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1、10申请公布号CN104054697A43申请公布日20140924CN104054697A21申请号201410318701X22申请日20140707A01N1/0220060171申请人中国水产科学研究院长江水产研究所地址430223湖北省武汉市东湖新技术开发区武大园一路8号72发明人厉萍危起伟席萌丹柳凌郭威乔新美74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用57摘要本发明公开了一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用，本发明的达氏鲟精子冷冻保存液包括蔗糖，海藻糖，三羟基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽，甲醇。本发明所述的达氏。
2、鲟精子冷冻保存液，成分简单，冷冻保存成本低。其中，还原型谷胱甘肽的加入，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。海藻糖的加入，则具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。利用本发明的精子冷冻保存液，解冻后精子活力高于70，受精率达45。51INTCL权利要求书2页说明书7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页10申请公布号CN104054697ACN104054697A1/2页21一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含蔗糖3090MMOL海藻糖1545MMOL三羟甲基氨基甲烷2040MMOL氯化钾052MMOL。
3、还原型谷胱甘肽3298MMOL甲醇00802L其余为去离子水加入甲醇之前的溶液渗透压为6921888MOSM，冷冻保存液的PH为7486。2一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含蔗糖4080MMOL海藻糖2040MMOL三羟甲基氨基甲烷225375MMOL氯化钾07515MMOL还原型谷胱甘肽58MMOL甲醇0085015L其余为去离子水加入甲醇之前的溶液渗透压为891685MOSM，冷冻保存液的PH为7684。3一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含蔗糖5070MMOL海藻糖2535MMOL三羟甲基氨基甲烷2535MMOL氯化钾0813MMOL还原型谷胱甘肽5575MMOL甲。
4、醇009013L其余为去离子水加入甲醇之前的溶液渗透压为10711501MOSM，冷冻保存液的PH为7882。4一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含蔗糖5565MMOL海藻糖275325MMOL三羟甲基氨基甲烷2535MMOL氯化钾0911MMOL还原型谷胱甘肽67MMOL甲醇0095011L其余为去离子水加入甲醇之前的溶液渗透压为11781392MOSM，冷冻保存液的PH为7981。5一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含蔗糖60MMOL海藻糖30MMOL权利要求书CN104054697A2/2页3三羟甲基氨基甲烷30MMOL氯化钾1MMOL还原型谷胱甘肽64MMOL甲醇0。
5、1L其余为去离子水加入甲醇之前的溶液渗透压为1284MOSM，冷冻保存液的PH为80。6权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，其步骤如下1）根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积；2）根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算各组分贮备液的量取体积，计算公式为各组分量取体积各组分的配方浓度冷冻保存液总体积各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混匀，最后加蒸馏水至冷冻保存液的终体积；3）从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积甲醇浓度的体积溶液，再加入等量的甲醇混匀配制成最终的精子冷冻保存液。7权利要求1所述的一种达氏鲟精子冷冻保存液在。
6、达氏鲟精子冷冻保存中的应用。8根据权利要求7所述的应用，其应用过程具体如下1）、精液采集与检测待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4存放；利用显微镜检测精子活力，成活率在90以上的精液用于冷冻保存；2）、精液的稀释、分装和冷冻取100ML精液，加入100ML新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为11；精液与冷冻液混匀后，立刻分装至2ML冷冻管中；同时程序降温仪开启，预冷至0；程序降温从0开始，3/MIN降至5，5/MIN降至15；10/MIN降至25；。
