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1、(10)申请公布号 CN 103983764 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103983764 A (21)申请号 201410154914.3 (22)申请日 2014.04.17 G01N 33/52(2006.01) (71)申请人 深圳先进技术研究院 地址 518055 广东省深圳市南山区西丽大学 城学苑大道 1068 号 (72)发明人 蔡林涛 刘宏 潘正银 张鹏飞 李文军 潘宏 马轶凡 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 熊永强 (54) 发明名称 对细胞进行原位标记的方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种对细胞进。
2、行原位标记的方 法， 包括如下步骤 ：（1） 制备含有胆碱类似物的细 胞培养液 ；（2） 对细胞进行原位标记。本发明提供 的对细胞进行原位标记的方法先采用含有胆碱类 似物的细胞培养液培养细胞， 然后用报告分子追 踪标记在细胞上的胆碱类似物。本发明利用胆碱 类似物上标记的叠氮与报告分子上标记的二苯并 环丁烯之间的特异性反应对细胞进行原位标记， 该方法简单易行， 不仅能够快速、 高灵敏高分辨率 地对细胞膜、 细胞器膜上的胆碱类似物进行定位 和示踪， 而且对细胞毒性低， 且对细胞形态、 细胞 活性以及存活率影响小。此外， 本发明提供了一 种胆碱类似物在制备细胞原位检测试剂盒中的应 用。 (51)In。
3、t.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103983764 A CN 103983764 A 1/1 页 2 1. 一种对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （1） 制备含有胆碱类似物的细胞培养液 提供不含血清的细胞培养液， 加入胆碱类似物至所述胆碱类似物的终浓度为 100M 1000M， 其中， 所述胆碱类似物的结构式如 P1 所示 ： 式中， k 为 2 5 的自然数。 （2） 对细胞进行原位标记 取待标记细胞， 加入步骤 。
4、（1） 处理过的细胞培养液后， 置于细胞培养箱中培养 12 36 小时 ； 收获所述培养后的细胞， 并用 PBS 缓冲液洗涤后， 加入不含血清的细胞培养液重悬细 胞， 然后加入报告分子与细胞进行孵育， 得到经报告分子原位标记的细胞， 其中， 所述报告 分子为染料分子修饰的二苯并环丁烯分子。 2. 如权利要求 1 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述待标记细胞为 人类胚肾细胞、 人乳腺癌细胞、 人肺腺癌细胞或人卵巢癌细胞。 3. 如权利要求 1 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述采用不含血清 的细胞培养液重悬细胞至细胞终浓度为 1105 1107/ul。 4. 。
5、如权利要求 1 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述报告分子与细 胞进行孵育的条件为 ： 加入报告分子至所述报告分子的终浓度为 100M 1000M， 孵育 的时间为 10 40 分钟。 5. 如权利要求 1 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述报告分子与细 胞进行孵育后， 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 4 次。 6. 如权利要求 1 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中， 对 所述染料分子为荧光素、 罗丹明、 菁染料分子、 二苯乙烯、 萘酰亚胺、 香豆素类、 吖啶类或芘 类。 7. 如权利要求 6 所述的对细胞进行原位标记的。
