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1、(10)申请公布号 CN 103558374 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103558374 A (21)申请号 201310576569.8 (22)申请日 2013.11.19 G01N 33/543(2006.01) G01N 27/327(2006.01) (71)申请人 山东理工大学 地址 255086 山东省淄博市高新技术产业开 发区高创园 D 座 1012 室 (72)发明人 郭业民 王相友 孙霞 刘君峰 赵国 (54) 发明名称 一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪 (57) 摘要 本发明涉及一种电流型免疫传感器农药残留 快速检测仪， 由免疫传感器， 。
2、信号检测与处理系 统， 显示与打印存储系统， 供电系统组成。在石墨 烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物修饰 的工作电极表面固定农药抗体， 制备了免疫传感 器， 三电极系统通过免疫传感器接触农药前后电 流的变化来测定农药的浓度。信号处理电路将采 集的微弱电流信号进行 I/V 转换， 放大， 滤波， A/D 转换最终将数字量信号送入微控制器进行程序处 理 ； 该检测仪可对检测样品中的农药残留量是否 超标及浓度值进行显示、 存储和打印。 本发明的电 流型免疫传感器农药残留快速检测仪可准确快速 的检测样品中是否含有某种农药及是否超标等信 息， 非常适合对农药残留进行现场快速检测的场 合。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103558374 A CN 103558374 A 1/1 页 2 1. 一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于 ： 该检测仪由免疫传感 器， 信号检测与处理电路， 显示与打印存储电路， 恒电位供电电路， 操作按键， 数据存储器， 微型打印机， 电源构成 ； 免疫传感器产生的电流信号由检测电路传向信号检测与处理系统 电路 ； 恒电位电路向工作电极与参比电极之间提供 500mV 的。
4、稳定工作电压 ； 所述的信号检 测与处理电路具有 I/V 转换， 放大， 滤波功能， 内含 A/D 转换芯片将酶传感器采集的模拟量 信号转换成数字量信号送入单片机进行程序处理 ； 所述的免疫传感器使用纳米材料修饰工 作电极后， 将特定的农药抗体固定到电极表面， 可特定性的测量样品液中是否含有某种农 药。 2. 如权利要求 1 所述的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于所述 的信号检测与处理系统的单片机微控制器为 STC89C52。 3. 如权利要求 1 所述的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于该检 测仪使用的是免疫传感器， 在免疫传感器工作电极表面固定了特定的。
5、农药抗体， 因此该检 测仪可实现特定性的测定样品中是否含有某种农药， 实现样品的定性定量测量。 4. 如权利要求 1 所述的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于所述 的信号检测与处理系统电路采用 TLC272CP 芯片多路运放电路具有 I/V 转换， 放大， 滤波并 向三电极反应环境提供 500mv 恒定电压的功能。 5. 所述的电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于采用石墨烯 - 多壁 碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物纳米复合物修饰电极， 并用蛋白质 A 将农药抗体固定在 修饰好的工作电极表面， 最后用牛血清蛋白做封闭剂以封闭电极表面的非特异性位点， 以 减少。
6、非特异性干扰。 权 利 要 求 书 CN 103558374 A 2 1/4 页 3 一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪 技术领域 0001 本发明涉及一种农药残留快速检测仪， 尤其涉及一种电流型免疫传感器农药残留 快速检测仪， 属于农产品安全检测技术领域。 背景技术 0002 现在生产领域中应用的农药种类已经达到 100 多种， 对农业保持丰收增产起到了 很大的作用， 其已成为重要的一种生产资料。伴随着改革开放的深入进行， 在一些常熟地 区， 农药事业的发展速度变得很快。 因农业机械化正在不断推进， 农药的大面积使用是不可 缺少的。但因农药的不合理的使用， 造成了诸多的环境问题， 如农田。
