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1、(10)申请公布号 CN 103592395 A (43)申请公布日 2014.02.19 CN 103592395 A (21)申请号 201310647702.4 (22)申请日 2013.12.06 G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路 229 号 申请人 陕西蜂产品工程技术研究中心 (72)发明人 曹炜 王锦梅 赵静 程妮 雷兴生 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 (54) 发明名称 洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法 (57) 摘要 本发明公开了一种鉴别洋槐蜜中掺入油菜蜜 的。
2、方法， 首先用树脂从蜂蜜中提取出酚酸类化合 物， 并用色谱纯甲醇定容制成供试品溶液 ； 再分 别取一定量的十种酚酸对照品， 用色谱纯甲醇定 容配制成对照品溶液。测定方法是分别吸取对照 品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪， 以对 照品为参照物， 测定并记录色谱图， 得到洋槐蜜的 HPLC-ECD 指纹图谱， 再用同样的方法得到油菜蜜 和掺入油菜蜜的洋槐蜜的 HPLC-ECD 指纹图谱， 将 三者进行比较并结合化学计量学的方法来鉴别洋 槐蜜中是否掺入油菜蜜。 本发明设计合理， 分离效 果好、 灵敏度高、 可行性强， 解决了洋槐蜜掺假鉴 别及质量控制中的一个重要的技术问题。 (51)Int.Cl.。
3、 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103592395 A CN 103592395 A 1/1 页 2 1. 一种洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 取重量份 1 3 份没食子酸、 1 3 份原儿茶酸、 8 10 份对羟基苯甲酸、 1 3 份绿 原酸、 1 3 份咖啡酸、 1 3 份丁香酸、 1 3 份p香豆酸、 1 3 份阿魏酸、 1 3 份鞣花酸和 1 3 份迷迭香酸十种酚酸标准品用色谱纯甲醇溶解并定容， 配制成对照品。
4、溶液 ； （2） 将纯洋槐蜜、 纯油菜蜜及掺有质量百分含量 5% 50% 油菜蜜的洋槐蜜样品加蒸馏 水溶解， 调节 pH 为 2 3 得到蜂蜜水溶液， 蜂蜜水溶液通过装填有 XAD 2、 LS 46D、 DM 130、 LS 08 或 AB 8 树脂的层析柱， 分别用 pH 为 2 3 的盐酸水溶液和蒸馏水冲洗柱子， 再用甲醇洗脱， 蒸干洗脱液得到的残留物用色谱纯甲醇溶解并定容， 配制成供试品溶液 ； （3） 分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪中， 得到对照品色谱图和 纯洋槐蜜， 纯油菜蜜以及掺有油菜蜜的洋槐蜜的 HPLC ECD （高效液相色谱串联电化学检测 器） 指纹图谱 ；。
5、 （4） 吸取加有对照品溶液的供试品溶液， 分别注入高效液相色谱仪中， 测定并记录色谱 图， 分别得到加有对照品溶液的纯洋槐蜜和纯油菜蜜的 HPLC ECD 图谱 ； （5） 将纯洋槐蜜的 HPLC ECD 指纹图谱和纯油菜蜜的 HPLC ECD 指纹图谱对比， 保留时 间21.15 min 为绿原酸的共有峰， 保留时间56.26 min为鞣花酸的共有峰， 这两个峰作为鉴 别洋槐蜜和油菜蜜的特征峰 ； （6） 以十种酚酸的含量为参数， 运用化学计量学中主成分分析的方法对蜂蜜样品进行 分析， 样品被分为三类， 第一类是纯洋槐蜜， 第二类是纯油菜蜜， 第三类是掺有 5% 以上油菜 蜜的洋槐蜜 ； 。
6、（7） 将通过主成分分析得到的两个主成分 X1和 X2作为 Fisher 判别分析的两个判别指 标， 带入判别函数 F1、 F2 和 F3 中， 求得 Fisher 判别函数大小， 数值最大的即为相应类别， F1=-1.564X1+42.471X2-17.434 F2=-67.055X1-53.279X2-67.556 F3=-12.255X1+24.581X2-11.561 其中， X1 为主成分 1; X2主成分 2 ； F1 为纯洋槐蜜的判别函数， F2 为纯油菜蜜的判别函 数 ； F3 为掺有 5% 以上油菜蜜的洋槐蜜的判别函数。 2. 根据权利要求 1 所述洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方。
