一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质及其制备方法技术领域
本发明涉及毛细管电泳的筛分介质技术领域，具体涉及一种用于毛细管电泳的无胶筛
分介质及其制备方法。
背景技术
现有技术中，毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)又叫高效毛细管电泳
(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在
75μm内径的毛细管柱内加高电压进行分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等
建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦，Cohen和
Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出现了第一批商品化的毛细管电泳仪。短
短几年内，由于毛细管电泳(CE)符合以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋
白质(包括酶、抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，从而得到了迅
速的发展。
毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品在
电场下移动速率不同而达到分离目的的液相微分离分析技术，具有分离效率高、分析时间
短、样品消耗少等优点。毛细管电泳通常使用石英毛细管，内径范围在50μm至100μm，
长度从25cm到75cm。在DNA分离过程中，分离介质起着非常重要的作用，它决定了DNA
的迁移特性、分离度、读出长度、重现性、注入时间、注入压力以及毛细管寿命等，因此
分离介质的研究是DNA分离与测序工作中最重要的组成部分之一。分离介质可分为凝胶筛
分介质和无胶筛分介质(非交联的高分子溶液)两种。1989年首次报道了以水溶性高分子
溶液为介质的毛细管电泳成功地分离了dsDNA，自此高分子溶液取代凝胶而作为DNA分离
介质得到广泛研究。
理想的DNA分离介质应具备：良好的筛分性能；自涂覆能力，以抑制电渗流以及消除
DNA与毛细管管壁之间的吸附作用；良好的溶解能力和高亲水性；高分子量、低粘度，以
便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化；在碱性条件下具有良好的化学稳定
性。现已形成以聚丙烯酰胺(LPA)和聚二甲基丙烯酰胺(PDMA)为主，其他多种高分子
聚合物为辅的无胶筛分体系。
STR分型及ssDNA测序分析使用的溶液通常以一定浓度的线性均聚物作为溶质。亲水
性聚合物以非共价方式吸附到毛细管内壁，抑制电渗流并能避免DNA与内壁的相互作用。
LPA具有高亲水性和优良的DNA分离能力。但是它还有高粘度、在高PH值条件下易于水解
等缺点。我们在聚合丙烯酰胺时严格控制聚合反应温度、时间等影响因素，通过控制分子
量从而提高LPA的缠结热稳定性，发挥其高亲水性及良好的筛分能力。
中国专利CN102220599B公开了一种聚合物链的准互穿聚合物网络，所述聚合物链包
括:
(a)长链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在800kDa～1200kDa的范
围；(b)短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链，其粘均分子量在20kDa～60kDa的范
围；和(c)丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺的无规共聚物链，所述无规共聚物在所述长链
线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链(a)和所述短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)链(b)
的存在下通过将丙烯酰胺单体和N，N二甲基丙烯酰胺单体进行氧化还原自由基聚合制备，
所述无规共聚物的分子量大小在1MDa～10MDa的范围，其中在所述丙烯酰胺和N，N-二甲
基丙烯酰胺的无视共聚物链中，所述单体丙烯酰胺和所述单体N，N一二甲基丙烯酰胺的重
量比为90：10～99.9：O.1；其中，所述长链、短链线性聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)和所
述丙烯酰胺和N，N一二甲基丙烯酰胺的无视共聚物链彼此缠结、互穿，形成聚合物链的准
互穿聚合物网络，并且其中，所述聚合物链的准互穿聚合物网络无化学交联，和其中所述
无视共聚(丙烯酰胺-N，N-二甲基丙烯酰胺)与所述长链聚(N，N二甲基丙烯酰胺)和所
述短链聚(N，N一二甲基丙烯酰胺)两者之和的重量比是50：50～99：10。但是，该专利
还存在分辨率低、稳定性差的问题。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供制备的筛分介质可用于STR分型、ssDNA测
序的毛细管电泳分离，本发明提供一种制备具有高分辨率、高稳定性、低粘度的毛细管电
泳无胶筛分介质及其制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合
物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去
离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基
