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1、(10)申请公布号 CN 103575678 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103575678 A (21)申请号 201310582126.X (22)申请日 2013.11.15 G01N 21/31(2006.01) G01N 21/33(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学化学与材料工程学院 (72)发明人 宋健 赵泳 (54) 发明名称 一种用乙醇变性快速测定乳制品中蛋白质掺 假的方法 (57) 摘要 本发明将牛奶用考马斯亮兰法测定， 其吸光 度为 A前。同时， 将其用 1 ： 2 的乙醇变性。
2、沉淀， 过 滤后， 滤液用相同的考马斯亮兰法测定， 吸光度为 A后。计算 A后/A前作为判断牛奶是否掺假的根据。 根据大量测量数据， 正常比值应该在 9 12， 高于此数值， 即为加入其它含氮物质， 可判为掺 假。所需时间仅 20 分钟， 大大缩短了判断掺假的 时间。有色样品进行脱色后采用上述方法测定。 奶粉可稀释后后采用上述方法测定。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103575678 A CN 103575678 A 1/1 页 2 1. 选择合适的。
3、比色法 - 考马斯亮蓝法， 测定蛋白质含量， 其吸光度为 A前。 2. 选择合适的试剂乙醇， 选择合适的比例 1 ： 2， 进行变性沉淀， 并过滤。 3. 滤液用相同的考马斯亮兰法测定， 吸光度为 A后。 4. 计算 A后/A前作为判断牛奶是否掺假的根据。根据大量测量数据， 正常比值应该在 9 12， 高于此数值， 即为加入其它含氮物质， 可判为掺假。 5. 有色样品进行脱色后采用上述权利要求 1-4 方法测定。 6. 奶粉可稀释后后采用上述权利要求 1-4 方法测定。 权 利 要 求 书 CN 103575678 A 2 1/4 页 3 一种用乙醇变性快速测定乳制品中蛋白质掺假的方法 技术领。
4、域 0001 乳制品中总蛋白质含量可用比色法测定， 将发明将乳制品用考马斯亮兰法测定， 其吸光度为 A前。同时， 将其用 1 ： 2 的乙醇变性沉淀， 过滤后， 滤液用相同的考马斯亮兰法测 定， 吸光度为 A后。计算 A后/A前作为判断牛奶是否掺假的根据。并和凯氏定氮法的数据进 行校正， 两者扣除后， 可得到乳制品中非蛋白质的含氮物质含量， 使其得到更好的利用于食 品、 医药和保健品等领域。 背景技术 0002 牛奶、 奶粉等乳制品由于营养价值高， 随着人民生活水平的提高， 得到快速发展。 0003 到2010年， 中国将有5700万户城市家庭步入中产阶层， 其中多数中国城市家庭处 于 4-6。
5、 个成年人抚养一个孩子的阶段。届时， 中国将可能成为高端婴幼儿奶粉市场的第一 大市场。相信， 中国的乳制品市场有着巨大的发展空间。 0004 乳制品作为新生婴幼儿的重要的营养来源， 甚至在很大程度上替代了母乳的分 量， 越来越直接地影响着千万新生儿的身体健康和生命安全， 并直接影响着千千万万个普 通家庭。自 “三聚氰胺” 事件发生后， 我国的乳制品市场格局发生了剧烈的变革， 但乳制品 安全依然成为行业企业乃至全社会最关心的问题。 同时， 也对牛奶、 奶粉等乳制品的质量安 全提出了更高的要求。 0005 蛋白质是乳制品最重要的营养成分， 是乳制品作为营养补充剂的根本指标， 对蛋 白质含量的检测是。
