一种降解石油组分的降解液及降解石油组分的方法.pdf

本发明涉及一种利用纳米竹炭强化功能微生物降解石油组分的方法及应用，所述功能微生物为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）GY2B，所述石油组分包括多环芳烃（菲）和原油，在添加50-200mg/L纳米竹炭的情况下，可显著提高功能菌株GY2B对水中石油组分的降解能力，用海藻酸钠包埋法将纳米竹炭与功能微生物GY2B进行固定化后可应用于含石油组分废水的生物处理和石油污染水体的生物修复。

权利要求书
1.  一种降解石油组分的降解液，其特征在于：所述降解液包括鞘氨醇单胞菌和纳米竹炭，所述鞘氨醇单胞菌是鞘氨醇单胞菌GY2B菌株，该菌株已于2006年2月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC No. M206019。

2.  如权利要求1所述的降解石油组分的降解液，其特征在于：所述纳米竹炭的浓度为50-200 mg/L。

3.  如权利要求1或2所述的降解石油组分的降解液，其特征在于：所述鞘氨醇单胞菌接种至降解液中的初始菌量达到106个/ml以上。

4.  一种如权利要求1-3任一项所述的降解石油组分的方法，其特征在于：用海藻酸钠固定法将纳米竹炭与功能微生物进行固定化，制备出固定化微生物制剂，将所述固定化微生物制剂用于石油组分的降解中。