7、20/MIN降至80，在80平衡5MIN后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入液氮中保存；3）、解冻和精子活力检测将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40水浴中，一边摇动一边解冻，至完全融化为止；在载波片上滴加30L蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70以上，运动时间持续34MIN；4）、解冻后精子用于授精将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中，精子与卵子的比值约为3105，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精，轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。权利要求书。
8、CN104054697A1/7页4一种达氏鲟精子冷冻保存液及制备方法和应用技术领域0001本发明属于低温冷冻生物学领域，具体涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液，还涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液的制备方法，还涉及一种达氏鲟精液冷冻保存液的应用，该精液冷冻保存液适合于达氏鲟。背景技术0002鱼类精液超低温冷冻保存技术在鱼类遗传育种研究、鱼类养殖及种质资源保护等方面具有重要的应用价值。鱼类精液超低温冷冻保存技术的研究是从上世纪50年代开始的，国内外学者在淡水和海水经济鱼类以及濒危鱼类的精液冷冻保存技术方面做了大量的工作。鲟鱼类精液冷冻保存技术的研究起步较晚，最初主要是俄罗斯鲟精液冷冻保存。随后，匙吻鲟、西伯。
9、利亚鲟、闪光鲟等其它鲟鱼的精液超低温保存技术也得到了广泛的研究。达氏鲟为我国国家一级保护动物，被世界自然保护联盟IUCN列为极危物种，濒危野生动植物国际贸易公约CITES附录II保护动物。通过精液冷冻保存技术，将其现有种群的精液，长期、有效地保存起来，即建立达氏鲟冷冻精子库，以后用解冻精子与卵子进行人工授精，就可以将达氏鲟的基因资源完全保存下来，为该物种种质资源保护开辟了一条新的途径。0003保存精子的方法很多，主要有低温、常温和冷冻三种。低温和常温用于短期保存精液，而冷冻或超低温冷冻则可以长期保存精液。目前，国内外广泛采用冷冻技术保存精液，常用的抗冻剂有干冰液态二氧化碳，沸点79和液氮沸点1。
10、96等，用液氮保存精液，精子的代谢停滞，精子处于假死状态，但其结构却能保持完整。因此，如何使精子不受影响地以完整结构达到超低温状态，就成为精液超低温保存技术的一项关键问题。0004冷冻保存液的配制是鱼类精液冷冻保存中的关键一环。冷冻保存液是由一定组成成分和配比浓度的稀释液以及一定浓度的抗冻剂组成的，冷冻保存液的适合与否直接影响保存的效果。鱼的种类不同，精子的生理特性也有差异，因而对稀释液和抗冻剂的组成成份和浓度具有不同的要求。鱼类精液冷冻保存稀释液成份很多，主要有盐类如NAHCO3、NACL、KCL、KHCO3、柠檬酸钠等、糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖等、脂类主要是磷脂和蛋白质如卵黄、牛奶、小牛血。
11、清等、以及其他添加剂如甘氨酸、抗生素等。对于鲟鱼的精子来说，稀释液的渗透压要等于或高于精子的渗透压，这样精子被稀释后不会被激活。稀释液的渗透压等同于各组成成分离子浓度之和。这里我们还要注意K离子对鲟鱼精子的抑制作用，无论稀释液的渗透压有多低，只要K离子的浓度高于2MM，精子的运动会被完全抑制，所以K离子在鲟鱼精子稀释液中浓度不可太高，否则会造成不可逆抑制。而糖类等大分子类溶质除了起到调节渗透压的作用外，还具有提供精子能量的作用。脂类和蛋白质以及其他添加剂主要对精子某个部位或某个方面起到保护的作用。常用的抗冻剂有甘油、二甲亚砜、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甲醇等。这类抗冻剂多属低分子中性物质，在溶液。
12、中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护精子的目的。0005一般情况下，精子经冷冻保存后其活力和受精能力均会显著下降，其中部分原因说明书CN104054697A2/7页5取决于膜结构的完整性遭到破坏。大量研究证明精子在冷冻保存过程中会产生氧的自由基或者改变抗氧化酶的活性，从而引起膜脂的过氧化反应、导致膜脂结构和精子渗透压的改变，或直接攻击精子DNA碱基等，最终导致精子生存能力的降低。0006因此，在冷冻保存液的配制过程中，针对某物种的精液，我们不仅要考虑离子及其浓度、糖类组成及浓度以及缓冲液的PH值等，还要思考能否通过添加剂来改善冷冻保存的条件，如抗氧化。
