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1、10申请公布号CN104080473A43申请公布日20141001CN104080473A21申请号201280068260122申请日2012112861/563,98520111128USA61K38/28200601A61K38/00200601C07H21/0420060171申请人费斯生物制药公司地址美国宾夕法尼亚州72发明人J乔维特C伍兹74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人刘国军54发明名称包含胰岛素氨基酸序列的治疗剂57摘要本发明部分地涉及提供从注射部位缓慢吸收的药剂。在一些实施方案中，药物组合物包含胰岛素氨基酸序列和提供从注射部位缓慢吸收的氨基酸序列，例如像具。
2、有脯氨酸残基的基本上重复模式的氨基酸序列。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014072886PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0667952012112887PCT国际申请的公布数据WO2013/082116EN2013060651INTCL权利要求书2页说明书18页序列表33页附图15页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书18页序列表33页附图15页10申请公布号CN104080473ACN104080473A1/2页21一种用于提供持续血糖控制的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的蛋白质，所述蛋白质包含胰岛素氨基酸序列和提供从注。
3、射部位持续释放的氨基酸序列；以及药物赋形剂，以实现持续释放。2如权利要求1所述的药物组合物，其中所述胰岛素氨基酸序列包含A链和B链氨基酸序列，其中所述A链和B链具有氨基酸序列SEQIDNO13，任选地具有总共1至8处氨基酸插入、缺失或取代。3如权利要求2所述的药物组合物，其中所述提供从所述注射部位缓慢吸收的氨基酸序列与所述胰岛素A链共价结合。4如权利要求2或3所述的药物组合物，其中所述A链与所述B链通过一个或多个二硫键结合。5如权利要求2或3所述的药物组合物，其中所述A链与所述B链经由肽或化学接头连接。6如权利要求1所述的药物组合物，其中所述提供持续释放的氨基酸序列具有脯氨酸残基的基本上重复模。
4、式。7如权利要求6所述的药物组合物，其中所述提供持续释放的氨基酸序列是弹性蛋白样肽ELP氨基酸序列。8如权利要求7所述的药物组合物，其中所述ELP包含VPGXGSEQIDNO3的重复序列，其中每个X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸残基。9如权利要求8所述的药物组合物，其中X是缬氨酸。10如权利要求9所述的药物组合物，其中所述ELP的氨基酸序列包含AVGVPSEQIDNO4、IPGVGSEQIDNO6或LPGVGSEQIDNO8的重复序列。11如权利要求10中任一。
5、项所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP氨基酸单元的至少15个重复序列。12如权利要求10所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP单元的至少30个重复序列。13如权利要求10所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP单元的至少60个重复序列。14如权利要求10所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP单元的至少90个重复序列。15如权利要求10所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP单元的至少120个重复序列。16如权利要求10所述的药物组合物，其中所述ELP包含ELP单元的至少180个重复序列。17如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含SEQIDNO14。18如权利要求。