6、方法， 其特征在于， 所述荧光素为异硫 氰酸荧光素、 羟基荧光素或四氯荧光素。 8. 如权利要求 6 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述罗丹明为罗丹 明 101、 四乙基罗丹明或羧基四甲基罗丹明。 9. 如权利要求 6 所述的对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 所述菁染料分子为 噻唑橙、 噁唑橙、 或多甲川系列菁染料。 10. 如权利要求 1 所述的胆碱类似物在制备细胞原位检测试剂盒中的应用， 其中， 所述 细胞为人类胚肾细胞、 人乳腺癌细胞、 人肺腺癌细胞或人卵巢癌细胞， 所述胆碱类似的结构 式如 P1 所示 ： 式中， k 为 2 5 的自然数。 权 利 要 求 书。
7、 CN 103983764 A 2 1/9 页 3 对细胞进行原位标记的方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及对细胞进行原位标记的方法和应用。 背景技术 0002 胆碱 (Cho) 是细胞膜结构和脂蛋白构成上的重要组成部分。在真核生物中， 磷脂 头端最普遍的基团是胆碱， 含磷脂胆碱是细胞膜中最丰富的磷脂， 也是细胞膜的主要结构 成分， 在细胞代谢和信号传导中起着至关重要的作用 ； Adrian Salic 课题组利用胆碱在细 胞中的代谢途径， 通过对胆碱的末端修饰炔基， 并用带叠氮的染料通过 click 铜催化对细 胞内胆碱的代谢行为进行示踪分析。然而， 在该方法采。
8、用的叠氮 - 炔基 Husigen3+3 环加 成反应需要铜作为催化剂， 催化剂铜的存在会引起细胞的毒性， 因而在活细胞乃至活体的 应用中受到很大的限制。 0003 因此， 有必要提供一种对细胞毒性低、 影响小的细胞原位示踪方法。 发明内容 0004 为解决上述问题， 本发明提供了一种对细胞进行原位标记的方法和应用。 0005 本发明提供的对细胞进行原位标记的方法采用叠氮修饰的胆碱与报告分子之间 反应对细胞进行原位标记， 该方法对细胞毒性低， 且对细胞形态、 细胞活性以及存活率影响 小， 能够快速、 高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪。 0006 第一方面， 本发明提供了一种。
9、对细胞进行原位标记的方法， 其特征在于， 包括如下 步骤 ： 0007 (1) 制备含有胆碱类似物的细胞培养液 0008 提供不含血清的细胞培养液， 加入胆碱类似物至所述胆碱类似物的终浓度为 100M 1000M， 其中， 所述胆碱类似物的结构式如 P1 所示 ： 0009 0010 式中， k 为 2 5 的自然数。 0011 (2) 对细胞进行原位标记 0012 取待标记细胞， 加入步骤 (1) 处理过的细胞培养液后， 置于细胞培养箱中培养 12 36 小时 ； 收获所述培养后的细胞， 并用 PBS 缓冲液洗涤后， 加入不含血清的细胞培养 液重悬细胞， 然后加入报告分子与细胞进行孵育， 得。
10、到经报告分子原位标记的细胞， 其中， 所述报告分子为染料分子修饰的二苯并环丁烯分子。 0013 若无特别说明， 本发明所述的胆碱类似物为叠氮修饰的胆碱， 结构式如所述 P1 所 示。 0014 本发明采用不含血清的培养液培养细胞， 不含血清的培养基能够让实验组的标记 说 明 书 CN 103983764 A 3 2/9 页 4 效果更加的清晰， 而且不含有血清的培养基培养细胞 10 40 分钟对细胞的生长没有很大 影响。因为在细胞与 DBCO-FLlour 488 荧光染料共孵育的阶段， 若采用含动物血清的细胞 培养基培养细胞， 由于动物血清中含有丰富的营养成分， 如蛋白质、 生长因子、 激素。
11、、 脂类 及矿物质等， 这些营养成分可能使荧光染料发生团聚的效果， 特别是血清里的蛋白质带有 一定量的电荷对于 DBCO-FLlour 488 荧光染料有较强的吸附性， 从而降低了 DBCO-FLlour 488 荧光染料与叠氮修饰胆碱的接触效率， 使细胞原位标记的效果有所下降。 0015 本发明提供的对细胞进行原位标记的方法先采用含有胆碱类似物的细胞培养液 培养细胞， 然后用报告分子追踪标记在细胞上的胆碱类似物。该方法利用胆碱类似物上标 记的叠氮与报告分子上标记的二苯并环丁烯之间的特异性反应对细胞进行原位标记。 0016 本发明提供的对细胞进行原位标记的方法对细胞毒性低， 且对细胞形态、 细。