5.  一种如权利要求1-3任一项所述的降解石油组分的方法，其特征在于：所述降解液用于降解的石油组分包括原油。

6.  一种如权利要求1-3任一项所述的降解石油组分的方法，其特征在于：所述降解液用于降解的石油组分包括多环芳烃菲。

7.  如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多环芳烃菲的浓度为不高于100 mg/L。

8.  如权利要求5所述的方法，其特征在于：原油的浓度为不高于500 mg/L。

9.  如权利要求4所述的方法，其特征在于：在含石油组分废水的生物处理及石油污染水体生物修复中的应用。

说明书一种降解石油组分的降解液及降解石油组分的方法
技术领域
本发明属于环境有机物污染的生物处理与生物修复技术领域，具体涉及一种降解石油组分的降解液及降解石油组分的方法。
背景技术
石油污染是人类生产和生活中不可缺少的重要能源和工业原料。随着石油工业的发展和港口石油运输业的发展，溢油事故发生几率也在增大。据中国海事局2007年公布的数据显示我国平均每三天就发生一起船舶溢油事故，如此频繁密集地发生油污事件，如不采取快速、及时响应，水体石油污染问题将日益凸现，对沿岸及海洋生态环境和人体健康构成严重威胁。石油及石油产品中普遍含有PAHs(多环芳烃)、BTEX(四苯：苯、甲苯、乙苯、二甲苯)和酚类等有毒物质，毒性按烷烃、环烷烃和芳香烃的顺序逐渐增加，其中包括多环芳烃在内的许多成分(如：苯、甲苯、乙苯、萘、菲、蒽、芘、荧蒽、苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苊等)都被列入美国环境保护局(EPA)优先污染物范围。研发开发经济高效的石油类污染物去除技术是改善环境质量的迫切要求，具有很好的应用前景。
生物降解是环境中石油类污染物的主要消除途径之一。利用微生物降解环境中的有机污染物已被广泛接受，其优点在于效果好、费用低、二次污染少等。目前，人们通过人工富集培养等技术，已经分离得到很多能够降解或转化某种污染物的微生物。然而，这些微生物加入到处理/修复现场中时可能由于土著菌的恶性竞争或难以适应环境而导致往往效果不佳，故研发一种可以强化功能微生物降解目标污染物的技术成为目前环境污染治理与修复领域的热点课题之一。
发明人前期已从受污染的环境中筛选出了一株多环芳烃菲的高效降解菌鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)GY2B，如何提高株菌GY2B在实际环境中对目标污染物的降解性能，是本发明所需要解决的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用纳米竹炭强化功能微生物高效降解石油组分的方法及应用。本发明针对上述石油污染环境中石油组分生物降解所面临的问题，寻求一种能够强化功能微生物降解目标污染物石油组分的技术方法，并将该技术应用于含石油组分废水的生物处理及石油污染水体生物修复。
本发明目的通过以下技术方案来实现：一种降解石油组分的降解液，所述降解液包括鞘氨醇单胞菌和纳米竹炭，所述鞘氨醇单胞菌是鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)GY2B菌株，该菌株已于2006年2月24日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNo. M206019，该保藏证明已在专利申请中200610034169.4提交。
其中，所述纳米竹炭的浓度为50-200mg/L。
其中，所述鞘氨醇单胞菌接种至降解液中的初始菌量达到106个/ml以上。
所述降解液优选是含有鞘氨醇单胞菌和纳米竹炭的无机盐培养液。
一种如上所述的降解石油组分的方法，用海藻酸钠固定法将纳米竹炭与功能微生物进行固定化，制备出固定化微生物制剂，将所述固定化微生物制剂用于石油组分的降解中。
一种如上所述的降解石油组分的方法，所述降解液用于降解的石油组分包括原油。
一种如上所述的降解石油组分的方法，所述降解液用于降解的石油组分包括多环芳烃菲。
其中，所述多环芳烃菲的浓度为不高于100mg/L。
其中，原油的浓度为不高于500mg/L。
上述方法中，优选的操作方法为：用海藻酸钠固定法将纳米竹炭与功能微生物进行固定化制备固定化微生物小球，将固定化小球加入到含石油组分的废水或石油污染的水体中，即可实现强化石油组分的生物降解，缩短石油组分在水中的停留时间。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明将纳米竹炭加入到含多环芳烃菲或原油的水中，对功能微生物GY2B降解上述污染物具有明显的强化作用，缩短上述污染物在水中的停留时间。
附图说明
图1：纳米竹炭对菌株GY2B降解多环芳烃菲的影响。
图2：纳米竹炭浓度对多环芳烃菲生物降解的影响。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的具体说明，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本实施例中无机盐培养液的配方是：5.0ml/L磷酸盐缓冲液(8.5g/L KH2PO4，21.75g/L K2HPO4·H2O，33.4g/L Na2HPO4·12H2O，5.0g/L NH4Cl)，3.0ml/L MgSO4水溶液(22.5g/L)，1.0ml/L CaCl2水溶液(36.4g/L)，1.0ml/L FeCl3水溶液(0.25g/L)，1.0ml/L微量元素溶液(39.9mg/L MnSO4·H2O，42.8mg/L ZnSO4·H2O，34.7mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O)。但并不限制本技术在应用过程中使用其它的培养液。
实施中用到的纳米竹炭购自上海海诺公司，为大别山烧制的高温竹炭，用物理法活化，纳米级超细研磨制取，为20纳米纯度97％的竹质活性炭粉。
实施例1纳米竹炭促进多环芳烃菲的生物降解