6、7所述的药物组合物，其中所述ELP在生理盐水中具有略低于37的转变温度。19如权利要求1所述的药物组合物，其中所述提供持续释放的氨基酸序列形成无规权利要求书CN104080473A2/2页3卷曲或非球状延伸结构或非结构化的生物聚合物，包括如由仇法斯门算法所确定，其中至少50的氨基酸缺乏二级结构的生物聚合物。20如权利要求1所述的药物组合物，其中所述氨基酸序列是具有延伸的非球状结构或无规卷曲结构的蛋白质。21如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物是融合蛋白。22如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含约110MM的氯化钠和约20MM的组氨酸。23如权利要求1所述的药物组合物。
7、，其中所述药物组合物经过配制以用于约每周施用一次。24如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物经过配制以用于每天施用一次。25如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物经过配制以用于以约05MG/ML至约200MG/ML的剂量施用。26如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物经过配制以用于以约10MG/ML至约50MG/ML的剂量施用。27一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括施用提供持续血糖控制的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的蛋白质，所述蛋白质包含胰岛素氨基酸序列和提供从注射部位持续释放的氨基酸序列；以及药物赋形剂，以在有需要的患者体内实现持续释放。28如权利要求2。
8、7所述的方法，其中所述患者患有1型糖尿病。29如权利要求27所述的方法，其中所述患者患有2型糖尿病。30如权利要求27所述的方法，其中以每月1次至约30次的频率施用所述药物组合物。31如权利要求27所述的方法，其中约每周施用所述药物组合物一次。32如权利要求27所述的方法，其中每周施用所述药物组合物两次或三次。33如权利要求27所述的方法，其中约每天施用所述药物组合物一次。34如权利要求27所述的方法，其中皮下施用所述药物组合物。权利要求书CN104080473A1/18页4包含胰岛素氨基酸序列的治疗剂0001优先权0002本申请要求2011年11月28日提交的美国临时申请NO61/563,9。
9、85的优先权，该美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。技术领域0003本发明部分地涉及具有持续生物作用的胰岛素形式及其衍生物。0004以电子方式递交的文本文件的描述0005随同以电子方式递交的以下文本文件的内容以引用的方式整体并入本文序列表的计算机可读格式的拷贝文件名PHAS_025_01WO_SEQLIST_ST25TXT，记录日期2012年11月28日，文件大小38千字节。背景技术0006肽类药物和小分子药物的有效性经常因这些药物在循环中的半衰期以及难以获得基本上恒定的血浆水平而受到限制。举例来说，肠促胰岛素GLP1必须以相对高的剂量施用以应对它在循环中较短的半衰期，并且这些高剂量尤。
10、其与恶心有关。MURPHY和BLOOM,NONPEPTIDICGLUCAGONLIKEPEPTIDE1RECEPTORAGONISTSAMAGICBULLETFORDIABETESPNAS10436896902007。此外，肽类药剂血管活性肠肽VIP据一些估算值展现出短于一分钟的半衰期，从而使得这种药剂对于药物使用来说不切实际。DOMSCHKE等,VASOACTIVEINTESTINALPEPTIDEINMANPHARMACOKINETICS,METABOLICANDCIRCULATORYEFFECTS,GUT19104910531978；HENNING和SAWMILLER,VASOACTIV。
11、EINTESTINALPEPTIDECARDIOVASCULAREFFECTS,CARDIOVASCULARRESEARCH4927372001。肽类药物的血浆半衰期较短经常是由于快速的肾清除率以及在全身循环期间的酶促降解。0007胰岛素或其衍生物也遭遇到类似的困难。胰岛素仅在它被酶例如胰岛素酶降解之前短暂的时间内具有活性，并且因此仅具有约6分钟的半衰期。而且，胰岛素可以很快地被受试者所吸收，并且因此所述受试者可能需要每天两次或更多次的胰岛素注射，其中基于对血糖水平进行自我监测来对剂量加以调整。此外，胰岛素水平出现高峰和低谷会使得受试者产生显著的并发症。仍需要如下的胰岛素疗法，所述胰岛素疗法显。