12、胞活 性以及存活率影响小， 能够快速、 高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类 似物进行定位和 示踪。 0017 需要说明的是， 本发明涉及的结构式中的为正电荷的符号。 0018 优选地， 所述待标记细胞为人类胚肾细胞、 人乳腺癌细胞、 人肺腺癌细胞或人卵巢 癌细胞。 0019 优选地， 加入不含血清的细胞培养液重悬细胞的步骤之前， 采用 PBS 缓冲液洗涤 收获的细胞的具体操作为 ： 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 4 次。 0020 在此优选条件下， 本发明所述的采用 PBS 缓冲液洗涤的步骤目的在于去除未与细 胞结合的胆碱类似物， 使得后续叠氮与二苯并环丁烯之间反应只在含有胆碱类似物的细胞。
13、 上进行。 0021 优选地， 所述采用不含血清的细胞培养液重悬细胞至细胞终浓度为 1105 1107/ul。 0022 优选地， 所述报告分子与细胞进行孵育的条件为 ： 加入报告分子至所述报告分子 的终浓度为 100M 1000M， 孵育的时间为 10 40 分钟。 0023 优选地， 所述报告分子与细胞进行孵育后， 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 4 次。 0024 本发明所述的采用 PBS 缓冲液洗涤的步骤目的在于去除未与细胞结合的报告分 子， 便于后续进行荧光显微镜或激光共聚焦显微镜进行观察。 0025 在本发明采用的报告分子为染料分子对二苯并环丁烯分子 (DBCO) 进行荧光标记 。
14、后所得的分子活性染料 ； 所述报告分子的结构式如 A 所示 ： 0026 0027 其中， R 为标记在 DBCO 上的染料分子， 所述染料分子的活性基团与 DBCO 的 N 原子 形成共价键， 从而得到所述报告分子 ； 采用染料分子对 DBCO 进行标记的方法可采用普通实 验室标记方法进行。 0028 优选地， 所述步骤 (2) 中， 对所述染料分子为荧光素、 罗丹明、 菁染料分子、 二苯乙 说 明 书 CN 103983764 A 4 3/9 页 5 烯、 萘酰亚胺、 香豆素类、 吖啶类或芘类。 0029 需要指出的是， 本发明采用的染料分子优选为但不限于所述荧光素、 罗丹明、 菁染 料分。
15、子、 二苯乙烯、 萘酰亚胺、 香豆素类、 吖啶类或芘类。 0030 本发明所得的报告分子可根据不同细胞的代谢特点以及嗜好选择不同的染料分 子进行标记。 0031 优选地， 所述荧光素为 Flour488、 异硫氰酸荧光素 (FITC)、 羟基荧光素或四氯荧 光素。 0032 具体的， 所述Flour488购自sigma公司， 货号为761621-1MG， 经验分子式(希尔表 示法 ) 为 C32H33N3O8， 分子量为 587.62， 结构式如 B 所示 ： 0033 0034 具体地， 所述 FITC 的结构式如 C 所示 ： 0035 0036 优选地， 所述罗丹明为罗丹明 101、 四。
16、乙基罗丹明或羧基四甲基罗丹明。 0037 具体地， 所述罗丹明 101 的结构式如 D 所示 ： 0038 0039 优选地， 所述菁染料分子为噻唑橙、 噁唑橙、 或多甲川系列菁染料。 0040 进一步优选地， 所述吲哚菁染料分子为 Cy3 或 Cy5.5。 0041 具体地， 所述 Cy3 和 Cy5.5 的结构式如下所示 ： 0042 说 明 书 CN 103983764 A 5 4/9 页 6 0043 本发明提供的胆碱类似物在细胞内能通过胆碱激酶的磷酸化作用形成含有胆碱 类似物的磷脂， 该磷脂通过一系列细胞内的代谢作用整合到细胞膜、 细胞器膜上， 从而对细 胞进行原位标记。然后采用本发。
