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1、(10)申请公布号 CN 103558242 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103558242 A (21)申请号 201310566056.9 (22)申请日 2013.11.14 G01N 24/08(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (71)申请人 河南理工大学 地址 454003 河南省焦作市高新区世纪大道 2001 号 (72)发明人 揣小明 杨柳燕 张永领 陈小锋 程书波 (74)专利代理机构 北京世誉鑫诚专利代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11368 代理人 郭官厚 (54) 发明名称 水体中颗粒态有机磷的提取及测定方法 (57) 摘要。
2、 本发明公开了一种水体中颗粒态有机磷的提 取方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 采样、 过滤、 冻干、 研磨、 EDTA-Na2S2O4混合溶液中提取无机磷、 NaOH 溶液中提取有机磷的步骤 ； 同时还公开了基 于该提取方法的核磁共振测定方法。本发明的有 益之处在于 ： 能够检测出样品中具体有机磷的种 类 ； 通过现场过滤， 减少了样品运输过程中有机 磷形态的变化 ； 分析需求的样品量少， 减少了现 场过滤的工作量 ； 分析提取步骤少， 不仅减少了 提取过程中的磷损失， 而且节省了分析样品的时 间 ； 利用相对回收率计算后发现， 本发明的测定 方法其分析测试的精度较高。 (51)Int.。
3、Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103558242 A CN 103558242 A 1/2 页 2 1. 水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 、 采集水样， 并利用真空过滤系统现场将采集的水样过滤， 收集滤膜， 冷藏保存 ； （2） 、 用去离子水冲洗滤膜， 留取冲洗液 L1， 然后将滤膜浸泡在去离子水中， 用振荡器振 荡直至所有的固体颗粒都分离到水中， 留取浸提液 L2， 合并 L1与 L2得到溶液 L提取。
4、； （3） 、 取溶液 L提取， 在 -80条件下冷冻干燥， 得固体颗粒物 S0； （4） 、 研磨固体颗粒物 S0， 将研磨过的固体颗粒物编号 S1， 密封储存于 -80的冷冻冰箱 中备用 ； （5） 、 在 -20条件下， 将固体颗粒物 S1放入 pH=4.5 的 EDTA-Na2S2O4混合溶液中进行振 荡预处理 ； （6） 、 将混合液在 -4条件下离心， 离心得到的沉淀物加入到 0.1M 的 NaOH 溶液中， 于 -20条件下进行提取 ； （7） 、 提取液在 -4条件下离心， 上清液即为颗粒态有机磷最终提取液。 2. 根据权利要求 1 所述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征。
5、在于， 所述滤膜为 0.45m 的醋酸纤维滤膜。 3. 根据权利要求 1 所述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 固体颗粒物 S1均能通过 100 目的筛子。 4. 根据权利要求 1 所述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， EDTA-Na2S2O4 混合溶液由 0.1M EDTA 和 2%（w/v） Na2S2O4混合而成。 5.根据权利要求1至4任意一项所述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （5） 中， 每隔 20min 振荡混合溶液 1 次， 每次振荡的持续时间为 1min， 振荡预处理的 总时间为 2h。 6.根据权利要求1至4任意一项所述的。
6、水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （6） 中， 沉淀物在 NaOH 溶液中开始提取时， 每隔 30min 振荡一次， 直至所有样品均结 成冰块。 7. 水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 、 采集水样， 并利用真空过滤系统现场将采集的水样过滤， 收集滤膜， 所述滤膜为 0.45m 的醋酸纤维滤膜， 冷藏保存 ； （2） 、 用去离子水冲洗滤膜， 留取冲洗液 L1， 然后将滤膜浸泡在去离子水中， 用振荡器振 荡直至所有的固体颗粒都分离到水中， 留取浸提液 L2， 合并 L1与 L2得到溶液 L提取； （3） 、 取溶液 L提取， 在 -80。