13、剂等，从而提高冷冻保存的效果。本发明旨在达氏鲟精子冷冻保存研究尚存空白的情况下，发明一种达氏鲟精子冷冻保存液能够有效的长期保存达氏鲟的精子，并可极大的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。发明内容0007本发明的目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液，该保存液由蔗糖，海藻糖，三羟甲基氨基甲烷，氯化钾，还原型谷胱甘肽及甲醇按照一定配比混合而成，在达氏鲟精子超低温冷冻保存过程中，可极大的保护精子免受冰晶及氧化等损伤。0008本发明的另一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液的制备方法，方法简单，易行，适于大规模生产，该方法适合配制各种体积的稀释液，可确保所配制稀释液中个组分浓度的准确性。0009本发明的。
14、最后一个目的在于提供了一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，该应用包括利用本发明的达氏鲟精子冷冻保存液进行达氏鲟的精子冷冻保存，还包括利用本发明的配方制备达氏鲟精子冷冻保存液。0010为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施0011一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含001200130014其余为去离子水0015加入甲醇之前的溶液渗透压为6921888MOSM，冷冻保存液的PH为7486。0016一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含0017说明书CN104054697A3/7页60018其余为去离子水0019加入甲醇之前的溶液渗透压为891685MOSM，冷。
15、冻保存液的PH为7684。0020一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含00210022其余为去离子水0023加入甲醇之前的溶液渗透压为10711501MOSM，冷冻保存液的PH为7882。0024一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含00250026其余为去离子水0027加入甲醇之前的溶液渗透压为11781392MOSM，冷冻保存液的PH为7981。0028一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液最佳配比中包含0029说明书CN104054697A4/7页70030其余为去离子水0031加入甲醇之前的溶液渗透压为1284MOSM，冷冻保存液的PH为80。0032一种达氏鲟精子。
16、冷冻保存液的制备方法，其步骤如下00331根据总精液量计算需要冷冻保存液的总体积。00342根据冷冻保存液的总体积和各组分的配方浓度以及各组分贮备液的浓度，计算各组分贮备液的量取体积，计算公式为各组分量取体积各组分的配方浓度冷冻保存液总体积各组分贮备液的浓度，用微量取样器从各组分贮备液中量取相应的体积并混匀，最后加蒸馏水至冷冻保存液的终体积。00353从上述溶液中量取出冷冻保存液总体积甲醇浓度的体积溶液，再加入等量的甲醇混匀配制成最终的精子冷冻保存液。配制好的冷冻保存液应立刻用于精子的超低温冷冻保存。0036一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，其应用过程如下00371、精液采。
17、集与检测0038待达氏鲟繁殖季节，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进行人工催产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4存放。利用显微镜检测精子活力，成活率在90以上的精液用于冷冻保存。00392、精液的稀释、分装和冷冻0040取100ML精液，加入100ML新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为11。精液与冷冻液混匀后，立刻分装至2ML冷冻管中。同时程序降温仪开启，预冷至0。0041程序降温从0开始，3/MIN降至5，5/MIN降至15；10/MIN降至25；20/MIN降至80，在80平衡5MIN后，直接将冷冻管。
18、从程序降温仪中取出，立即放入液氮196中保存。00423、解冻和精子活力检测0043将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40水浴中，一边摇动一边解冻，至完全融化为止。0044在载波片上滴加30L蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70以上，运动时间持续34MIN。00454、解冻后精子用于授精0046将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中精子与卵子的比值约为3105，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子说明书CN104054697A5/7页8受精，轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入。