二乙胺，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为
20-30g：180-270ml：5.24-7.86ml：1.0-2.0ml：1.0-2.0ml，得到无胶筛分介质。
进一步地，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的
配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml。
进一步地，所述无胶筛分介质是聚丙烯酰胺。
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)：将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚合
物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸
铵，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺混合物；
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵和N,N,N,N-四甲基二乙胺的配比为
25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml；在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
步骤2)：对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液
中进行溶胀步骤；
步骤3)：再经抽滤步骤获得所述筛分介质，所述抽滤步骤是将溶胀后的溶液经0.2μ
m的尼龙滤器过滤，所述筛分介质是聚丙烯酰胺。
进一步地，步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中通入高纯氮气条件，反应时间为
10-60分钟，聚合反应温度为35℃。
进一步地，所述反应时间为90分钟。
进一步地，所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0.5M：0.5M：0.02M：7M的三羟甲基氨基
甲烷、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸、乙二胺四乙酸钙离络合剂和尿素溶液。
进一步地，步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透析袋进行透析。
进一步地，所述聚丙烯酰胺重均分子量范围为10-100KDa。
进一步地，所述聚丙烯酰胺重均分子量为20-40KDa。
与现有技术相比，优越效果在于：本发明制备的筛分介质具有良好的筛分性能，具有
良好的溶解能力和高亲水性，能够有效的减少DNA与毛细管管壁之间的吸附作用，高分子
量、低粘度，便于注入和更换介质，利于DNA分析和分离的自动化，完全满足现阶段法医
STR分析检测的目的要求。
附图说明
图1为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的1H-NMR谱图，其中溶剂为D2O；
图2为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的LIZ500电泳结果图谱；
图3为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的Ladder电泳结果图谱；
图4为本发明所述用于毛细管电泳的无胶筛分介质的9947A电泳结果图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
具体说明本发明提供的一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质，包括聚合物单体、溶剂、
链转移剂、引发剂和催化剂，所述聚合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链
转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫酸铵(APS)，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺
(TEMED)，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙
胺(TEMED)的配比为(20-30)g：(180-270)ml：(5.24-7.86)ml：(1.0-2.0)ml：(1.0-2.0)
ml，得到无胶筛分介质，所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-
四甲基二乙胺(TEMED)的配比为25g：222ml：6.55ml：1.25ml：1.25ml，优选。所述无
胶筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA)，结构式如下：
本发明还提供了一种用于毛细管电泳的无胶筛分介质的制备方法，所述方法包括以下
步骤：
步骤1)：将聚合物单体、溶剂、链转移剂、引发剂和催化剂混合步骤，选取所述聚
合物单体为丙烯酰胺，所述溶剂为去离子水，所述链转移剂是异丙醇，所述引发剂是过硫
酸铵(APS)，所述催化剂是N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)；