7、条件下冷冻干燥， 得固体颗粒物 S0； （4） 、 研磨固体颗粒物S0， 将研磨过的固体颗粒物编号S1， 固体颗粒物S1均能通过100目 的筛子， 密封储存于 -80的冷冻冰箱中备用 ； （5） 、 在 -20条件下， 将 S1放入 pH=4.5 的 EDTA-Na2S2O4混合溶液中进行振荡预处理 ； （6） 、 将混合液在 -4条件下离心， 离心得到的沉淀物加入到 0.1M 的 NaOH 溶液中， 于 -20条件下进行提取 ； （7） 、 提取液在 -4条件下离心， 用核磁共振方法测定上清液中的有机磷的种类和含 量。 8. 根据权利要求 7 所述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于。
8、， 在步骤 （5） 中， 每隔 20min 振荡混合溶液 1 次， 每次振荡的持续时间为 1min， 振荡预处理的总时间为 权 利 要 求 书 CN 103558242 A 2 2/2 页 3 2h。 9. 根据权利要求 7 所述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 在步骤 （6） 中， 沉淀物在 NaOH 溶液中开始提取时， 每隔 30min 振荡一次， 直至所有样品均结成冰块。 10. 根据权利要求 7 所述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 核磁共振的 条件为 ： 90脉冲， 循环延迟时间 2s， 捕获时间 0.5s， 扫描次数为 19000 次， 31P 的共振频。
9、率 为 161.98MHz， 化学位移是相对于 85% 磷酸的信号标准。 权 利 要 求 书 CN 103558242 A 3 1/5 页 4 水体中颗粒态有机磷的提取及测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种有机磷的提取及测定方法， 具体涉及一种水体中颗粒态有机磷的 提取及测定方法， 属于化学领域。 背景技术 0002 目前， 水体中有机磷的分析方法主要有 ： 差减法和分步连续化学提取法。 以分步连 续化学提取法为例， 参照图 1， 其主要包括了取样、 过滤、 冻干、 研磨、 MgCl2提取可交换态磷、 NH4F 提取铝磷、 NaOH+Na2CO3提取铁磷、 HAc+NaAc 提取自生钙。
10、磷、 盐酸提取碎屑钙磷、 灼烧后 用盐酸提取有机磷等 8 个大步骤， 不仅需要的试剂多， 而且操作过程繁琐， 最重要的是， 分 析得出的有机磷含量是总有机磷的含量， 不能区分出颗粒态有机磷主要形态及其含量。差 减法与步连续化学提取法存在同样的问题。 0003 一些种类的颗粒态有机磷容易被转化并被水生生物利用， 这对理解水生态系统的 生物地球化学循环具有重要的意义。 然而现有的两种方法所提取出来的有机磷仅仅为颗粒 态总有机磷， 既包括容易被转化的， 又包括难被生物利用的， 这对准确理解水生态系统的生 物地球化学循环具有一定的影响。 发明内容 0004 为解决现有技术的不足， 本发明的目的在于提供。
11、一种取样量少、 提取快捷易操作 的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 以及测定步骤少、 测试准确度较高的水体中颗粒态有 机磷的测定方法。 0005 为了实现上述目标， 本发明采用如下的技术方案 ： 0006 一种水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0007 （1） 、 采集水样， 并利用真空过滤系统现场将采集的水样过滤， 收集滤膜， 冷藏保 存 ； 0008 （2） 、 用去离子水冲洗滤膜， 留取冲洗液 L1， 然后将滤膜浸泡在去离子水中， 用振荡 器振荡直至所有的固体颗粒都分离到水中， 留取浸提液 L2， 合并 L1与 L2得到溶液 L提取； 0009 （3） 、 取。
12、溶液 L提取， 在 -80条件下冷冻干燥， 得固体颗粒物 S0； 0010 （4） 、 研磨固体颗粒物 S0， 将研磨过的固体颗粒物编号 S1， 密封储存于 -80的冷冻 冰箱中备用 ； 0011 （5） 、 在 -20条件下， 将固体颗粒物 S1放入 pH=4.5 的 EDTA-Na2S2O4混合溶液中进 行振荡预处理 ； 0012 （6） 、 将混合液在-4条件下离心， 离心得到的沉淀物加入到0.1M的NaOH溶液中， 于 -20条件下进行提取 ； 0013 （7） 、 提取液在 -4条件下离心， 上清液即为颗粒态有机磷最终提取液。 0014 前述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在。
13、于， 前述滤膜为 0.45m 的醋 酸纤维滤膜。 说 明 书 CN 103558242 A 4 2/5 页 5 0015 前述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 前述固体颗粒物 S1均能通 过 100 目的筛子。 0016 前述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 前述EDTA-Na2S2O4混合溶液 由 0.1M EDTA 和 2%（w/v） Na2S2O4混合而成。 0017 前述的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （5） 中， 每隔 20min 振荡混合溶液 1 次， 每次振荡的持续时间为 1min， 振荡预处理的总时间为 2h。 0018 前述。