19、孵化器中孵化。0047与现有技术相比，本发明具有以下优点00481、实现了达氏鲟精子冷冻保存和应用，该方法可以应用于人工繁殖中解决精液量不足的问题，又可以实现达氏鲟种质资源永久保存的目的。00492、精子冷冻保存液成分简单，冷冻保存成本低。00503、冷冻保存液中加入了还原型谷胱甘肽，起到了很好的抗氧化作用，对精子质膜起到很好的保护作用，同时还降低了DNA分子损伤。00514、冷冻保存液中海藻糖的加入，具有防止蛋白质变性，有效保护精子的作用。00525、解冻后精子活力高于70新鲜采集精子活力高于90，受精率达45新鲜采集精子受精率为6070。具体实施方式0053本发明实施例中的技术方案，如未特。
20、别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。0054实施例190055蔗糖、海藻糖、三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、还原型谷胱甘肽、无水乙醇、以及去离子水。以上试剂原料均购置于SIGMA公司。0056储存液的配制005711M浓度的蔗糖贮备液蔗糖分子量342，配制体积100ML的溶液需要蔗糖的重量为342G，将称取的蔗糖放入烧杯中，先加入60ML的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再将溶液定容至100ML。005821M浓度的海藻糖贮备液海藻糖分子量342，配制体积10ML的溶液需要海藻糖的重量为342G，将称取的海藻糖放入10ML的离心管中，先加入6ML的蒸馏水，旋紧离心管的盖子，。
21、上下摇动离心管使海藻糖充分的溶解，再将溶液定容至10ML。0059301M浓度的三羟甲基氨基甲烷贮备液三羟甲基氨基甲烷分子量121，配制体积100ML的溶液需要三羟甲基氨基甲烷的重量为121G，将称取的三羟甲基氨基甲烷放入烧杯中，先加入80ML的蒸馏水，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再用盐酸溶液调节PH，范围为7486，最后将溶液定容至100ML。0060401M浓度的氯化钾贮备液氯化钾分子量7455，配制体积50ML的溶液需要氯化钾的重量为0373G，将称取的氯化钾放入50ML的离心管中，先加入40ML的蒸馏水，旋紧离心管的盖子，上下摇动离心管使氯化钾充分的溶解，再将溶液定容至50ML。0061。
22、5032M浓度还原型谷胱甘肽贮备液还原型谷胱甘肽分子量30732，配制体积1ML的溶液需要还原型谷胱甘肽的重量为01G，将称取的还原型谷胱甘肽放入1ML的离心管中，先加入05ML的蒸馏水，盖紧离心管，上下摇动离心管使还原型谷胱甘肽充分的溶解，再将溶液定容至1ML。0062上述贮备液均须配制新鲜的溶液,可暂时放置4冰箱保存。0063一种达氏鲟精子冷冻保存液，每升冷冻保存液中包含0064说明书CN104054697A6/7页90065一种达氏鲟精子冷冻保存液，其制备方法如下，以实例5所述配方进行说明0066配制100ML的冷冻保存液，首先从各原料贮备液中吸取蔗糖6ML、海藻糖3ML、三羟甲基氨基甲。
23、烷PH8030ML、氯化钾1ML、还原型谷胱甘肽2ML混合，加入蒸馏水58ML充分混匀调配成稀释液，再将稀释液吸出10ML弃掉，加入10ML无水甲醇，最终配制成25MOL抗冻剂浓度的冷冻保存液。0067实施例100068一种达氏鲟精子冷冻保存液在达氏鲟精子冷冻保存中的应用，其应用过程如下0069所用的达氏鲟精子冷冻保存液配方及制备方法为上述实例5所示，该冷冻保存液即配即用。0070以超低温196冷冻保存100ML达氏鲟精液为例，说明达氏鲟精子冷冻保存液的使用方法。00711、精液采集与检测0072待达氏鲟繁殖季节3月中旬至4月初，对雄性亲鱼进行B超检查性腺发育状况，对达到性成熟的亲鱼进行人工催。
24、产，采集精液时，用干毛巾擦净亲鱼生殖孔周围，挤压腹部，收集无粪便和杂物的干净精液于塑料袋中，充氧后密封并于4存放。利用显微镜检测精子活力，成活率在90以上的精液用于冷冻保存。00732、精液的稀释、分装和冷冻0074取100ML精液，加入100ML新鲜配制的冷冻保存液，稀释比为11。精液与冷冻液混匀后，立刻分装至2ML冷冻管中。同时程序降温仪开启，预冷至0。0075程序降温从0开始，3/MIN降至5，5/MIN降至15；10/MIN降至25；20/MIN降至80，在80平衡5MIN后，直接将冷冻管从程序降温仪中取出，立即放入液氮196中保存。说明书CN104054697A7/7页1000763。
25、、解冻和精子活力检测0077将装有精子的冷冻管从液氮中取出，立即浸入40水浴中，一边摇动一边解冻，至完全融化为止，大概需要105S。0078在载波片上滴加30L蒸馏水，然后用针尖蘸取少许精液，迅速涂在蒸馏水中，并利用显微镜观察精子激活后的运动状况，精子活力达70以上，运动时间持续34MIN。00794、解冻后精子用于授精0080将采集的成熟卵置于洁净、干燥的容器中，再将解冻后的精液加入卵中精子与卵子的比值约为3105，用手轻轻搅动，使精卵充分混匀，然后加水，激活精子使其与卵子受精，轻轻搅拌后，倒掉上方的污水，将卵移入孵化器中孵化。待受精卵发育至胚孔期1820水温环境条件下约需32H，统计受精率，发育这一时期的受精卵用肉眼容易辨认，结果显示，受精率达45新鲜采集精子受精率为6070。0081实施例110082利用实例24，实例68所述配方制备的达氏鲟精子冷冻保存液，按照实施例10所述方法进行精液的保存与解冻和受精，其结果如下0083实例2实例3实例4实例6实例7实例8受精率172032292110说明书CN104054697A10。