12、示出向循环中的缓慢吸收作用并且提供长时间的稳态水平的葡萄糖控制作用。发明内容0008本发明提供了用于持续释放的基于胰岛素的药物制剂，以及用于递送使用所述持续释放制剂进行的治疗方案的方法。本发明从而为基于胰岛素的药物制剂提供了改进的药物代谢动力学。0009在一个方面，本发明提供了一种用于提供持续血糖控制的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的蛋白质，所述蛋白质包含胰岛素氨基酸序列和提供从注射部位持续说明书CN104080473A2/18页5释放的氨基酸序列；以及药物赋形剂，以实现持续释放。0010在另一个方面，本发明提供了治疗糖尿病的方法，所述方法包括施用用于提供持续血糖控制的药物组合物。所述组。
13、合物包含有效量的蛋白质，所述蛋白质包含胰岛素氨基酸序列和提供从注射部位持续释放的氨基酸序列；以及药物赋形剂，以在有需要的患者体内实现持续释放。在一些实施方案中，所述患者患有1型糖尿病或2型糖尿病。在一些实施方案中，所述方法包括以每月1至约30次，或约每周一次，或每周约两次或三次，或约每天一次的频率施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括皮下施用所述药物组合物。0011附图简述0012图1A示出了人胰岛素原序列SEQIDNO13。胰岛素原序列由通过C肽连接的B链和A链组成。在两个邻近的双碱性氨基酸位点以加下划线的斜体字指示处进行酶促切割后，C肽被去除以形成成熟的胰岛素。0013图1B示。
14、出了被称作PE0139或因素美INSUMERA或胰岛素ELP1120的构造的简图，所述构造具有融合至A链的C端上的120个ELP单元。0014图2示出了PPE0139质粒的图谱。0015图3示出了胰岛素原ELP1120融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO14。胰岛素原序列加下划线与ELP1120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N端上包括起始甲硫氨酸残基。0016图4示出了非还原性SDSPAGE实验。非还原性SDSPAGE示出了在酶促加工后因C肽被切除所引起的融合蛋白分子量出现预期降低。泳道1PLUS2预染标准品INVITROGEN；泳道2ELP1120；泳道3胰岛素原ELP1120；泳道4胰岛素。
15、ELP120，3G；泳道5胰岛素ELP1120，6G；泳道6PLUS2预染标准品INVITROGEN。0017图5示出了抗胰岛素B链蛋白质印迹。进行抗胰岛素B链蛋白质印迹以确定与ELP融合的A链和B链两者的存在。数据显示B链在非还原性条件下存在，指示A链与B链之间形成二硫键。将融合蛋白和二硫键还原会使得B链从融合体中被去除。泳道1经过还原的胰岛素ELP融合体，示出了不存在B链；泳道2未经过还原的胰岛素ELP融合体，示出了B链的存在；泳道3ELP1120；泳道4胰岛素原ELP融合体，示出了B链的存在。0018图6示出了未经过加工的胰岛素ELP1120的ESIMS数据。电喷雾电离质谱分析确定未经过。
16、加工的胰岛素原ELP融合体的质量是570085DASGSMSCAN代码104531和104532。存在另外的盐加合物。0019图7示出了经过加工的PPE0139的ESIMS数据。电喷雾电离质谱分析确定在酶促去除C肽后成熟胰岛素ELP融合体的质量SGSMSCAN代码107610。胰岛素ELP的ESIMS显示具有约53298DA的分子质量的主产物峰，所述主产物峰指示在C肽被切除后的成熟胰岛素ELP。次峰有可能归属于部分降解的融合体或盐加合物。0020图8示出了与甘精胰岛素INSULINGLARGINE相比，使用胰岛素ELP1120融合体使得正常小鼠的血糖下降。0021图9示出了使用因素美PE013。
17、9对1型糖尿病DIABETESMELLITUSTYPE1/TYPE1DIABETES，T1DM小鼠模型进行给药。确切地说，示出了单次给药的数据。结果表明说明书CN104080473A3/18页6与给予等摩尔浓度的来得时LANTUS甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美的葡萄糖降低作用的持续时间更长。STZ是链脲菌素STREPTOZOTOCIN；未处理组指的是正常的未患糖尿病的动物；每组N8。0022图10示出了使用因素美PE0139对1型糖尿病T1DM小鼠模型进行给药。确切地说，示出了每天一次给药的数据。结果表明与来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美在活性和半衰。