14、的水体中颗粒态有机磷的提取方法， 其特征在于， 在步骤 （6） 中， 沉淀物在 NaOH 溶液中开始提取时， 每隔 30min 振荡一次， 直至所有样品均结成冰块。 0019 一种水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0020 （1） 、 采集水样， 并利用真空过滤系统现场将采集的水样过滤， 收集滤膜， 前述滤膜 为 0.45m 的醋酸纤维滤膜， 冷藏保存 ； 0021 （2） 、 用去离子水冲洗滤膜， 留取冲洗液 L1， 然后将滤膜浸泡在去离子水中， 用振荡 器振荡直至所有的固体颗粒都分离到水中， 留取浸提液 L2， 合并 L1与 L2得到溶液 L提取； 0022 。
15、（3） 、 取溶液 L提取， 在 -80条件下冷冻干燥， 得固体颗粒物 S0； 0023 （4） 、 研磨固体颗粒物 S0， 将研磨过的固体颗粒物编号 S1， 固体颗粒物 S1均能通过 100 目的筛子， 密封储存于 -80的冷冻冰箱中备用 ； 0024 （5） 、 在 -20条件下， 将 S1放入 pH=4.5 的 EDTA-Na2S2O4混合溶液中进行振荡预处 理 ； 0025 （6） 、 将混合液在-4条件下离心， 离心得到的沉淀物加入到0.1M的NaOH溶液中， 于 -20条件下进行提取 ； 0026 （7） 、 提取液在 -4条件下离心， 用核磁共振方法测定上清液中的有机磷的种类和 。
16、含量。 0027 前述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 在步骤 （5） 中， 每隔 20min 振荡混合溶液 1 次， 每次振荡的持续时间为 1min， 振荡预处理的总时间为 2h。 0028 前述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 在步骤 （6） 中， 沉淀物在 NaOH 溶液中开始提取时， 每隔 30min 振荡一次， 直至所有样品均结成冰块。 0029 前述的水体中颗粒态有机磷的测定方法， 其特征在于， 核磁共振的条件为 ： 90脉 冲， 循环延迟时间2s， 捕获时间0.5s， 扫描次数为19000次， 31P的共振频率为161.98MHz， 化 学位移是相对于。
17、 85% 磷酸的信号标准。 0030 本发明的有益之处在于 ： 通过现场过滤， 减少了样品运输过程中有机磷形态的变 化 ； 分析需求的样品量少， 减少了现场过滤的工作量 ； 分析提取步骤少， 不仅减少了提取过 程中的磷损失， 而且节省了分析样品的时间 ； 本发明的核磁共振法不仅能够检测出样品中 具体有机磷的种类和含量， 而且可以较为准确的反映水体中有机磷的情况， 其分析测试的 准确度较高。 附图说明 0031 图 1 是现有的分步连续化学提取法的主要步骤的流程图 ； 0032 图 2 是本发明的提取方法的主要步骤的流程图 ； 0033 图 3 为滇池采样点 1 的水体中颗粒态有机磷的核磁共振图。
18、 ； 说 明 书 CN 103558242 A 5 3/5 页 6 0034 图 4 为滇池采样点 2 的水体中颗粒态有机磷的核磁共振图 ； 0035 图 5 为呼伦湖采样点的水体中颗粒态有机磷的核磁共振图 ； 0036 图 6 为太湖采样点 1 的水体中颗粒态有机磷的核磁共振图 ； 0037 图 7 为太湖采样点 2 的水体中颗粒态有机磷的核磁共振图。 0038 图中附图标记的含义 ： a85% 磷酸盐 ;b膦酸盐 ;cDNA;d焦磷酸盐 ;e ATP- 膦酸盐 ;f未知有机磷 ;g正磷酸盐 ;h膦酸盐单酯 ;i磷脂 ;j多聚膦酸盐。 具体实施方式 0039 以下结合附图和具体实施例对本发明。
19、作具体的介绍。 0040 一、 提取水体中颗粒态有机磷 0041 利用采水器采集富营养化水体水面下 50cm 的天然水 30L（一般采集量为 20-50L， 依据水体中 SS 的含量而定） ， 利用真空过滤系统现场将采集的水样过滤， 收集滤膜， 冷藏保 存。滤膜选用的是 Whatman 醋酸纤维滤膜 （OE67） ， 孔径为 0.45m。 0042 现场采集 200mL 水样 L0， 利用钼蓝比色法测定水体中总磷 （TP） 和溶解态总磷酸 （TDP） 的含量 CTP、 CIDP， 则颗粒态总磷 （TPP） 的含量 CIPP可以表示为 ： 0043 CIPP=CTPCIDP。 0044 用 30。