实验例1：取一定量菲的环己烷溶液，内含菲的质量为3mg，置于灭菌的三角瓶中，待环已烷挥发完毕后加入灭菌的无机盐培养液，再加入6mg纳米竹炭，然后按照接种冰箱中保存的GY2B菌液，添加无机盐培养液至30ml，配置后的培养液中初始菌浓度为8×106个/mL、纳米竹炭的浓度为200mg/L、菲浓度为100mg/L，放入温度为30℃，150r/min的振动培养箱培养2天，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图1所示。
对比例1：设置不加纳米竹炭及不加菌的对照实验，即培养液中不加纳米竹炭和不加菌，其余与实验例1相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图1所示。
对比例2：设置不加纳米竹炭的对照实验，即培养液中不加纳米竹炭，其余与实验例1相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图1所示。
对比例3：设置不加菌的对照实验，即培养液中不加菌，其余与实验例1相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图1所示。
菲的残留量采用紫外分光光度法测定，其前处理步骤如下：待测样品中加入等体积的环己烷萃取，萃取液浓缩后过无水硫酸钠，定容后以环己烷作参比，用UV1200分光光度计在254nm处测定其吸光值OD254。
纳米竹炭对鞘氨醇单胞菌GY2B降解菲的影响如图1所示。由图可知，添加200mg/L纳米竹炭后的实验中，菌株GY2B降解菲的速率显著加快：4h菲降解接近40％，8h菲降解约80％(而同期不添加纳米竹炭的样品中菲的降解率不足20％)，18h时只剩6％，48h后菲几乎完全降解。
本实施例说明200mg/L的纳米竹炭可大大促进菌株GY2B对菲的降解效率，缩短菲在水中的停留时间。
实施例2纳米竹炭浓度对多环芳烃菲生物降解的影响
实验例2：将活化后的GY2B菌悬液离心，离心之后倒去上清液，保留下层菌体，然后菌体用磷酸盐缓冲溶液洗涤，之后再离心，然后倒去上清，下层菌体再洗涤，重复三次。
并用无机盐培养基重悬。取2mL上述菌液到18mL无机盐培养基中，所述无机盐培养基中添加有菲和纳米竹炭，接种后培养液中初始菌浓度为9×106个/mL、菲浓度为100mg/L、纳米竹炭的浓度分别为20、50、200mg/L。同时设不加纳米竹炭只加菌的对照实验。定时取样测定菲的残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图2所示。
实验例3：接种后的培养液纳米竹炭的浓度为50mg/L，其余与实验例2相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图2所示。
对比例4：接种后的培养液纳米竹炭的浓度为20mg/L，其余与实验例2相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图2所示。
对比例5：接种后的培养液不添加纳米竹炭，其余与实验例2相同，定时取样测定菲残留量，每个实验设两个平行实验，取平行实验结果的平均值，结果如图2所示。
不同纳米竹炭浓度对多环芳烃菲生物降解的影响如图2所示。由图可知，添加了纳米竹炭的实验组菲的去除率明显快于对照组，且从整体上看，纳米竹炭浓度越高，菲的去除越快。添加50mg/L、200mg/L纳米竹炭的实验组，其在24h的去除率已达到90％，48h几乎完全去除。而不添加纳米竹炭的对照组，其24h菲的去除率还不到75％。
本实施例说明添加的纳米竹炭越多，对多环芳烃菲生物降解的促进作用越明显，其中添加50-200mg/L纳米竹炭的促进作用显著。
实施例3纳米竹炭促进原油的生物降解
实验例4：取1mL活化后的GY2B菌悬液到10mL的无机盐培养液中，无机盐培养液中添加有原油和纳米竹炭，其中原油预先在30℃、150r/min恒温振荡培养箱中振荡挥发48h，接种后培养液中初始菌浓度约为7.5×106个/mL、原油浓度为500mg/L、纳米竹炭的浓度分别为50和200mg/L。同时设不加纳米竹炭只加菌的对照实验，每组实验设两个平行。30℃、150r/min培养72h后取样用环己烷萃取测定原油的残留量。
原油的残留量采用紫外分光光度法测定，以环己烷作参比，用UV2550分光光度计在波长229nm处测定其吸光值OD229，实验结果见表1所示。结果显示，随着纳米竹炭添加量(0、50、500mg/L)的增加，培养液中原油的残留浓度逐渐减少，说明纳米竹炭对菌株GY2B降解原油具有明显的促进作用。
表1纳米竹炭对GY2B降解原油的影响
实验组别 72h原油残留浓度(mg/L) 不加GY2B、不加纳米竹炭 425.3 只加GY2B，不加纳米竹炭 416.5 加GY2B和50mg/L纳米竹炭 387.4 加GY2B和200mg/L纳米竹炭 378.6
本实施例说明添加50-200mg/L的纳米竹炭可明显促进菌株GY2B对原油的降解，缩短原油在水中的停留时间。
实施例4纳米竹炭-海藻酸钠复合固定化微生物制剂
海藻酸钠包埋法制备固定化微生物制剂：取36.5g/L的海藻酸钠溶液20mL，加入2mg纳米竹炭后超声混合均匀(使造粒母液中纳米竹炭浓度为50mg/L)，然后再加入20mL菌株GY2B的生理盐水菌悬，混合均匀后用注射器滴入2％的CaCl2溶液中造粒，固定化1～2h后用洁净灭菌的纱布滤出颗粒，0.90％无菌生理盐水洗涤，4℃保存，此为制得的固定化制剂1。用上述同样方法，但加入纳米竹炭为8mg(使造粒母液中纳米竹炭浓度为200mg/L)制得固定化制剂2。固定化制剂1或2中GY2B菌体浓度约为3×105个/粒。
固定化微生物制剂降解菲的效率：取10mL含100mg/L菲的无机盐培养基，加入30个含纳米竹炭的固定化微生物小球(固定化制剂1或2)到培养基中，放在30℃、150r/min恒温振荡器中避光培养，定时取样测定菲的残留浓度。同时设加入相同菌量的游离菌为对照组。结果见表2所示。结果表明，纳米竹炭-海藻酸钠复合固定化菌株GY2B对菲的降解率略高于对照组游离菌对菲的降解率。
表2固定化微生物制剂与游离菌对菲的降解效果

本实施例说明固定化微生物制剂具有比游离菌更好的菲降解性能。固定化微生物在实际应用中可较少外界不利因素的影响，能较长时间保持生物活性。此外，纳米竹炭和菌固定化后易于与处理后的水进行分离和回收利用，便于实际应用。