18、期方面具有优越性。STZ是链脲菌素；未处理组指的是正常的未患糖尿病的动物；在第6小时的时间点，25MG/KG组和50MG/KG组的N5；在第8小时的时间点，25MG/KG组的N3而50MG/KG组的N2；在第24小时的时间点，25MG/KG组的N1而5MG/KG组的N7。0023图11A示出了与来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美PE0139在1型糖尿病T1DM小鼠模型中的低剂量滴定。确切地说，图11A示出了单次皮下给药。STZ是链脲菌素；未处理组指的是正常的未患糖尿病的动物；来得时组、1MG/KGPE0139组和未处理组的N8；333MG/KGPE0139组的N7。002。
19、4图11B示出了与来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美PE0139在1型糖尿病T1DM小鼠模型中的低剂量滴定。确切地说，图11B示出了持续14天的每天一次皮下给药。STZ是链脲菌素；未处理组指的是正常的未患糖尿病的动物；来得时组、1MG/KGPE0139组和未处理组的N8；333MG/KGPE0139组的N7。0025图12A示出了相对于来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS，因素美PE0139具有显著增强的血糖控制。在第1天、第3天、第7天以及第14天，观测到相对于来得时，血糖曲线下面积AUC减少2739。确切地说，图12A示出了化合物施用的第1天以及024小时的血。
20、糖AUC。0026图12B示出了相对于来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS，因素美PE0139具有显著增强的血糖控制。在第1天、第3天、第7天以及第14天，观测到相对于来得时，血糖曲线下面积AUC减少2739。确切地说，图12B示出了化合物施用的第14天以及024小时的血糖AUC。0027图13A示出了因素美PE0139在皮下注射后实现了长半衰期和较小的峰谷比。确切地说，图13A示出了在对患有糖尿病的猪进行单次皮下注射后的药物代谢动力学PK药物水平。0028图13B示出了因素美PE0139在每天一次皮下注射后实现了稳态峰/谷药物代谢动力学PK水平。确切地说，图13B示出了每天对患有糖尿。
21、病的猪进行皮下注射一次，持续2周；在给药之前测量PK水平。0029发明详述0030本发明提供了展现出持续生物作用的基于胰岛素的药物组合物。还提供了使用本发明的组合物治疗包括高血糖症和糖尿病在内的疾病的方法。0031在一个方面，本发明提供了一种用于提供持续血糖控制的药物组合物，该药物组合物包含有效量的蛋白质，所述蛋白质包含胰岛素氨基酸序列和提供从注射部位持续释放的氨基酸序列；以及药物赋形剂，以实现持续释放。0032在一些实施方案中，胰岛素氨基酸序列包含A链和B链氨基酸序列，并且A链和B链具有氨基酸序列SEQIDNO13图1，任选地具有总共1至8处氨基酸插入、缺失或取说明书CN104080473A。
22、4/18页7代。在一些实施方案中，提供从注射部位缓慢吸收的氨基酸序列与胰岛素A链共价结合。在另一个实施方案中，A链与B链通过一个或多个二硫键结合或经由肽或化学接头连接。0033在另一个实施方案中，提供持续释放的氨基酸序列具有脯氨酸残基的基本上重复模式。所述基本上重复模式可以形成一系列转角或转角的模式。在其它实施方案中，提供持续释放的氨基酸序列是弹性蛋白样肽ELP氨基酸序列。在另一个实施方案中，ELP包含VPGXGSEQIDNO3的重复序列，其中每个X独立地选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨。
23、酸、酪氨酸以及缬氨酸残基。在另一个实施方案中，ELP氨基酸序列包含AVGVPSEQIDNO4、IPGVGSEQIDNO6或LPGVGSEQIDNO8的重复序列。在各种实施方案中，ELP包含ELP氨基酸单元的至少15个，或至少30个，或至少60个，或至少90个，或至少120个，或至少180个重复序列。在另一个实施方案中，ELP氨基酸序列在生理盐水中具有略低于37的转变温度。0034在另一个实施方案中，药物组合物是融合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含SEQIDNO14图3。0035在又另一个实施方案中，提供持续释放的氨基酸序列形成无规卷曲或非球状延伸结构或非结构化的生物聚合物，包括如由仇法。
24、斯门算法CHOUFASMANALGORITHM所确定，其中至少50的氨基酸缺乏二级结构的生物聚合物。在又另一个实施方案中，提供持续释放的氨基酸序列是具有延伸的非球状结构或无规卷曲结构的蛋白质。0036在另一个方面，本发明提供了治疗糖尿病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述患者患有高血糖症、1型糖尿病或2型糖尿病，或者肥胖症。在一些实施方案中，所述方法包括以每月1至约30次，或约每周一次，或每周约两次或三次，或约每天一次的频率施用所述药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括皮下施用所述药物组合物。0037胰岛素氨基酸序列0038胰岛素注射液，例如人。