按照所述丙烯酰胺、去离子水、异丙醇、过硫酸铵(APS)和N,N,N,N-四甲基二乙胺
(TEMED)的配比为(20-30)g：(180-270)ml：(5.24-7.86)ml：(1.0-2.0)ml：(1.0-2.0)
ml；在无氧环境下进行聚合反应，得到聚合物；
步骤2)：对步骤1)得到的所述聚合物经透析步骤、冷冻干燥步骤之后在溶胶缓冲液
中进行溶胀步骤；
步骤3)：经抽滤后获得所述筛分介质，所述抽滤是将溶胀后的溶液经0.2μm的尼龙
滤器过滤，所述筛分介质是聚丙烯酰胺(LPA)。步骤1)中所述无氧环境是在反应容器中
通入高纯氮气条件，反应时间为10-60分钟，聚合反应温度为35℃，本实施例的所述反
应时间为90分钟。所述溶胶缓冲液为浓度配比是：0.5M：0.5M：0.02M：7M的三羟甲基
氨基甲烷(Tris)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、乙二胺四乙酸钙离络合
剂(EDTA)和尿素溶液，其中步骤2)中所述透析步骤选用截留分子量为12-14KDa的透
析袋进行透析。本发明中，所述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)范围为10-100KDa，优选所
述聚丙烯酰胺重均分子量(Mw)为20-40KDa。
实施例2
本实施例中，所用试剂主要来自Sigma-Aldrich公司(USA)。具体操作是按照在如下
步骤制备：在圆底烧瓶中加入222ml去离子水与6.55ml异丙醇(分析纯)在35℃下通入
高纯氮气(99.99％)对溶液除氧10分钟。然后依次加入25g丙烯酰胺(AM)、1.25ml10％
(v/v)的N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED)和1.25ml10％(w/v)的过硫酸铵(APS)，500rpm
下进行磁力搅拌，反应90min后，溶液呈蜂蜜粘稠状。选用截留分子量为12-14KDa的透
析袋(Spectra/por#2，Spectrum公司，USA)透析三天。透析后聚合物溶液经-60℃冷
冻干燥72小时，得到白色固体即为筛分介质，反应得率约为80％。
实施例3筛分介质的表征
11H-NMR光谱仪：用D2O作溶剂，对聚合物(白色固体)进行表征，如图1所示。从
图1中可以看出聚合物(聚丙烯酰胺)的结构正确，并且纯度高，不含有单体和溶剂等杂
质。
2凝胶渗透色谱仪(GPC)：聚合物经WatersBreezeTM2HPLC系统测试分析，柱子是
WatersUltrahydrogelLinearColumn，泵是Waters1515，PDA检测器，流动相是水，
测试结果见表1。
表1凝胶渗透色谱仪(GPC)测试结果
实施例4凝胶的配制
1溶胶缓冲液的配制：
1)10X电泳缓冲液称取6.05g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、12.16gN-三(羟甲基)
甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、0.74gEDTA加入到含80ml去离子水的100ml容量瓶中混
匀，加入去离子水定容至100ml；
2)1X电泳缓冲液称量19g尿素(分析纯)。加入到一个干净的100ml容量瓶中，加
入25ml去离子水，手动温和摇匀直到所有尿素溶解。加入5ml10X电泳缓冲液，温和振
荡，加入去离子水定容至50ml。
2凝胶的配制：
称取白色固体状的聚丙烯酰胺2g，加入50ml1X电泳缓冲液，过夜进行溶胀。使用
0.2μm的滤器过滤，收集过滤物放入一个干净的容量瓶中，摄氏温度4℃保存，防止尿素
降解。
实施例5电泳检测
LIZ500分子量内标的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied
Biosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图2所示，电泳结果经GeneMapperID-X(AppliedBiosystems，USA)分析，可
见LIZ500内标峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象。
等位基因Ladder的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied
Biosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图3所示，电泳结果经GeneMapperID-X(AppliedBiosystems，USA)分析，可
见等位基因Ladder峰型尖锐，分离度好，能够分离长度相差1bp的DNA片段，无杂峰、
无拖尾现象，无丢峰现象。
进行9947A的检测：
1、采用配制的凝胶；
2、在GA118-16A型遗传分析仪上进行电泳检测；
电泳条件：毛细管长度是16X36cm，电泳电压是15KV，电泳温度是60℃；
3、换新配置的1XRunningBuffer(310and31xxRunningBuffer,Applied
Biosystems，USA)；
4、启动自动换胶系统；
5、按照操作说明进行了毛细管电泳检测。
如图4所示，电泳结果经(GeneMapperID-X(AppliedBiosystems，USA)分析，可
见9947A分型正确，峰型尖锐，分离度好，无杂峰、非特异性峰且无拖尾现象，无丢峰
现象。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人
员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。