17、明提供的由染料分子标记的 DBCO 与所述结合在细胞膜、 细 胞器膜上的胆碱类似物发生点击化学反应， 再通过检测所述 DBCO 上的染料分子， 即可对细 胞膜、 细胞器膜上的胆碱类似物进行示踪。 0044 本发明提供的胆碱类似物与报告之间的偶联反应在常温、 生理环境中就能快速发 生， 通过检测所述标记的染料分子可快速、 高灵敏高分辨率地对细胞膜、 细胞器膜上的胆碱 类似物进行定位和示踪， 是一种非常方便的细胞活体标记方法。 0045 第二方面， 本发明提供了一种如第一方面所述的胆碱类似物在制备细胞原位检测 试剂盒中的应用， 其中， 所述细胞为人类胚肾细胞、 人乳腺癌细胞、 人肺腺癌细胞或人卵巢。
18、 癌细胞， 所述胆碱类似物的结构式如 P1 所示 ： 0046 0047 式中， k 为 2 5 的自然数。 0048 优选地， 所述细胞原位检测试剂盒用于观察动物体内可移动细胞在正常或疾病条 件下的分布情况。 0049 进一步优选地， 所述可移动细胞为淋巴细胞或 DC 细胞。 0050 优选地， 所述细胞原位检测试剂盒用于恶性肿瘤细胞的后期迁移的动态分布情 况。 0051 本发明通过的试剂盒通过对细胞膜、 细胞器膜的原位标记， 从而能有效地在细胞 说 明 书 CN 103983764 A 6 5/9 页 7 水平以及分子水分上探究疾病的发病机理。 0052 本发明提供的对细胞进行原位标记的方。
19、法和应用具有如下有益效果 ： 0053 1) 本发明提供的细胞原位标记方法对细胞毒性低， 且对细胞形态、 细胞活性以及 存活率影响小， 能够快速、 高灵敏高分辨率地对细胞膜上的胆碱类似物进行定位和示踪 ； 0054 2) 本发明提供的胆碱类似物与报告分子之间的偶联反应在常温、 生理环境中就能 快速发生， 使用方便 ； 0055 3) 本发明提供的胆碱类似物可用于制备人类胚肾细胞、 人乳腺癌细胞、 人肺腺癌 细胞或人卵巢癌细胞的原位检测试剂盒。 附图说明 0056 图 1、 以及图 3 6 为本发明实施例提供的共聚焦显微镜荧光拍摄图 ； 0057 图 2 为本发明实施例提供的流式细胞仪检测细胞的。
20、荧光强度的结果。 具体实施方式 0058 以下所述是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。 0059 实施例 1 0060 一种胆碱类似物 (AE-Cho) 的合成， 包括如下步骤 ： 0061 1) 取 1,2- 二溴乙烷 8.5mL(98.52mmol) 和叠氮钠 3.2g(49.22mmol) 加入到 25mL 二甲基甲酰胺 (DMF) 有机溶剂中， 在 80条件下搅拌 20h， 然后冷却到室温 ； 随后用氯化钠 和冰戊烷萃取三次， 取有机层用氯化钠水溶液。
21、洗三次， 通过硫酸钠干燥并进行减压浓缩， 获 得纯化的 1- 叠氮 -2- 溴乙烷 ( 得率 81.21 ) ； 0062 2) 取二甲基乙醇胺 49.22mmol 加入 15mL 四氢呋喃 (THF) 中， 然后加入步骤 (1) 纯化的 1- 叠氮 -2- 溴乙烷， 氩气条件下， 在 0搅拌反应 6h ； 反应结束后获得白色的沉淀 产物， 用乙醚清洗三次， 真空干燥， 得到纯净的叠氮乙基修饰的胆碱 (AE-Cho) 固体 ( 得率 70.5 )， 所述 AE-Cho 的结构如 P2 所示 ： 0063 0064 该 AECho 的合成流程如下 ： 0065 0066 对AE-Cho进行核磁共。
22、振检测， 所得分析数据为 ： 1H NMR(600MHz,CD3OD)(Varian V NMR):H4.81(H2O),4.01(4H,m),3.68(2H,t),3.58(2H,m),3.25(6H,s).13C NMR(600MHz, CD3OD):C66.33,63.40,55.51,51.65,47.53,44.80。 0067 实施例 2 说 明 书 CN 103983764 A 7 6/9 页 8 0068 一种胆碱类似物 (AP-Cho) 的合成， 包括如下步骤 ： 0069 1) 取 1,2- 二溴丙烷 98.52mmol 和叠氮钠 49.22mmol 加入到 25mL 二甲。
23、基甲酰 胺 (DMF) 有机溶剂中， 在 80条件下搅拌 20h， 然后冷却到室温 ； 随后用氯化钠和冰戊烷 萃取三次， 取有机层用氯化钠水溶液洗三次， 通过硫酸钠干燥并进行减压浓缩， 获得纯化的 1- 叠氮 -2- 溴乙烷 ( 得率 75.59 ) ； 0070 2) 取二甲基乙醇胺 49.22mmol 加入 15mL 四氢呋喃 (THF) 中， 然后加入步骤 (1) 纯化的 1- 叠氮 -2- 溴丙烷， 氩气条件下， 在 0搅拌反应 6h ； 反应结束 后获得白色的沉淀 产物， 用乙醚清洗三次， 真空干燥， 得到纯净的叠氮丙基修饰的胆碱 (AP-Cho) 固体 ( 得率 69.32 )， 。