7、法， 其特征在于色谱条件为 ： 色 谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料， 流动相为甲醇和 0.1% 醋酸水溶液 ； 采用梯度洗 脱方式 ； 流速 1.0 ml/min ； 检测电压 ： 0.8 1.0V ； 检测波长 ： 260 nm 或 280 nm 或 290 nm 或 320 nm ； 柱温 ： 30 。 3. 根据权利要求 1 所述洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 称 取纯洋槐蜜、 纯油菜蜜及掺有质量百分比为 5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50% 油菜蜜的洋槐蜜样 品， 加入 5 倍重量的蒸馏水溶解， 并用 HCl 调节 pH 值为 。
8、2 得到蜂蜜水溶液。 4. 根据权利要求 3 所述洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 中， 蜂 蜜水溶液通过装填有 Ambethte XAD 2 树脂的层析柱。 权 利 要 求 书 CN 103592395 A 2 1/5 页 3 洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法 技术领域 0001 本发明涉及一种洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法， 特别是利用高效液相色谱指纹 图谱结合化学计量学法鉴别洋槐蜜中掺有油菜蜜的方法， 属于食品科学领域。 背景技术 0002 蜂蜜 (honey) 是蜜蜂采集植物的花蜜、 分泌物或蜜露， 与自身分泌物结合后 , 经 充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜被誉为。
9、 “百花之精” ， 是公认的具有多种生物活性的天然 食品。蜂蜜中的黄酮、 酚酸、 有机酸、 蛋白质和氨基酸等微量活性物质和蜜源植物的种类密 切相关， 这些物质是蜂蜜发挥抗氧化， 抗动脉粥样硬化， 抗感染， 抗肿瘤和抗骨质疏松症等 功效的重要成分。蜂蜜的质量取决于蜜源种类及其化学组成。由于蜂蜜的感官特征易受加 工、 贮存、 结晶等因素影响， 不同种类蜂蜜的主要成分间含量不显著， 传统的方法难以辨别 蜂蜜品种。而且国内市场蜂蜜质量良莠不齐， 掺假造假现象严重挫伤了消费者的购买积极 性， 致使国内消费市场增长缓慢， 成为我国当前蜂蜜市场上存在的一个极为严重的问题。 如 何鉴别蜂蜜产品掺假已经成为我国。
10、蜂蜜产业亟待解决的问题。所以， 有必要开展蜂蜜真伪 鉴定的研究， 以保护消费者利益和保证蜂业健康发展。 0003 洋槐蜜 （Robinia pseudacacia L） 又名刺槐蜜， 呈水白色， 透名状， 具有槐花香味， 不易结晶， 为上等蜂蜜。洋槐遍及我国华北、 西北、 东北南部的广大地区， 花期短而集中。洋 槐蜜内含丰富的葡萄糖、 果糖和多种维生素及矿物质， 具有抗菌消炎， 清热解毒， 防止血管 硬化等特殊功效， 深受各国人所喜爱。 然而蜂蜜的生产受到植物地理位置、 植物花期、 气候、 蜂群强弱以及取蜜时间等的影响， 使得洋槐蜜的产量较低， 一直处于供不应求状况。 因油菜 蜜与洋槐蜜在色泽。
11、、 气味及成分上极其相似， 近年来在洋槐蜜中掺入油菜蜜的现象屡屡发 生。现行蜂蜜质量控制主要针对糖类和多酚两大类成分， 而这两类成分在洋槐蜜和油菜蜜 中同时存在， 这使得区分洋槐蜜和掺有油菜蜜的洋槐蜜变得相当困难。 因此， 建立一种有效 区分洋槐蜜和掺有油菜蜜的洋槐蜜的分析方法是控制洋槐蜜质量的关键。 0004 化学计量学是一种能够最大限度提取指纹图谱数据中有用信息的学科。 其中主成 分分析是一种多元统计分析技术， 它是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标 的一种方法， 主成分分析的目的是简化数据和揭示变量间的关系， 当原始变量被换算成新 变量后， 其结果还可以进一步用于与回归、 聚类。