6、控制乳产品质量的重要手段。但是， 由于现行的测定乳制品的方法是凯 氏定氮法， 测定的是总的含氮量， 这给不法分子以可乘之机， 可以在产品中加入尿素、 三聚 氰胺等高含氮的物质， 以冒充蛋白质。最近， 发生的三聚氰胺奶粉事件， 给少年儿童的健康 造成了极大的损害， 因此， 建立一种能快速甄别掺假乳制品的测定方法是十分必要的。 0006 众所周知， 现行的标准蛋白质测定方法是凯氏定氮法， 其基本原理是 ： 食品 ( 以及 所有含氮化合物 ) 经加入硫酸消化使蛋白质和各种含氮化合物分解， 其中氮素与硫酸化合 成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离， 用硼酸液吸收后， 再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗 量， 再。
7、乘以换算系数即为蛋白含量。该方法准确度较高， 并且由于历史的原因， 是一种公认 的标准方法， 各种数据容易比较、 对照， 所以， 至今仍是标准的蛋白质测定方法。 0007 但该方法繁琐、 费时、 费力， 生产过程中， 要即时测定、 控制很难 ； 由于难以同时测 定多个样品， 要检测大量样品时， 十分困难。 0008 另一个严重的困扰是， 在已知含有其他含氮化合物的时候必须测定非蛋白质类含 氮化合物的量加以扣除， 但是， 当一个非自然物质含有的非蛋白质类含氮化合物不明确的 情况下， 就无法扣除， 测定方法就产生误差。特别是当产品中非法地加入尿素、 三聚氰胺等 含氮的物质时， 均可被消化、 测定，。
8、 并无法扣除， 即使现在已经研究了测定尿素、 三聚氰胺的 方法， 但是， 不能排除不法分子用其他非蛋白质类含氮化合物冒充作假。 0009 总之， 凯氏定氮法费时、 费力， 也难易判断出掺假， 不能快速测定是否掺假。 0010 其它蛋白质分析方法有很多， 有电泳法、 质谱法、 光谱法等。综合考虑， 光谱法快 说 明 书 CN 103575678 A 3 2/4 页 4 速、 方便、 成本低， 是一种切实可行的方法。 0011 常用的分析蛋白质的光谱法包括 ： 紫外光谱法、 双缩脲法、 Folin 酚法、 BCA 法、 考 马斯亮兰法等。 0012 紫外光谱法是直接利用蛋白质在 280nm 的吸收。
9、进行测定， 该法简便， 使用的仪器 比较普及， 设备价格不高。 0013 双缩脲法是利用蛋白质中的肽键和碱性硫酸铜中的铜离子形成紫色络合物， 从而 进行定量。该法选择性和准确度好， 精密度好 ； 呈色稳定性好， 试剂单一， 方法简便。 0014 Folin 酚法是双缩脲反应的发展， 它结合了双缩脲反应法中铜盐反应与 Folin 试 剂反应的特点， 首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物， 然后该复合物通过芳香族氨基 酸残基、 酪氨酸和色氨酸残基的迅速反应及肽链或极性侧链或两者的铜络合物较慢的反 应， 而把磷钼酸、 磷钨酸色团还原成深蓝色， 在 750nm 处测定光吸收值。此颜色反应和蛋白 质含量。
10、在一定范围内成线性关系。该法灵敏度较高。 0015 BCA 法的原理是在碱性溶液中， 蛋白质将二价铜还原成一价铜， 后者与测定试剂中 BCAbicin-choninic acid(金鸡宁)生成一个在562nm处具有最大光吸收的紫色复合物。 复合物的光吸收强度与蛋白质浓度正比。BCA 法操作简单， 灵敏度与 Folin 一酚法相似， 试 剂十分稳定， 因此对时间控制不需那么严格。 显色后， 1h内吸光度值无变化。 抗试剂干扰的 能力强。 0016 考马斯亮兰是利用 G-250( 一种染料 ) 和蛋白质结合， 兰色加深， 测定 595nm 处吸 光度进行定量。该法灵敏度高， 快速简便， 干扰少。 。
11、0017 其它各种各种方法则更加繁琐。 0018 以上各种方法， 均需要制作标准曲线， 所需时间较长 ； 判断掺假也较困难。 0019 现在， 一般通过色谱法等方法检测掺假的成分， 但色谱法是针对各个物质分别测 定， 从定性到定量， 时间很长， 几天都算短的。 0020 总之， 现有方法要判断乳制品中掺假， 时间较长。鉴于以上原因， 必须寻找快速测 定蛋白质掺假的方法。 发明内容 0021 本发明将牛奶用考马斯亮兰法测定， 其吸光度为 A前。同时， 将其用 1 ： 2 的乙醇变 性沉淀， 过滤后， 滤液用相同的考马斯亮兰法测定， 吸光度为 A后。计算 A后/A前作为判断牛 奶是否掺假的根据。根。