24、所述 AP-Cho 的结构如 P3 所示 ： 0071 0072 该 APCho 的合成流程如下 ： 0073 0074 对 AP-Cho 进行核磁共振检测， 所得分析数据为 ： 1H NMR(600MHz,CD3OD):H4.82 (H2O),3.98(2H,m),3.50(6H,m),3.18(6H,s),2.37(2H,m).13C NMR(600MHz,CD3OD):C65 .37,63.93,55.30,51.09,44.78,28.03,22.17.ESI-LC/MS:M+ 173.1。 0075 实施例 3 0076 一种对人类乳腺癌细胞 (MCF-7) 进行原位标记的方法， 包。
25、括如下步骤 ： 0077 1)MCF-7 ： 培养液为含10小牛血清的DMEM培养基， 培养条件 ： 37， 5CO2/95 空气， 饱和湿度， 隔天更换培养液， 每 3 4 天传代一次 ； 0078 2) 胆碱类似物在 MCF-7 细胞内代谢结合 ： 首先用 PBS 缓冲液将细胞洗 3 次， 换新 鲜的不含小牛血清的 DMEM 培养基 ； 0079 设置实验组与对照组， 其中， 实验组将实施例1制备的AE-Cho加入细胞培养液， 对 照组采用不含小牛血清的 DMEM 培养基代替实施例 1 制备的 AE-Cho 加入细胞培养液 ； 0080 共培养24h， 然后用PBS缓冲液洗去多余的AE-C。
26、ho(采用PBS缓冲液洗涤细胞2 4 次 )， 加入新鲜的培养基， 至细胞终浓度为 1106， 备用 ； 0081 3) 报告分子 ( 该实施例采用 Flour-488 标记的 DBCO， 购自 sigma 公司， 货号 761621) 对 MCF-7 人类乳腺癌细胞进行荧光标记 ： 将报告分子 DBCO-Flour-488 加入第二步 得到的细胞培养液中， 所述报告分子的终浓度为 500M， 孵育 30 分钟， 用 PBS 洗去多余的 报告分子 ( 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 4 次 )， 得到荧光染料原位标记的细胞溶液 ； 0082 4) 采用激光共聚焦显微镜 (LEICA， 购自香。
27、港金溢电子公司， 品牌 / 型号为德 国徕卡 LEICA/LEICA 激光共聚焦显微镜 ) 进行观察， 观察前还采用细胞核染料 Hoechst 33258( 购自 sigma 公司， 货号为 861405) 对实验组与对照组的细胞核均进行染色。 0083 所得激光共聚焦显微镜的结果如图 1 所示， 图 1 包括 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 以及 说 明 书 CN 103983764 A 8 7/9 页 9 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)， 其中， 图 1 中的 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 为实验组的结果， 图 1 中的 (A)、 (B)、。
28、 (C)、 (D)、 (E) 为对照组的结果， 图 1 中的 (a) 和 (A) 为 DBCO-Flour-488 通道激 发波长为 488nm 的荧光观察结果， 图 1 中的 (b) 和 (B) 为细胞核染料 Hoechst 33258 通道 激发波长为 415 nm 的荧光观察结果， 图 1 中的 (c) 和 (C) 为 Flour-488 通道与细胞核染料 Hoechst 33258通道观察结果的叠加效果图， 图1中的(d)和(D)为细胞在明场下的观察结 果， 图 1 中的 (e) 为 (a)、 (b)、 (c)、 (d) 的观察结果最终叠加效果图， (E) 为 (A)、 (B)、 (C。