25、胰岛素的注射液可以用于治疗糖尿病。体内的胰岛素产生细胞被称作细胞，并且它们存在于胰腺中。这些细胞聚集在一起以形成“郎格罕氏岛ISLETOFLANGERHANS”，所述郎格罕氏岛是以对它们进行描述的德国医学生的名字命名的。0039胰岛素的合成从胰岛素基因的翻译开始，所述胰岛素基因存在于染色体11上。在翻译期间，两个内含子从MRNA产物中被剪接掉，所述MRNA产物编码长度为110个氨基酸的蛋白质。这种初级翻译产物被称作前胰岛素原并且无活性。它含有长度为24个氨基酸的信号肽，所述信号肽是为蛋白质穿过细胞膜所需要的。人胰岛素原由通过具有31个氨基酸的C肽连接在一起的A链和B链组成图1。0040在前胰岛。
26、素原到达内质网后，蛋白酶将信号肽切除，从而产生胰岛素原。确切地说，在A链与B链之间形成二硫键后，通过胰蛋白酶/羧肽酶B样系统将C肽去除而将胰岛素原在体内转化为成熟胰岛素。胰岛素原由以下三个结构域组成氨基端B链、羧基端A链、以及处于中间的被称为C肽的连接肽。胰岛素由通过两个二硫桥键连接在一起的被命名为链A21个氨基酸，GIVEQCCASVCSLYQLENYCNSEQIDNO15和链B30个氨基酸，FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKASEQIDNO16的两条氨基酸链构成。在A链内存在说明书CN104080473A5/18页8第三个二硫桥键，所述二硫桥键将A链的第6个残基与第。
27、11个残基连接在一起。在大多数的物种中，链A和链B的长度和氨基酸组成是相似的，并且这三个二硫键的位置是高度保守的。出于这个原因，猪胰岛素可以补充糖尿病患者体内不足的人胰岛素水平。现今，猪胰岛素已经基本上被利用细菌大批量生产的人胰岛素原重组胰岛素所取代。0041胰岛素分子在溶液中倾向于形成二聚体，并且在锌离子存在下，胰岛素二聚体缔合成六聚体。虽然胰岛素的单体容易通过血液扩散并且具有快速的作用，但是六聚体缓慢扩散并且具有延迟的起始作用时间。在设计重组胰岛素时，可以通过降低胰岛素分子形成二聚体和六聚体的倾向，但不干扰与胰岛素受体的结合作用的方式对胰岛素的结构进行修饰。以这种方式，制成了从短效到长效不。
28、等的一系列制备物。0042在内质网内，胰岛素原暴露于多种特异性肽酶，所述肽酶将C肽去除并且产生成熟的并且具有活性的形式的胰岛素。在高尔基体中，胰岛素和游离的C肽被包装到分泌颗粒中，这些分泌颗粒在细胞的细胞质中积聚。这些颗粒的胞外分泌由葡萄糖进入到细胞中所触发。胰岛素的分泌对代谢有广泛的影响。0043响应于葡萄糖升高，胰岛素的释放存在两个阶段。第一个阶段是胰岛素立即释放。这可归因于储存在分泌颗粒中的预先形成的胰岛素释放。在短暂的延迟之后，再出现新合成的胰岛素更长时间的释放。0044在释放后，胰岛素仅在它被酶降解之前短暂的时间内具有活性。肝脏和肾脏中存在的胰岛素酶分解血浆中循环的胰岛素，并且因此，。
29、胰岛素仅具有约6分钟的半衰期。这种短暂的作用持续时间会使得胰岛素的循环水平发生快速的变化。0045已经研发出具有改进的治疗特性的胰岛素类似物OWENS等,2001,LANCET35873946；VAJO等,2001,ENDOCRREV2270617，并且这些类似物可以与本发明结合使用。使用包括延长胰岛素B链的COOH末端以及对针对白蛋白具有相当大的亲和力的经脂肪酸酰化了的胰岛素进行工程化在内的不同的策略来产生更长效的胰岛素类似物。然而，使用可获得的更长效胰岛素化合物进行的体内治疗仍会导致低血糖和高血糖波动频繁出现以及HBA1C适度降低。因此，研发真正长效并且稳定的人胰岛素类似物仍然是一项重要的。
30、任务。0046可以根据本发明使用的胰岛素的功能类似物包括速效类似物，如赖脯胰岛素LISPRO、门冬胰岛素ASPART以及赖谷胰岛素GLULISINE，这些速效类似物在皮下注射之后被快速吸收100,000的多肽，PCT/US96/05186其特此以引用的方式整体并入中所公开的疏水性标度提供了一种用于对具体ELP序列的近似TT进行预测的手段。对于分子量37下不会转变的相对小说明书CN104080473A1715/18页18的ELP组分例如小于约30KDA、25KDA、20KDA、15KDA或10KDA的ELP组分化学偶联或交联。举例来说，可以将具有相同或不同特性的两个相对小的ELP组分化学偶联。在。