12、分析等。 发明内容 0005 本发明目的是提供一种洋槐蜜中掺有质量百分含量大于 5% 的油菜蜜的鉴别方 法， 该方法使用HPLCECD测定蜂蜜中的十种酚酸， 结合化学计量学的方法来判断洋槐蜜的 真伪， 从而控制洋槐蜜的质量。 0006 本发明的目的是通过以下方案实现的 ： 一种洋槐蜜中掺有油菜蜜的鉴别方法， 包括以下步骤 ： （1） 取重量份 1 3 份没食子酸、 1 3 份原儿茶酸、 8 10 份对羟基苯甲酸、 1 3 份绿 说 明 书 CN 103592395 A 3 2/5 页 4 原酸、 1 3 份咖啡酸、 1 3 份丁香酸、 1 3 份p香豆酸、 1 3 份阿魏酸、 1 3 份鞣花酸。
13、和 1 3 份迷迭香酸十种酚酸标准品用色谱纯甲醇溶解并定容， 配制成对照品溶液 ； （2） 将纯洋槐蜜、 纯油菜蜜及掺有质量百分含量 5% 50% 油菜蜜的洋槐蜜样品加蒸馏 水溶解， 调节 pH 为 2 3 得到蜂蜜水溶液， 蜂蜜水溶液通过装填有 XAD 2、 LS 46D、 DM 130、 LS 308 或 AB 8 树脂的层析柱， 分别用 pH 为 2 3 的盐酸水溶液和蒸馏水冲洗柱子， 再用甲醇洗脱， 蒸干洗脱液得到的残留物用色谱纯甲醇溶解并定容， 配制成供试品溶液 ； （3） 分别吸取对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪中， 得到对照品色谱图和 纯洋槐蜜， 纯油菜蜜以及掺有油菜蜜的。
14、洋槐蜜的 HPLC ECD （高效液相色谱串联电化学检测 器） 指纹图谱 ； （4） 吸取加有对照品溶液的供试品溶液， 分别注入高效液相色谱仪中， 测定并记录色谱 图， 分别得到加有对照品溶液的纯洋槐蜜和纯油菜蜜的 HPLC ECD 图谱 ； （5） 将纯洋槐蜜的 HPLC ECD 指纹图谱和纯油菜蜜的 HPLC ECD 指纹图谱对比， 保留时 间21.15 min 为绿原酸的共有峰， 保留时间56.26 min为鞣花酸的共有峰， 这两个峰作为鉴 别洋槐蜜和油菜蜜的特征峰 ； （6） 以十种酚酸的含量为参数， 运用化学计量学中主成分分析的方法对蜂蜜样品进行 分析， 样品被分为三类， 第一类是纯。
15、洋槐蜜， 第二类是纯油菜蜜， 第三类是掺有 5% 以上油菜 蜜的洋槐蜜 ； （7） 将通过主成分分析得到的两个主成分 X1和 X2作为 Fisher 判别分析的两个判别指 标， 带入判别函数 F1、 F2 和 F3 中， 求得 Fisher 判别函数大小， 数值最大的即为相应类别， F1=-1.564X1+42.471X2-17.434 F2=-67.055X1-53.279X2-67.556 F3=-12.255X1+24.581X2-11.561 其中， X1 为主成分 1; X2主成分 2 ； F1 为纯洋槐蜜的判别函数， F2 为纯油菜蜜的判别函 数 ； F3 为掺有 5% 以上油菜蜜。
16、的洋槐蜜的判别函数。 0007 上述色谱条件为 ： 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料， 流动相为甲醇和 0.1% 醋酸水溶液 ； 采用梯度洗脱方式 ； 流速 1.0 ml/min ； 检测电压 ： 0.8 1.0V ； 检测波长 ： 260 nm 或 280 nm 或 290 nm 或 320 nm ； 柱温 ： 30 。 0008 上述步骤 （2） 中， 称取纯洋槐蜜、 纯油菜蜜及掺有质量百分比为 5%、 10%、 20%、 30%， 40%、 50%油菜蜜的洋槐蜜样品， 加入5倍重量的蒸馏水溶解， 并用HCl调节pH值为2得到蜂 蜜水溶液。蜂蜜水溶液通过装填有 Ambethte XAD。
17、 2 树脂的层析柱。 0009 本发明的优点与积极效果 ：（1） 本发明经采自中国不同地区的纯洋槐蜜样品以及 采自国内不同地区的纯油菜蜜样品进行反复验证， 证明该方法分离效果好、 灵敏度高、 可行 性强， 该方法可以鉴别纯洋槐蜜和掺有 5% 以上的油菜蜜的洋槐蜜。 （2） 本发明以十种酚酸 为参照， 建立了 HPLC ECD 指纹图谱与化学计量学结合的分析方法来区分洋槐蜜和掺有油 菜蜜的洋槐蜜， HPL ECD 测定酚酸具有灵敏度高， 分离效果好等优点。 （3） 本发明采用电化 学检测器 （ECD） ， 选择性和灵敏度优于紫外检测器， 检测限能达到纳摩尔级甚至皮摩尔级， 更适用于检测含量低且具。
18、有氧化还原性活性的酚酸类化合物。 附图说明 说 明 书 CN 103592395 A 4 3/5 页 5 0010 图 1 为十种酚酸 HPLC ECD 图谱 ； 图 2 为 A. 纯洋槐蜜 HPLC ECD 指纹图谱 ； B. 加入对照品后的纯洋槐蜜 HPLC ECD 图 谱 ； 图 3 为 A. 纯油菜蜜 HPLC ECD 指纹图谱 ； B. 加入对照品后的纯油菜蜜 HPLC ECD 图 谱 ； 图 4 为掺有不同含量油菜蜜的洋槐蜜 HPLC ECD 图谱 ； 图 5 为 A. 主成分分析载荷图 ； B 主成分分析得分图。 具体实施方式 0011 下面结合附图和实施例作进一步的说明。 00。