29、)、 (D) 的观察结果最终叠加效果图。 0084 由图 1 可知 ： 实验组的细胞膜呈绿色 ( 图 1-a， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态 可以判断细胞膜有荧光 )， 并且细胞核呈紫色 ( 图 1-b， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态 可知细胞核有荧光 )， 图 1-c 为图 1-a 和图 1-b 两种荧光共激发的效果， 进一步说明本发明 提供的对 MCF-7 细胞膜进行原位标记的方法可以对细胞膜进行原位标记 ； 而对照组只有细 胞核呈紫色 ( 图 1-B， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态可以判断细胞核有荧光 )， 细胞膜 没有荧光 ( 图 1-A， 通过观察细胞形态可知细胞膜无荧光。
30、 ) ； 这从反面说明本发明提供的对 MCF-7 细胞膜进行原位标记的方法可以对细胞膜进行原位标记 ； 此外， 从图 1-d 明场下观察 细胞形态、 细胞数目可以看出， 相对于对照组， 本发明提供的方法不会影响 MCF-7 细胞的形 态结构， 也不会降低 MCF-7 细胞活性或细胞存活率。 0085 为充分说明本发明的有益效果， 本实施例还采用流式细胞仪对本发明步骤 (3) 所 得的到荧光染料原位标记的细胞的荧光强度进行检测 ( 即实验组 )， 同 时设置阳性对照组 与阴性对照组， 其中， 所述阳性对照组即为实施例 3 步骤 (2) 所述对照组， 所述阴性对照组 的细胞不做任何处理 ( 不用含。
31、胆碱类似物的培养基进行培养， 也不与报告分子共孵育 )， 即 普通培养的 MCF-7 细胞。结果如图 2 所示， 在图 2 中， 阴性对照组、 阳性对照组与实验组的 结果分别如曲线 1、 曲线 2 和曲线 3 所示， 由图 2 可知， 三条曲线的波峰均处于不同位置， 实 验步骤可信 ； 可以明显看到， 相对于阴性对照组和阳性对照组， 实验组的荧光强度更强， 说 明实验组由于DBCO-Flour-488与标记在细胞膜以及细胞器膜上的AE-Cho进行特异性点击 化学反应， 从而使得 Flour-488 可以进行原位标记在细胞膜以及细胞器膜上 ； 此外， 阴性对 照组对细胞未做任何处理， 是细胞本身。
32、自发的荧光， 阳性对照是细胞经过添加荧光染料后 洗涤依旧可以被细胞吸附的 Flour 488 荧光染料。 0086 实施例 4 0087 一种对人类胚肾细胞 (293T) 进行原位标记的方法， 包括如下步骤 ： 0088 1)293T 培养 ： 培养液为含 12胎牛血清的 1640 培养基， 培养条件 ： 37， 5 CO2/95空气， 饱和湿度， 隔天更换培养液， 每 3 4 天传代一次 ； 0089 2) 胆碱类似物在 293T 细胞内代谢结合 ： 首先用 PBS 缓冲液将细胞洗 3 次， 换新鲜 的不含小牛血清的 1640 培养基 ； 0090 设置实验组与对照组， 其中， 实验组将实施。
33、例1制备的AE-Cho加入细胞培养液， 对 照组采用不含小牛血清的 1640 培养基代替实施例 1 制备的 AE-Cho 加入细胞培养液 ； 0091 共培养12h， 然后用PBS缓冲液洗去多余的AE-Cho(采用PBS缓冲液洗涤细胞2 4 次 )， 加入新鲜的培养基， 至细胞终浓度为 1105， 备用 ； 0092 3) 报告分子 ( 该实施例采用 Flour-488 标记的 DBCO， 购自 sigma 公司， 货号 761621) 对 293T 人类胚肾细胞进行荧光标记 ： 将报告分子 DBCO-Flour-488 加入第二步得 说 明 书 CN 103983764 A 9 8/9 页 。
34、10 到的细胞培养液中， 所述报告分子的终浓度为100M， 孵育10分钟， 用PBS洗去多余的报告 分子 ( 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 4 次 )， 得到荧 光染料原位标记的细胞溶液 ； 0093 4) 采用激光共聚焦显微镜 (LEICA， 购自香港金溢电子公司， 品牌 / 型号为德 国徕卡 LEICA/LEICA 激光共聚焦显微镜 ) 进行观察， 观察前还采用细胞核染料 Hoechst 33258( 购自 sigma 公司， 货号为 861405) 对实验组与对照组的细胞核均进行染色。所得激 光共聚焦显微镜拍摄细胞荧光信号的结果如图 3 所示， 图 3 包括 (a)、 (b)、 (c。