20、mL 去离子水冲洗滤膜， 留取冲洗液 L1。 0045 用镊子取冲洗过的滤膜， 浸泡在 20mL 的去离子水中， 用振荡器振荡 2-3min， 直至 所有的固体颗粒都分离到水中， 留取浸提液 L2。 0046 将 L1与 L2合并在一起， 称为溶液 L提取。取溶液 L提取， 在 -80条件下冷冻干燥， 得 到固体颗粒物 S0。 0047 研磨固体颗粒物S0， 直至所有的固体颗粒物均通过100目的筛子， 将研磨过的固体 颗粒物编号 S1， 密封储存于 -80的冷冻冰箱中备用。 0048 在 -20条件下， 用 25mL pH=4.5 的 EDTA-Na2S2O4混合溶液 （由 0.1M EDTA。
21、 和 2% （w/v） Na2S2O4混合而成） 对 S1进行振荡预处理， 每隔 20min 振荡混合溶液 1 次， 每次振荡的 持续时间为 1min， 振荡预处理的总时间为 2h。 0049 2h后取混合液， 在-4条件下10000r min-1离心10min， 分离出上清液和沉淀物。 其中， 0050 上清液用钼蓝比色法分别测出其所含的 TP 和磷酸根离子 （DIP） 的浓度， 分别计 作 CTP和 CDIP， 则天然水体中 TP 和 DIP 的相应含量 C0TP和 C0DIP即可换算得知， 而且 EDTA-Na2S2O4混合提取液中无机磷的含量百分比 W1也可计算出来 ： 0051 00。
22、52 离心得到的沉淀物加入到 10mL0.1M 的 NaOH 溶液中， 于 -20条件下提取 16h， 开 始的 5-6h 内， 每隔 30min 振荡一次， 以便于提取， 直至所有样品均结成冰块， 之后在 -4和 10000r min-1条件下离心 10min， 上清液即为颗粒态有机磷最终提取液。 0053 二、 测定水体中颗粒态有机磷 0054 取颗粒态有机磷最终提取液， 利用核磁共振方法测试其中有机磷的种类和含量。 0055 核磁共振方法 ： 仪器为 Bruker 公司 AV400 核磁共振光谱仪， 带有 5mmBBO 探头， 说 明 书 CN 103558242 A 6 4/5 页 7。
23、 90脉冲， 循环延迟时间2s， 捕获时间0.5s， 扫描次数为19000次， 31P的共振频率为161.98 MHz， 化学位移是相对与 85% 磷酸的信号标准。 0056 测试结果见图 3 至图 7。 0057 有机磷的总含量计作 W2。 0058 三、 测定结果的验证 0059 取同样的颗粒态有机磷最终提取液， 用钼蓝比色法分别测定最终提取液中的 TP 和 DIP 的含量， 分别计作 C TP和 C DIP， 则天然水体中 TP 和 DIP 的相应含量 C0 TP和 C0 DIP即可换算得知， 而且 NaOH 提取液中有机磷的含量百分比 W2 也可计算出来 ： 0060 0061 计算提。
24、取效率 ： 0062 0063 验证结果见表 1。 0064 表 1 测定结果比较表 0065 本发明的方法钼蓝比色法W2/ W2 滇池采样点 1W2=38.2gL-1W2 =41.0gL-193.2% 滇池采样点 2W2=26.3gL-1W2 =32.0gL-182.2% 呼伦湖采样点W2=35.8gL-1W2 =51.0gL-170.2% 太湖采样点 1W2=126.3gL-1W2 =199.0gL-163.5% 太湖采样点 2W2=38.7gL-1W2 =40.0gL-196.7% 0066 综上所述， 1、 采用本发明的提取方法， 可以提取出 9 种天然有机磷， 有些种类的有 机磷 （。
25、如DNA,多聚磷酸盐和正磷酸盐单酯） 容易被转化进而被生物利用， 对理解水体中磷元 素的生物地球化学循环具有十分重要的意义。 0067 2、 基于本发明的提取方法的核磁共振测定方法， 与钼蓝比色法相比， 采用核磁共 振方法测定的结果要偏低， 即 W2/W2 60%， 其代表了水体中有机磷存在的主要种 类， 因此 W2完全可以用来代表水体中有机磷的情况。 0068 3、 利用本方法对全国 20 多个湖泊和水库进行了分析测定， 有机磷的提取效率大 于 82%， 测定效果良好， 核磁共振测定水体中主要有机磷的含量占总有机磷的比例均超过 60%， 且水体的营养水平越高， 提取效果越好。 0069 此外。
26、， 本发明的提取方法， 与差减法相比， 是对水体中有机磷的直接提取方法， 其 结果更准确 ； 与连续化学分析方法相比， 步骤大大减少， 节省了分析样品的时间。 因此， 本发 说 明 书 CN 103558242 A 7 5/5 页 8 明的提取方法以及基于该提取方法的测定方法， 具有突出的实质性特点和显著的进步。 0070 需要说明的是， 上述实施例不以任何形式限制本发明， 凡采用等同替换或等效变 换的方式所获得的技术方案， 均落在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 103558242 A 8 1/3 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103558242 A 9 2/3 页 10 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103558242 A 10 3/3 页 11 图 7 说 明 书 附 图 CN 103558242 A 11 。