7、生态系统被破坏等。农 药的大量使用， 在保证了粮食等农作物大量稳产的同时， 也带来了诸多的环境问题。在植 物、 土壤和水体中残留的农药有两种残存的形式 ： 第一种保持原有的化学结构 ； 第二种以 化学转化后的产物或被生物降解产物的形式残存。因此， 农药残留问题不容忽视。 0003 目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、 液相色谱仪、 气质联用仪、 液质联用 仪等， 这些方法虽然分析精度高， 定量准确， 但其样品的前处理复杂、 检测耗时长、 成本高、 需要技术熟练的操作人员。 我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法 （农残快速检测仪） ， 可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的。
8、现场快速检测， 具有较好 的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化， 因此一般只能用于严重超标的蔬菜 样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛， 国内已有多种农药残留速测仪 均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的， 但蔬菜水果中大量的 色素会对分光光度法造成很大的影响， 导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率 低、 错检、 漏检比例较高、 重复性差、 难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。 0004 发明的目的在于针对现有技术的不足， 设计提供一种电流型免疫传感器农药残留 快速检测仪， 具有携带方便、 检测快速准确、 操作简单、 可专门测定农产品中某种。
9、农药残留 是否超标及浓度信息。 0005 本发明一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的基本原理是 ： 三电极系统将 免疫传感器接触农药前后由于免疫反应而导致微弱电流信号的变化， 检测电路将免疫传感 器产生的电流信号进行采集。检测电路将采集而来的微弱电流信号进行 I/V 转换， 放大， 滤 波， A/D 转换最终将数字量信号送入单片机进行程序处理。最后， 显示与打印存储系统将农 药残留的浓度、 抑制度等参数显示出来， 并将数据存储下来以便用户及时查看和进行数据 分析。本发明的检测仪内含微型打印机， 可以将数据进行相应的打印输出。信号检测与处 理系统内部的单片机对显示与打印存储系统统一进行编程控。
10、制。 0006 为实现以上功能， 本发明的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的免疫传 感器制备方法为 ：（1） 电极采用 2L 石墨烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物滴 涂到各工作电极表面。石墨烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物制备方法如下 ： 将 0.5g 壳聚糖溶于 100mL 1.0% 的醋酸溶液中， 室温下搅拌 3h， 配成 0.5%CS 溶液， 室温下磁力 搅拌 1h， 使壳聚糖完全溶解 ； 称取 4.0mg 石墨烯和 4.0mg 多壁碳纳米管加入 10.0mL 上述得 说 明 书 CN 103558374 A 3 2/4 页 4 到的壳聚糖溶液中。
11、， 在室温下超声分散， 直至得到稳定的黑色分散液 ( 石墨烯 - 多壁碳 - 壳 聚糖纳米复合材料 ) ； 再将制备好的 10.0mL 的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中， 再在 室温下超声分散 12h 至完全溶解， 得到石墨烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物。 （2） 抗体在工作电极上的固定方法 ： 在修饰好的工作电极表面滴涂 2L 浓度为 100g/mL 蛋白 A， 然后用 pH7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗， 氮气吹干 ； 滴涂 2L 浓度为 10g/mL 农药抗 体， 4孵育 12h ； 将上述制备好的电极最后浸入 2.5% 的 BSA 溶液中室温下静置 1h， 以封闭 电。
