抗大肠杆菌O157H7单克隆抗体及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103898065 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898065 A (21)申请号 201310555729.0 (22)申请日 2013.11.09 CGMCC No.6251 2012.06.20 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/12(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (71)申请人 中华人民共和国吉林出入境检验检 疫局 地址 130062 吉林省长春市普阳街 1301 号 (72)发明人 孟日增 宋战昀 芦春梅 刘韬 赵庆松 王玮 (74)专利代。

2、理机构 长春市东师专利事务所 22202 代理人 张铁生 (54) 发明名称 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体及应用 (57) 摘要 本发明公开了抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗 体杂交瘤细胞株， 解决了可靠的该菌单克隆抗体 不易获得的问题， 经多年多次传代， 能稳定分泌单 克隆抗体， 它分泌的单克隆抗体， 应用于液相芯片 和胶体金法检测食品中大肠杆菌 O157:H7， 具有 良好的灵敏性、 特异性、 稳定性和可重复性等优 点。 病原在浓度很低的情况下也能被检出， 进一步 提高检测灵敏度和检出率， 严防漏检和误检。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说。

3、明书 8 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103898065 A CN 103898065 A 1/1 页 2 1. 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体杂交瘤细胞株， 它的保藏编号为 ： CGMCC No.6251。 2. 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体， 它是由权利要求 1 所述的抗大肠杆菌 O157:H7 单 克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的。 3. 一种液相芯片检测株大肠杆菌 O157:H7 的试剂盒， 它的检测抗体为权利要求 2 所述 的抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆。

4、抗体。 4. 一种胶体金检测大肠杆菌 O157:H7 的试纸条， 它的检测抗体为权利要求 2 所述的抗 大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 103898065 A 2 1/8 页 3 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体及应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 确切地说是抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体及应用。 背景技术 0002 肠出血性大肠杆菌 (Enterohaemorrhagic Escherichia coli， EHEC) 主要包括 O157:H7， O26:H11 和 O111 等几种血清型， 其中 O157:H7 是典型菌株。O。

5、157:H7 感染能引起 出血性结肠炎 (Hemorrhagic colitis， HC)、 阑尾炎、 食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并 发症， 在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癫等严重并 发症， 重者可引起死亡。 O157: H7 引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫 生问题， 在许多国家导致多起爆发流行。O157: H7 可引起出血性肠炎， 约有 10% 的患者发 展为溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少性紫癜, 死亡率高达30%以上。 世界卫生组织 (WHO) 已把 EHEC O157: H7 出血性肠炎列为新发传染病。EHEC 0157:H7 感。

6、染已成为全球 性的公共卫生和食品安全问题， 对其进行快速、 特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有 效控制至关重要。 0003 目前检测 EHEC O157: H7 常规采用山梨醇 - 麦康凯琼脂 ( SMAC) 培养基， 选择山 梨醇发酵阴性的大肠杆菌， 进一步用生化和血清学试验做鉴定， 需要 24 48 h。采用 PCR 方法进行检测需要较昂贵的仪器， 费用高， 不易于基层单位推广。 单克隆抗体因具有良好的 特异性、 稳定性和可重复性等优点， 但是可靠的EHEC O157: H7的单克隆抗体杂交瘤不容易 制备， 目前我国一直靠进口。 发明内容 0004 本发明的目的是一株抗大肠杆菌 O157。

7、:H7 单克隆抗体杂交瘤及其分泌的抗体和 应用。 0005 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体杂交瘤细胞株， 它的保藏编号为 ： CGMCC No.6251 ； 抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体， 它是由上述的抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体杂交 瘤细胞株分泌的 ； 一种液相芯片检测株大肠杆菌 O157:H7 的试剂盒， 它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体 ； 一种胶体金检测大肠杆菌 O157:H7 的试纸条， 它的检测抗体为上述的抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体。 0006 本发明提供了抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体杂交瘤细胞株， 解决了。

8、可靠的该菌 单克隆抗体不易获得的问题， 经多年多次传代， 能稳定分泌单克隆抗体， 它分泌的单克隆抗 体， 应用于液相芯片和胶体金法检测食品中大肠杆菌 O157:H7， 具有良好的灵敏性、 特异性、 稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出， 进一步提高检测灵敏度 和检出率， 严防漏检和误检。 说 明 书 CN 103898065 A 3 2/8 页 4 附图说明 0007 图 1. 融合 12 天后倒置显微镜观察结果 ； 图 2. 大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体 ProtienG 柱纯化结果 ； 图 3. 单克隆抗体亚型测定结果 ； 图 4.BCA 法测定单抗蛋白含量标准。

9、曲线 ； 图 5. 非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力 ； 图 6. 捕获抗体最佳工作浓度的确定 ； 图 7. 灵敏度检测结果 ； 图 8. 特异性检测结果 ； 图 9 特异性检测结果 ； 图 10 胶体金试纸条的组装顺序。 0008 具体实施方式 ： 实施例 1 大肠杆菌 O157:H7 抗原菌液的制备和 BALB/c 小鼠免疫 取本研究实 -80保存的标准大肠杆菌 O157:H7（ATCC11229） ， 经肉汤培养后， 划线法 于LB上培养， 常规方法增菌培养， 6000r/min离心10min， 收集菌体沉淀， 用灭菌生理盐水重 复离洗三次后进行菌落计数 （2.0108CFU/mL） ， 。

