针：在细胞基因组保守区设计与靶序列互补的分子灯标(MGB)探针，5’端用FAM标记，另一端用MGBNFQ((Minor groove binder/Non-fluorescent quencher))标记，其序列为：
MT-3：5’-FAM-CACTCACAGTCACATCA-MGBNFQ；
MT-4：5’-VIC-AGGATTATGATGCGACTGT-MGBNFQ。
dNTPs(dATP，dTTP，dnP，dGTP)：购自APPlied Biosystems公司，浓度：200μMol/L。
具体实施例1中试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各0.1μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各0.1μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
1.5mMol/L的氯化镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例2：
试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各2μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各5μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
2.5mMol/L的氯化镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例3：
试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各1μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各2.5μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
2mMol/L的氯化镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例4：
试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各0.5μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各1μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
1.5mMol/L硫酸镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例5：
试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
各1.5μMol/L的两条引物MT-1、MT-2；
各3μMol/L的两条探针MT-3、MT-4；
2.5mMol/L的硫酸镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例6：
试剂盒成分如下：
反应总体积的一半的2×Taqman PCR buffer；
各200μMol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
0.1μMol/L的引物MT-1、2μMol/L的引物MT-2；
0.1μMol/L的探针MT-3、5μMol/L的探针MT-4；
2mMol/L的硫酸镁；
余量为蒸馏水。
具体实施例7：
本发明所述基于分子荧光探针PCR线粒体DNA11778点突变检测方法的步骤如下：
(一)细胞基因组DNA的提取：
1、外周血单个核细胞(PBMCs)分离：
5ml抗凝血经0.9％NaCl溶液对倍稀释后，缓缓加入到装有等体积Ficoll100溶液的离心管中，2500rpm转速离心10分钟，吸取中间单个核细胞层置于1.5ml eppendorf管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀为外周血单个核细胞。
2、DNA提取：
向上述细胞沉淀中加100μl DNA提取液(杭州博康生物技术有限公司)，99℃10分钟，13,000rpm离心10分钟，上清液即可为PCR扩增的模板。
(二)对提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增：
1、PCR反应混合液
2×Taqman PCR反应缓冲液20μl，两条引物MT-1、MT-2浓度为0.75μmol/L，两条探针MT-3、MT-4浓度为0.25μmol/L，1.5U Taq DNA聚合酶(ROCHE公司产品)，DNA模板5μl用三蒸水补足至40μl。
2、PCR扩增程序：95℃预变性2分钟，然后进入扩增循环93℃×10秒，60℃×40秒，共40个循环。实时定量PCR仪选用ABI 7000，荧光采集通道选择FAM和VIC双通道。
(三)测定PCR反应体系的荧光强度，判定标本中是否存在线粒体DNA11778点突变。
(四)试验结果：
1、正常人血样检测结果，荧光PCR法检测VIC通道检测均为阳性，FAM通道检测均为阴性，判断为LHONmtDNA野生型，正常人样品测序结果均为野生型，结果完全吻合。
2、临床可疑LHON病人及家系成员20人，测序结果表现为LHONmtDNA变异型患者12例，荧光PCR法检测FAM通道均为LHONmtDNA变异阳性，其中存在LHONmtDNA变异株和野生株混合的为5例，混合型中，变异株/野生株比例均大于4∶1；
3、测序结果表现为LHON mtDNA野生型8例，荧光PCR法检测，5例为LHONmtDNA野生型，3例为LHONmtDNA变异株和野生株混合型，混合型中，变异株/野生株比例均小于1∶4。
4、荧光定量PCR检测LHONmtDNA G11778A点突变耗时仅为80分钟，远小于测序法时间。
具体实施例8：
检测不明原因的视神经病变病人10人，结果同直接测序比较。
1、DNA样本来源于中国医学军事科学院基因研究所。
2、PCR反应混合液：
2×Taqman PCR反应缓冲液20μl，两条引物MT-1、MT-2浓度为0.75μmol/L，两条探针MT-3、MT-4浓度为0.25mol/L，1.5U Taq DNA聚合酶(ROCHE公司产品)，DNA模板5μl用三蒸水补足至40μl。
3、PCR扩增程序：95℃预变性2分钟，然后进入扩增循环93℃×10秒，60℃×40秒，共40个循环。实时定量PCR仪选用ABI 7000，荧光采集通道选择FAM和VIC双通道。
4、测定PCR反应体系的荧光强度，判定标本中是否存在线粒体DNA11778点突变。
5、结果：直接测序结果表现为LHON mtDNA野生型7例，变异型3例；荧光PCR法检测，6例为LHONmtDNA野生型，4例为LHONmtDNA变异型其中1例是混合型，混合型中，变异株/野生株比例小于1∶4，故在直接测序中不能判断出其变异情况。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。