35、)、 (d)、 (e) 以 及 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)， 其中， 图 3 中的 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 为实验组的结果， 图 3 中 的 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E) 为对照组的结果， (a) (e) 以及 (A) (E) 的设置均如实施例 3 中图 1 中 (a) (e) 以及 (A) (E) 的设置所述。 0094 结果显示 ： 实验组的细胞膜呈绿色 ( 图 3-a， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态可 以判断细胞膜有荧光)， 并且细胞核呈紫色(图3-b， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态可知 细胞核有荧光 )， 图 3-c。
36、 为图 3-a 和图 3-b 两种荧光共激发的效果， 进一步说明本发明提供 的对 293T 细胞膜进行原位标记的方法可以对细胞膜进行原位标记 ； 而对照组只有细胞核 呈紫色(图3-B， 颜色不显示， 但通过观察细胞形态可以判断细胞核有荧光)， 细胞膜没有荧 光(图3-A， 通过观察细胞形态可知细胞膜无荧光) ； 这从反面说明本发明提供的对293T细 胞膜进行原位标记的方法可以对细胞膜进行原位标记 ； 此外， 从图 3-d 明场下观察细胞形 态、 细胞数目可以看出， 相对于对照组， 本发明提供的方法不会影响 293T 细胞的形态结构， 也不会降低 293T 细胞活性或细胞存活率。 0095 实施。
37、例 5 0096 一种对人乳腺癌细胞株 (MDA-MB-231) 进行原位标记的方法， 包括如下步骤 ： 0097 1)MDA-MB-231 培养 ： 培养液为含 12胎牛血清的 DMEM 培养基， 培养条件 ： 37， 5 CO2/95空气， 饱和湿度， 隔天更换培养液， 每 3 4 天传代一次 ； 0098 2)胆碱类似物在MDA-MB-231细胞内代谢结合 ： 首先用PBS缓冲液将细 胞洗3次， 换新鲜的不含小牛血清的 DMEM 培养基 ； 0099 设置实验组与对照组， 其中， 实验组将实施例1制备的AE-Cho加入细胞培养液， 对 照组采用不含小牛血清的 DMEM 培养基代替实施例 。
38、1 制备的 AE-Cho 加入细胞培养液 ； 0100 共培养36h， 然后用PBS缓冲液洗去多余的AE-Cho(采用PBS缓冲液洗涤细胞2 4 次 )， 加入新鲜的培养基， 至细胞终浓度为 1107， 备用 ； 0101 3) 报告分子 ( 该实施例采用 Flour-488 标记的 DBCO， 购自 sigma 公司， 货号 761621) 对 MDA-MB-231 细胞进行荧光标记 ： 将报告分子 DBCO-Flour-488 加入第二步得到 的细胞培养液中， 所述报告分子的终浓度为 1000M， 孵育 40 分钟， 用 PBS 洗去多余的报告 分子 ( 采用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2 。
39、4 次 )， 得到荧光染料原位标记的细胞溶液 ； 0102 4) 采用激光共聚焦显微镜 (LEICA， 购自香港金溢电子公司， 品牌 / 型号为德 国徕卡 LEICA/LEICA 激光共聚焦显微镜 ) 进行观察， 观察前还采用细胞核染料 Hoechst 33258( 购自 sigma 公司， 货号为 861405) 对实验组与对照组的细胞核均进行染色。所得激 光共聚焦显微镜拍摄细胞荧光信号的结果分别如图 4。 0103 图 4 为 MDA-MB-231 细胞的激光共聚焦显微镜拍摄结果， 图 4 包括 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 以及 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 。