12、极上非特异性结合位点， 以减少非特异性干扰。室温下晾干， 免疫传感器制作完成， 保存 在 4条件下备用。 0007 所述的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 其特征在于 ： 三电极系统电 路由三电极免疫传感器传感器， 三电极检测电路， 恒电位电路组成 ； 三电极免疫传感器采集 电流信号由三电极检测电路传向信号检测与处理系统电路。 恒电位电路向反应溶液环境提 供 500mV 的稳定电压。 0008 信号检测与处理系统电路具有 I/V 转换， 放大， 滤波功能， 内含 A/D 转换芯片将经 过 I/V 转换之后酶传感器采集的模拟量信号转换成数字量信号送入单片机进行程序处理。 信号检测与处理系。
13、统的单片机微控制器为 STC89C52。单片机的检测程序包含数据打印与 存储， 时间显示， 使用说明和对重要步骤提示的对话框， 帮助用户快速掌握仪器的使用方法 以及进行数据打印和存储方便以后进行数据的检查和处理。 信号检测与处理系统电路采用 TLC272CP芯片多路运放电路具有I/V转换， 放大， 滤波并向三电极反应环境提供500mv恒定 电压的功能。 0009 显示与打印存储系统电路由显示器电路， 打印电路和存储器电路组成。显示器用 于显示数据通过操作按键进行控制作为用户进行控制的界面。 打印存储系统电路分别与微 型打印机以及存储器相连进行数据打印和存储。 显示屏采用了一般的 3.5 寸的显。
14、示屏， 微 型打印机采用微型嵌入式打印机， 其尺寸和功耗满足方便携带和便携式的功耗要求。 0010 为达到以上目的， 采取以下技术方案实现 ： 供电系统电路由开关电源和电压转换 电路组成， 开关电源将交流电转换成直流电经过电压转换电路分别向各系统电路和微型打 印机供电。开关电源为 +12V， 1A、 -12V， 1A、 +5V， 5A 三路输出。电源与供电系统中的开关电 源相连。 0011 附图说明 图 1 为本发明一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的结构框图， 图 2 为本发明三电极与恒电位电路及 A/D 转换前期处理电路。 具体实施方式 0012 首先， 对本发明的结构示意框图加以说明。
15、 ； 其次， 对信号检测及处理系统所包括的 恒电位电路、 A/D 转换前期处理电路加以详细说明 ； 最后， 对整个系统的应用软件及检测流 程加以说明。 图 1 为本发明一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的结构框图。如图 1 所示， 本发明由三电极系统， 信号检测与处理系统， 显示与打印存储系统， 供电系统组成。三电极 系统通过免疫传感器采集反应溶液中的微弱电流信号 ； 信号检测与处理系统将三电极采集 而来的微弱电流信号进行 I/V 转换， 放大， 滤波， A/D 转换最终将数字量信号送入单片机进 说 明 书 CN 103558374 A 4 3/4 页 5 行程序处理 ； 显示与打印存储系。
16、统将残留的农药浓度、 抑制度等参数显示出来， 并将数据存 储下来以便用户及时查看和进行数据分析。本发明的检测仪内含微型打印机， 可以将数据 进行相应的打印输出。 信号检测与处理系统内部的单片机对显示与打印存储系统统一进行 编程控制。供电系统将交流电转换成三路直流电为各系统电路以及微型打印机供电。所述 的微控制器采用内核为 MCS-51 的 STC89C52RC+ 微控制器， 其上加载检测程序。 0013 本发明中， 检测电路中的恒电位电路为三电极系统电流 / 电压转化检测电路 提供稳定的工作电压， 图 2 为恒电位仪电路的一个实施例， 由一个双路运算放大器 U10 TLC272CP 和 R44。
17、,R46,R4,C35,C16,R48 构成。运放 B 的引脚 6 和 7 相连与 A 的 3 脚相连， A 的 2 脚与三电极体系的工作电极相连并连上了 C16， 增强抗干扰能力， R48 是做为反馈电阻 在放大器 A 上， B 的 5 管脚外接一个电位器 R46， 由正 5V 供电激励， R44,R46,R4 通过电压分 压供给 500mv 电压给与 B 的 5 管脚形成恒电位电路， 初始电压为 500mv. 运放 A 和的引脚 8 接 +5V 电源， 引脚 4 接 -5V， U9 TLC272CP 的运放 B 引脚 7 与 引脚 6 直接相连作为 电压跟随器， ADE 引脚 3 与 B 。
18、的引脚 5 相连接， 共同接地， 起到抗干扰的作用。A 的引脚 2 直接与三电极体系的参比电极相连接， 引脚 1 直接与三电极体系的辅助电极相连接， 之间 连接电容14， 目的是起隔离电路的作用， 同时能提高带负载的能力， 因此U9和U10共同构成 了生物传感器的三电极体系， 所用检测端由这里引出， 采集与检测电化学反应产生的微弱 电流信号。 0014 本发明的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的免疫传感器制备方法为 ： （1） 电极采用2L石墨烯-多壁碳-纳米金胶-壳聚糖纳米复合物滴涂到各工作电极表面。 石墨烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物制备方法如下 ： 将 0.5g。