19、12 分别精密称取0.0330 mg没食子酸、 0.0205 mg原儿茶酸、 0.2700 mg对羟基苯甲 酸、 0.12 mg 绿原酸、 0.0190 mg 咖啡酸、 0.0270 mg 丁香酸、 0.0150 mg p香豆酸、 0.0540 mg阿魏酸、 0.0520 mg鞣花酸和0.0640 mg迷迭香酸十种酚酸标准品， 用色谱纯甲醇溶解并 定容至 10 mL， 为对照品溶液。用 0.45 m 微孔膜过滤， 用 HPLC ECD 分析。采用 ZORBAX SB C18（250 mm4.6 mm, 5 m） ， 流动相为 ： A ： 甲醇 B ： 0.1% 醋酸水溶液 ； 采用梯度洗 脱方。
20、式 ： 0 min 10 min 20 min 25 min 30 min 50 min 60 min 70 min， 甲醇 ： 5% 15% 15% 17% 30% 40% 55% 70%， 1.0% 醋酸水溶液 ： 95% 85% 85% 83% 70% 60%45%30% ； 流速 ： 1.0 ml/min ； 检测电压 ： 0.9 V ； 检测波长 ： 260 nm ； 柱温 ： 30 ， 进样 量 10 l。参见图 1. 分别称取 20 批次的纯洋槐蜜样品 （S1 至 S10 为不同产地的纯洋槐蜜样品） ， 20 批次的 纯油菜蜜样品 （S11至S20为不同产地的纯油菜蜜样品） 和掺。
21、有5%、 10%、 20%、 30%， 40%、 50%油 菜蜜的洋槐蜜 （W/W） 样品 （S21 S26） 5g， 分别置于 150 ml 烧杯中， 用 25 ml 蒸馏水溶解， 并 用 HCl 调节 pH 值为 2 ； 将蜂蜜水溶液转入已装好的 Ambethte XAD 2 吸附树脂层析柱 （25 cm 5 cm） 中， 分别用 100 ml 酸性水溶液 （用 HCl 调 pH 值为 2） ， 150 ml 蒸馏水洗脱除去 糖等极性化合物后， 再用150 ml的甲醇洗脱至无色， 收集甲醇部分， 45减压条件下浓缩至 干， 浓缩物用 2 ml 色谱甲醇溶解， 为供试品溶液。用 0.45 m。
22、 微孔膜过滤， 用上述 HPLC ECD 法分析。分别参见图 2、 3 和 4。图中 1 ： 没食子酸 ； 2 ： 原儿茶酸 ； 3 ： 对羟基苯甲酸 ； 4 ： 绿原酸 ； 5 ： 咖啡酸 ； 6 ： 丁香酸 ； 7 ：p香豆酸 ； 8 ： 阿魏酸 ； 9 ： 鞣花酸 ； 10 ： 迷迭香酸。 0013 以十种酚酸的含量为参数， 运用主成分分析法对蜂蜜样品进行分析， 分别参见表 1、 图 5。 0014 根据上述方法， 分别测定了 20 批次的纯洋槐蜜样品， 20 批次的纯油菜蜜样品和掺 有 5%、 10%、 20%、 30%， 40%、 50% 油菜蜜的洋槐蜜的 HPLC ECD 图谱， 。
23、并得到十种酚酸的含量。 其中绿原酸在纯洋槐蜜中的含量较高， 鞣花酸在纯油菜蜜中的含量较高， 因此， 绿原酸和鞣 花酸共同形成了鉴别洋槐蜜和油菜蜜的特征峰。结合化学计量学中主成分分析的方法， 对 样品中十种酚酸的含量进一步分析， 发现绿原酸和鞣花酸的含量对分类结果影响较大， 且 样品被分为三类， 第一类是纯洋槐蜜， 第二类是纯油菜蜜， 第三类是掺有油菜蜜的洋槐蜜。 因此， 本发明适用于洋槐蜜中掺有 5% 以上油菜蜜的鉴别。 说 明 书 CN 103592395 A 5 4/5 页 6 说 明 书 CN 103592395 A 6 5/5 页 7 说 明 书 CN 103592395 A 7 1/5 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103592395 A 8 2/5 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103592395 A 9 3/5 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103592395 A 10 4/5 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103592395 A 11 5/5 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103592395 A 12 。