31、一些实施方案中，这种偶联可以在体内，通过在ELP的C端上或周围添加单个半胱氨酸残基来进行。这些ELP组分可以各自与一个或多个胰岛素氨基酸序列融合，以便提高对靶标的活性或亲合力。0118治疗疾病的方法0119在各种实施方案中，如本文所述的本发明的药物组合物用于对患有如糖尿病或高血糖症的病变或胰岛素施用所适用的任何其它病状的患者进行处理和护理以便对抗或缓解包括各种代谢病症在内的那些病状的症状和并发症。治疗包括施用本发明的制剂以防止这些症状或并发症发作、缓解这些症状或并发症，或消除所述疾病、病状或病症。本发明的方法包括治疗1型糖尿病，即身体不产生胰岛素并且因此不能控制血液中糖的量的病状；以及2型糖尿。
32、病，即身体不能正常地利用胰岛素并且因此不能控制血液中糖的量的病状。0120在各种实施方案中，持续释放提供了持续的血糖控制。血糖控制指的是患有糖尿病的人体内典型的血糖葡萄糖水平。糖尿病的许多长期并发症包括微血管并发症由多年的高血糖症所引起。良好的血糖控制是糖尿病护理的一个重要的目标。由于血糖水平在全天期间会发生波动并且葡萄糖记录是这些变化的不完善的指标，所以在对患有糖尿病的人进行的研究试验和临床护理中使用糖化血红蛋白的百分比作为长期血糖控制的替代性量度。在这项检查中，血红蛋白A1C或糖化血红蛋白反映了在前23个月期间的平均葡萄糖值。0121在具有正常葡萄糖代谢的未患糖尿病的人中，通过大部分常见的。
33、方法所测定的糖化血红蛋白的水平通常是约46正常范围可能根据方法而变化。“理想的血糖控制”表示葡萄糖水平始终正常例如约70130MG/DL，或约3972MMOL/L并且与未患糖尿病的人没有区别。实际上，由于治疗措施的不完善，所以即使是“良好的血糖控制”也描述了在大部分时间平均略高于正常水平的血糖水平。应指出的是，被认为是“良好的血糖控制”的情况根据患者的年龄以及对低血糖的敏感性而不同。美国糖尿病协会AMERICANDIABETESASSOCIATION倡导患者和医师应争取使得平均葡萄糖和血红蛋白A1C值低于200MG/DL11MMOL/L和8。“不良的血糖控制”指的是在严重并发症出现之前的数月和。
34、数年内血糖水平和糖化血红蛋白水平持续升高，可能在例如约200500MG/DL约1128MMOL/L和约915或更高的范围内。0122在各种实施方案中，本发明提供了包含本文所述的药物组合物和有效治疗诸如上述那些疾病之类的疾病的其它药剂的组合疗法和/或共同制剂。0123在一个实施方案中，本发明提供了与以下物质的组合或共同制剂胰高血糖素样受体GLP1受体激动剂，如GLP1SEQIDNO22、毒蜥外泌肽4EXENDIN4SEQIDNO23，或其如美国专利8,178,495中所公开的功能类似物和/或衍生物，所述美国专利特此以引用的方式并入。在一些实施方案中，GLP1是GLP1AB，其中A是1至7的整数并。
35、且B是38至45的整数。在一些实施方案中，GLP1是GLP1736SEQIDNO24或其功能类似物，或者GLP1737SEQIDNO25或其功能类似物。0124在另一个实施方案中，本发明提供了与GLP2SEQIDNO26、GIPSEQIDNO27、胰高血糖素SEQIDNO28以及胃泌酸调节素SEQIDNO29或其功能类似物说明书CN104080473A1816/18页19和/或衍生物的组合或共同制剂。功能类似物相对于天然序列可以含有1至10处氨基酸插入、缺失和/或取代总共。0125在各种实施方案中，组合疗法和/或共同制剂包含具有例如本文所述的ELP或基质形成组分的融合蛋白。在一些实施方案中，E。
36、LP包含至少60个VPGXG单元SEQIDNO30或90个VPGXG单元SEQIDNO31或120个VPGXG单元SEQIDNO32或180个VPGXG单元SEQIDNO33，其中X是独立选择的氨基酸。在各种实施方案中，X是V、G或A，它们的比率是532；或K、V或F，它们的比率是121；或K、V或F，它们的比率是171；或V。0126在另一个实施方案中，本发明提供了与如本文所述的各种形式的胰岛素的组合或共同制剂。在一个实施方案中，所述胰岛素是快速起效或速效胰岛素。实施例0127将人胰岛素原与ELP1120生物聚合物进行基因融合并且在大肠杆菌ECOLI的可溶性部分中表达。在将胰岛素原部分纯化酶。
37、促加工为成熟胰岛素之后，在正常的小鼠模型中测试融合蛋白的葡萄糖降低作用并且与单独的胰岛素相比较。胰岛素ELP融合体显示出类似于胰岛素的葡萄糖降低作用。另外，据显示，融合蛋白的降低作用在模型中所延续的持续时间长于胰岛素。0128胰岛素融合体建构0129人胰岛素原由通过具有31个氨基酸的C肽连接在一起的B链和A链组成图1A和1B。在B链与A链之间形成二硫键后，通过胰蛋白酶/羧肽酶B样系统将C肽去除而将胰岛素原在体内转化为成熟胰岛素。这种肽加工在体外可以使用重组胰蛋白酶和羧肽酶B来复制。由于使融合体在大肠杆菌的可溶性部分中表达，所以不需要重新折叠步骤。0130合成胰岛素原核苷酸序列并且将所述胰岛素原。