40、(E)， 其中， 图 4 中的 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 为实验组的 结果， 图 4 中的 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E) 为对照组的结果， (a) (e) 以及 (A) (E) 的设 说 明 书 CN 103983764 A 10 9/9 页 11 置均如实施例 3 中图 1 中 (a) (e) 以及 (A) (E) 的设置所述。 0104 图 4 的结果显示 ： 本发明提供的对细胞膜进行原位标记的方法可以对 MDA-MB-231 细胞膜进行原位标记 ； 此外， 从细胞形态、 细胞数目可以看出， 相对于对照组， 本发明提供的 方法不会影响 MDA-MB-。
41、231 细胞的形态结构， 也不会降低 MDA-MB-231 细胞的细胞活性或细 胞存活率。 0105 此外， 本发明还提供了人肺腺癌细胞 (A549)、 人卵巢癌细胞 (SKOV-3) 的细胞原位 标记的方法， 步骤与实施例 3 一样， 除了细胞培养基的区别 ( 其中， A549 和 SKOV-3 采用的 培养基分别为 DMEM 和 1640)， 其它步骤一样。 0106 得到各种细胞的荧光染料原位标记的细胞后， 采用激光共聚焦显微镜进行观察， 所得激光共聚焦显微镜拍摄细胞荧光信号的结果分别如图 5 6 所示， 其中， 图 5 为 A549 细胞的激光共聚焦显微镜拍摄结果， 图 6 为 SKO。
42、V-3 细胞的激光共聚焦显微镜拍摄结果。 0107 图 5 包括 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 以及 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)， 其中， 图 5 中的 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 为实验组的结果， 图 5 中的 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E) 为对照组的结 果， (a) (e) 以及 (A) (E) 的设置均如实施例 3 中图 1 中 (a) (e) 以及 (A) (E) 的 设置所述。 0108 图 6 包括 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 以及 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E)， 其中。
43、， 图 6 中的 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) 为实验组的结果， 图 6 中的 (A)、 (B)、 (C)、 (D)、 (E) 为对照组的结 果， (a) (e) 以及 (A) (E) 的设置均如实施例 3 中图 1 中 (a) (e) 以及 (A) (E) 的 设置所述。 0109 图 5 图 6 的结果显示 ： 本发明提供的对细胞膜进行原位标记的方法可以对 A549 以及 SKOV-3 细胞膜进行原位标记 ； 此外， 从细胞形态、 细胞数目可以看出， 相对于对照组， 本发明提供的方法不会影响 A549 以及 SKOV-3 细胞的形态结构， 也不会降低三种细胞的细 胞活性或细胞存活率。 0110 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103983764 A 11 1/3 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103983764 A 12 2/3 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103983764 A 13 3/3 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103983764 A 14 。