19、 壳聚糖溶于 100mL 1.0%的醋酸溶液中， 室温下搅拌3h， 配成0.5%CS溶液， 室温下磁力搅拌1h， 使壳聚糖完全溶 解 ； 称取 4.0mg 石墨烯和 4.0mg 多壁碳纳米管加入 10.0mL 上述得到的壳聚糖溶液中， 在室 温下超声分散， 直至得到稳定的黑色分散液 ( 石墨烯 - 多壁碳 - 壳聚糖纳米复合材料 ) ； 再 将制备好的10.0mL的纳米金胶加入已混合好的上述溶液中， 再在室温下超声分散12h至完 全溶解， 得到石墨烯 - 多壁碳 - 纳米金胶 - 壳聚糖纳米复合物。 （2） 抗体在工作电极上的固 定方法 ： 在修饰好的工作电极表面滴涂 2L 浓度为 100g/。
20、mL 蛋白 A， 然后用 pH7.5 的磷 酸盐缓冲液冲洗， 氮气吹干 ； 滴涂 2L 浓度为 10g/mL 农药抗体， 4孵育 12h ； 将上述制 备好的电极最后浸入 2.5% 的 BSA 溶液中室温下静置 1h， 以封闭电极上非特异性结合位点， 室温下晾干， 免疫传感器制作完成， 保存在 4条件下备用。 0015 一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪的样品处理方法如下 ： 选取有代表性 的蔬菜和水果样品， 用潮湿的抹布将蔬菜表面的泥土擦拭干净， 切碎成 2cm 左右的见方碎 片， 取样品 2g, 放入提取瓶中， 加入 10ml 磷酸盐缓冲液， 放入超声提取仪， 超声提取 3 分 钟， 。
21、倒出提取液静置 2min, 备用即可。 0016 本发明的检测流程是 ： 首先， 将制备好的免疫传感器放入不含农药的测试底液中， 测得不含农药时的电流 I1， 即抑制前电流 （抑制前电流也可以采用系统中设定的默认值） ； 之后将免疫传感器去除， 用蒸馏水冲洗后， 将免疫传感器工作电极放入待检测溶液孵育 10 分钟， 再次将免疫传感器放入测试底液中， 测得抑制后的电流 I2； 最后通过微控制器上运行 的检测程序自动计算出抑制率 (I%)， 计算公式如下 ： I%=( I1- I2)/ I1 100% 说 明 书 CN 103558374 A 5 4/4 页 6 通常如果检测溶液中含有农药， 由于。
22、抗体与农药发生免疫反应产生免疫复合物阻碍了 测试液与电极之间的电子转移， 电流 I2小于 I1。I1 与 I2 的差值愈大则抑制率愈大， 表明 检测溶液中农药残留的浓度愈高 ； I1 与 I2 的差值愈小则抑制率愈小， 表明检测溶液中农 药残留的浓度愈低。 0017 目前认为当抑制率大于、 等于 50时， 农药残留超标 ； 当抑制率小于 50时， 农 药残留未超标。 0018 微控制器根据得到的抑制率做出定性结论， 将结果送到显示屏显示， 并将最后结 果打印输出， 数据同时一并进行存储供相关人员以后的查找和研究。 0019 本发明微控制器上运行的检测程序还包含屏幕跳转演示和对重要步骤提示的对 。
23、话框、 打印提示， 可以帮助用户快速掌握仪器的使用方法。 0020 检测程序的实施例 ： 首先， 将免疫传感器放入底物溶液中进行检测准备。然后， 按下仪器开关键， 系统初始化后进入首页， 显示屏旁边有检测按钮、 复位和打印三个播磨按 键。第一次点击检测按钮， 开始检测 并显示读数 I1； 第二次点击检测之后， 观察提示， 显示 结果 I2 ； 点击打印， 打印结果并保存。打开电源键， 屏幕显示 “START 检测 ” ， 清零。将鳄鱼 夹分别加紧三电极系统对应的三个柱状电极， 将固定抗体的免疫传感器浸入到之前准备的 磷酸盐缓冲溶液中按下检测键， 屏幕显示开始检测， 约 1min 后， 基线达到。
24、稳定水平， 约 30s 后， 得到第一个完整的电流数据， 记为 I1。待测样品测试 ： 将免疫传感器放入提取好的样品 溶液中， 约 10min， 之后再将其浸入定量磷酸盐缓冲溶液中， 按测量键， 点击检测键第二次测 量， 同时显示第二个电流数据 I2。通过两个电流数据自动计算该样品液对固定化酶的活性 抑制率。选择适当的关系曲线计算提取液的目标农药浓度， 并折算成样品中目标农药的含 量， 最后自动生成测定结果报告。按下打印键， 将印有前后两次检测电压、 农药抑制率以及 农药检测浓度的数据进行打印输出。 0021 本发明的一种电流型免疫传感器农药残留快速检测仪， 操作工艺简单， 检测时间 较短， 可实现农药残留的定性定量测量， 具有灵敏度高， 稳定性好、 重现性好等优点， 符合我 国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。 说 明 书 CN 103558374 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103558374 A 7 。