12、据大量测量数据， 正常比值应该在 9 12， 高于此数值， 即为加 入其它含氮物质， 可判为掺假。 0022 所需时间仅 20 分钟， 大大缩短了判断掺假的时间。 0023 有色样品进行脱色后采用上述方法测定。 0024 奶粉可稀释后后采用上述方法测定。 具体实施方式 0025 实施例一 0026 1. 取市售 5 种牛奶各 1mL， 分别放入 1 5 号的 100mL 容量瓶中， 定容至刻度线。 从各容量瓶中取 1ml 稀释过的牛奶放入相应的 25mL 比色管中， 再加入 5mlL 配制好的考马 说 明 书 CN 103575678 A 4 3/4 页 5 斯亮蓝， 定容到 10mL 刻度线。
13、， 摇匀。用紫外分光光度计在 595nm 处测定吸光度， 计为 A前。 0027 2. 将上述牛奶各取 10mL， 加入 1 ： 2 乙醇 ( 即 20mL)， 振摇， 静置， 过滤， 取滤液， 用 上述完全相同的考马斯亮蓝法测定， 并考虑稀释效应， 吸光度为 A后。 0028 3. 计算 A后/A前的比值， 结果如下 ： 0029 0030 说明上述 5 种牛奶中均不含非蛋白质的含氮物质。 0031 实施例二 0032 1. 取市售牛奶样品 1 份， 用凯氏定氮法测定总氮量 ( 以蛋白质含量计算 )， 为 3.112。分别加入尿素和三聚氰胺等含氮的物质， 分别为 1.0 (1 号 )、 1.。
14、5 (2 号 )、 2.0 (3 号 )( 以蛋白质含量计算 )。 0033 2. 用同实施例一中相同的方法， 考马斯亮蓝显色后测定， 作为 A前。 0034 3. 用同实施例一中相同的 1 ： 2 乙醇变性， 振摇， 静置， 过滤， 取滤液， 用上述完全相 同的考马斯亮蓝法测定， 吸光度为 A后。 0035 4. 计算 A后/A前的比值， 结果如下 ： 0036 0037 掺假之后， A后/A前的比值升高， 大于 12， 可判断为假， 说明该方法可靠。 0038 实施例三 0039 1. 市售有色乳制品样品 5 份， 加入适量的活性炭脱色， 过滤， 滤液用于测定。 0040 2. 分别放入 。
15、1 5 号的 100mL 容量瓶中， 定容至刻度线。从各容量瓶中取 1ml 稀 释过的牛奶放入相应的 25mL 比色管中， 再加入 5mlL 配制好的考马斯亮蓝， 定容到 10mL 刻 度线， 摇匀。用紫外分光光度计在 595nm 处测定吸光度， 计为 A前。 0041 3. 将上述滤液各取 10mL， 加入 1 ： 2 乙醇 ( 即 20mL)， 振摇， 静置， 过滤， 取滤液， 用 上述完全相同的考马斯亮蓝法测定， 并考虑稀释效应， 吸光度为 A后。 0042 4. 计算 A后/A前的比值， 结果如下 ： 0043 0044 说明上述 5 种有色乳制品中均不含非蛋白质的含氮物质， 同时说明。
16、该方法适用于 有色乳制品。 0045 实施例四 0046 1. 市售奶粉样品 5 份， 再进行测定。将上述样品稀释 6 倍， 再进行测定。 0047 2. 分别放入 1 5 号的 100mL 容量瓶中， 定容至刻度线。从各容量瓶中取 1ml 稀 释过的牛奶放入相应的 25mL 比色管中， 再加入 5mlL 配制好的考马斯亮蓝， 定容到 10mL 刻 说 明 书 CN 103575678 A 5 4/4 页 6 度线， 摇匀。用紫外分光光度计在 595nm 处测定吸光度， 计为 A前。 0048 3. 将上述稀释液各取 10mL， 加入 1 ： 2 乙醇 ( 即 20mL)， 振摇， 静置， 过滤， 取滤液， 用上述完全相同的考马斯亮蓝法测定， 并考虑稀释效应， 吸光度为 A后。 0049 4. 计算 A后/A前的比值， 结果如下 ： 0050 0051 说明上述 5 种奶粉均不含非蛋白质的含氮物质， 同时说明该方法适用于奶粉。 说 明 书 CN 103575678 A 6 。