38、核苷酸序列亚克隆到基于PET的载体PPB1031中，所述载体PPB1031将它定位在ELP1120序列的N端上，从而产生质粒PPE0139图2。0131图3示出了胰岛素原ELP1120融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO14。胰岛素原序列加下划线与ELP1120序列融合。所述氨基酸序列任选地在N端上包括起始甲硫氨酸残基。0132发酵0133以分批补料发酵方法使胰岛素ELP融合体质粒PPE0139在T7启动子的控制下在大肠杆菌的细胞内部分中表达。使用两级摇瓶种子罐SEEDTRAIN在含有作为主要碳源的甘油和作为主要氮源的酵母提取物的半合成无动物成分培养基ECPM脯氨酸中对甘油细胞储液进行扩增。在种。
39、子罐中达到足够的细胞密度之后，将培养物转移至与种子罐容纳相同的培养基的发酵罐中。经由PID控制将过程参数PH值、温度、溶解氧维持在设定点。对培养物进行培养直到它达到静止期为止，此时开始甘油/酵母提取物/硫酸镁进料。在限制碳的情况下维持培养物并且使用IPTG对启动子进行诱导。在发酵结束时，将培养物离心以从用过的培养基中分离含有胰岛素ELP融合体的生物质。将细胞糊状物储存在70下直到后续纯化为止。0134纯化说明书CN104080473A1917/18页200135将冷冻的细胞糊状物重悬于含有2M脲用于使胰岛素ELP解离的溶解缓冲液中并且混合直到均质为止。使用微射流均质机MICROFLUIDIZE。
40、R实现溶解以破坏细胞膜。使用两级切向流过滤TFF系统将产物澄清并且浓缩。使胰岛素ELP融合体穿过HIC柱作为捕获步骤，并且将宿主细胞污染物洗去。使用对任何产物相关杂质降解的物质进行分级分离的梯度来对产物进行洗脱。对所选的级分进行TFF缓冲液交换以去除残留的盐，之后使用两个阴离子交换柱以去除残留的DNA、内毒素以及宿主细胞蛋白质。使用最终的TFF浓缩和缓冲液交换来配制产物。使用02M过滤进行灭菌。将产物储存在4下直到进行酶消化为止。0136胰岛素原ELP融合体PE0083的酶促加工0137在配制缓冲液中将经过纯化的胰岛素原ELP1120稀释至1MG/ML。如下制备用于将胰岛素原ELP加工为成熟的。
41、胰岛素ELP的2X酶溶液50MM碳酸氢钠、2UG/ML胰蛋白酶以及20UG/ML羧肽酶B。将2X酶溶液添加至等体积的1MG/MLPE0083中并且在37下孵育12小时。利用ELP的相转变特性停止酶促反应。将氯化钠添加至反应物中以诱导融合体发生相转变。成熟的胰岛素ELP形成凝聚层并且经由离心使其沉淀。将残留的酶洗去并且将沉淀的融合体重新溶解于低盐缓冲液中。进行两次相转变纯化。0138非还原性SDSPAGE图4示出了在酶促加工后因C肽被切除所引起的融合蛋白分子量出现预期降低。0139进行抗胰岛素B链蛋白质印迹图5以确定与ELP融合的A链和B链两者的存在。数据显示B链在非还原性条件下存在，指示A链与。
42、B链之间形成二硫键。将融合蛋白和二硫键还原会使得B链从融合体中被去除。0140电喷雾电离质谱分析确定胰岛素原ELP融合体的质量图6以及在酶促去除C肽后成熟胰岛素ELP融合体的质量图7。另外的盐加合物存在于两种样品中。使用埃尔曼试剂测定法ELLMANSREAGENTASSAY确定二硫键的存在。不存在游离硫醇指示形成二硫键。0141体内葡萄糖降低作用0142将正常的小鼠禁食过夜并且使用盐水阴性对照、13NMOL/KG甘精胰岛素阳性对照或35NMOL/KG胰岛素ELP融合体因素美进行皮下注射。在给药之前获得血糖读数并且在给药后8小时期间每过1小时之后以及在给药后24小时获得血糖读数。在给药后1小时使。
43、得食物可被获得。图8示出了血糖数据平均值SE。相比于盐水对照组，胰岛素ELP融合体显示出显著的血糖降低作用。另外，胰岛素ELP融合体所显示的血糖降低作用的延续时间7小时长于甘精胰岛素对照2小时。0143在1型糖尿病模型中的体内作用0144使用ELP胰岛素融合体因素美PE0139对1型糖尿病T1DM小鼠模型进行给药。确切地说，单次给药的数据示于图9中。结果表明与给予等摩尔浓度的来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美的葡萄糖降低作用的持续时间更长。当按每天一次方案给予所述化合物时图10，结果表明因素美与来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比在活性和半衰期方面具有优越性。。
44、0145图11A和11B示出了与来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS相比，因素美PE0139在1型糖尿病T1DM小鼠模型中的低剂量滴定。图11A示出了单次皮下给药，而说明书CN104080473A2018/18页21图11B示出了持续14天的每天一次皮下给药。在两种情况下，均显示出因素美具有更加显著和持续的血糖降低作用。0146还进行研究以确定因素美的血糖控制程度，所述血糖控制程度是患者典型的血糖水平的量度。图12A和11B示出了相对于来得时甘精胰岛素，SANOFIAVENTIS，因素美PE0139具有显著增强的血糖控制。观测到血糖曲线下面积AUC减少了2739。图12A示出了化合物施。
45、用的第1天以及024小时的血糖AUC。图12B示出了化合物施用的第14天以及024小时的血糖AUC。在两种给药方案中，因素美比来得时更有效地使血糖AUC减少。0147还进行研究来评价因素美治疗的药物代谢动力学PK。在患有糖尿病的猪中，遵循单次皮下注射图13A或每天一次皮下注射，持续2周图13B的方案。结果显示因素美在皮下注射后实现了长的半衰期和小的峰谷比。0148等同方案0149本领域技术人员仅仅使用常规的实验就将认识到或能够探悉本文明确描述的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案意图涵盖于以下权利要求书的范围内。说明书CN104080473A211/33页2200010002序列表CN10。
46、4080473A222/33页230003序列表CN104080473A233/33页240004序列表CN104080473A244/33页250005序列表CN104080473A255/33页260006序列表CN104080473A266/33页270007序列表CN104080473A277/33页280008序列表CN104080473A288/33页290009序列表CN104080473A299/33页300010序列表CN104080473A3010/33页310011序列表CN104080473A3111/33页320012序列表CN104080473A3212/33页33。
47、0013序列表CN104080473A3313/33页340014序列表CN104080473A3414/33页350015序列表CN104080473A3515/33页360016序列表CN104080473A3616/33页370017序列表CN104080473A3717/33页380018序列表CN104080473A3818/33页390019序列表CN104080473A3919/33页400020序列表CN104080473A4020/33页410021序列表CN104080473A4121/33页420022序列表CN104080473A4222/33页430023序列表CN1。
48、04080473A4323/33页440024序列表CN104080473A4424/33页450025序列表CN104080473A4525/33页460026序列表CN104080473A4626/33页470027序列表CN104080473A4727/33页480028序列表CN104080473A4828/33页490029序列表CN104080473A4929/33页500030序列表CN104080473A5030/33页510031序列表CN104080473A5131/33页520032序列表CN104080473A5232/33页530033序列表CN104080473A5。
49、333/33页54序列表CN104080473A541/15页55图1A图1B说明书附图CN104080473A552/15页56图2图3说明书附图CN104080473A563/15页57图4说明书附图CN104080473A574/15页58图5说明书附图CN104080473A585/15页59图6说明书附图CN104080473A596/15页60图7说明书附图CN104080473A607/15页61图8说明书附图CN104080473A618/15页62图9说明书附图CN104080473A629/15页63图10说明书附图CN104080473A6310/15页64图11A说明书附图CN104080473A6411/15页65图11B说明书附图CN104080473A6512/15页66图12A说明书附图CN104080473A6613/15页67图12B说明书附图CN104080473A6714/15页68图13A说明书附图CN104080473A6815/15页69图13B说明书附图CN104080473A69。