10、加入终浓度为 0.3% 的甲醛 4过夜使菌体 灭活。次日将洗脱好的菌液在 20KHz、 150W 的冰浴条件下进行超声波使菌体细胞破碎， 每 次破碎 10s， 间隔 10s， 总用时 20min。采用 BCA 蛋白测定试剂盒测定菌体蛋白含量， 结果为 2.636 mg/mL。 0009 取 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠进行免疫。首免采用上述灭活菌液 （2108CFU/mL） 与 等量弗氏完全佐剂混合后腹腔注射 50L， 皮下注射 50L， 以后每隔 2 周免疫 1 次， 换用弗 氏不完全佐剂， 剂量同前， 共免 3 次。 0010 实施例 2 免疫小鼠血清抗体效价的测定 3免后， 小鼠断尾。

11、采血， 用常规间接ELISA方法检测血清效价。 其中， 包被抗原是实施例 1 所制备的大肠杆菌 O157:H7 菌液， 稀释度为 1:50， 小鼠血清浓度为 200 稀释度开始的梯 度浓度， 酶标二抗为 HRP( 辣根过氧化物酶 ) 标记的兔抗小鼠 IgG（稀释度为 1:15000） 。测 定结果表明， 抗体效价为 1:25600。 0011 实施例 3 大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体的制备 （1） 杂交瘤细胞株的建立 饲养细胞的制备 ： 正常 BABL/C 小鼠断颈处死， 将 8mL HAT 培养液注入腹腔， 轻轻摇 动小鼠身体数下后抽出培养液， 调整细胞浓度至 105个 /mL， 加。

12、入 96 孔细胞培养板， 每孔 100L， 置细胞培养箱中培养过夜备用， 此即为饲养细胞。 0012 骨髓瘤细胞的培养与细胞悬液的制备 ： 融合前一周复苏骨髓瘤细胞 （SP2/0） ， 隔 1 天传代 1 次， 融合选在传代后 1 天进行。融合前取约 4 瓶 （25cm2） SP2/0 细胞， 用 RPMI-1640培养液吹下各瓶细胞， 1200r/min离心10min， 重复2-3次， 使用细胞计数板计数。 0013 脾细胞悬液的制备 ： 免疫小鼠摘眼球采血， 4过夜后 2500r/min 离心 10min， 取 血清于 -20保存备用。小鼠处死后， 常规方法取脾并用 RPMI-1640 培。

13、养液制备脾细胞悬 液， 计数。 说 明 书 CN 103898065 A 4 3/8 页 5 0014 细胞融合 ： 调整上述制备 SP2/0 细胞与脾细胞数量比为 1:5。1200r/min 离心 10min， 弃上清液。轻弹离心瓶底， 使细胞松散。在 30s 内逐滴缓慢加入 37预热的 PEG 0.8mL， 静置 60s。逐滴加入 R/MINI1640 培养液， 稀释离心瓶内 PEG 浓度， 逐渐加快滴加速 度， 共加入 R/MINI1640 培养液 30mL。融合过程在 8min 内完成。1200r/min 离心 10min， 弃 上清液， 加入 40mL 预热的 HAT 培养液， 静置。

14、 15min， 滴到前一天制备的饲养细胞板中， 每孔 100L。置于 37， 5% 的 CO2培养箱中培养。融合后 3-4 天， 在倒置显微镜下观察融合成 功的细胞团出现， 计算克隆数。第 3-4 天， 6-7 天用 HAT 培养液进行半量换液， 第 9-10 天起 用 HT 培养液进行半量换液。 0015 阳性杂交瘤细胞株的筛选 ： 待融合细胞生长至 1/2 视野 （100 倍镜下） 以上时， 如图 1 所示， 可以进行上清效价检测， 方法为常规间接 ELISA 法 （阴性对照用 SP2/0 培养上 清） 。 0016 （2） 杂交瘤细胞株亚克隆及扩大培养 杂交瘤细胞的亚克隆 ： 用 HT 。

15、完全培养液将检测阳性孔中的融合细胞轻轻吹打至 1.5mL EP 管中， 计数细胞后取出 100 个细胞至 10mL HT 中。将此细胞悬液滴至前一天制备 的饲养细胞板中， 每孔 100L。放入 37， 5%CO2的培养箱中培养。第 4 天起观察细胞生长 状况及进行半量换液。第 1 次换液前纪录每孔克隆数， 待克隆细胞生长至 1/2 视野 （100 倍 镜下） 以上时， 常规间接ELISA法检测上清抗体效价， 选取单克隆阳性孔进行再次克隆， 直到 所有的克隆细胞孔都为阳性。 0017 杂交瘤细胞的扩大培养 ： 将进行 3-4 次阳性亚克隆后达到阳性率 100%， 长满视 野 80% 以上的孔中细。

16、胞吹起， 移至 24 孔板中， 进行传代和移至 6 孔板及细胞培养瓶中。 0018 在众多杂交瘤中， 意外获得的抗大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体杂交瘤细胞株 ； 5C3B12F1H5D1， 已于 2012 年 06 月 20 日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 北京市北辰西路 1 号院 3 号 ) 保藏， 保编号为 ： CGMCC No.6251。 0019 （3） 单克隆抗体的大量制备 （腹水法） 接种杂交瘤细胞前一周将降植烷打入小鼠腹腔， 每只 0.1mL。用 R/MINI-1640 培养液 将细胞吹下， 1000r/min离心10min， 重悬后计数， 调整细胞浓度。

17、为106个/mL， 每只鼠腹腔注 射 0.5mL。观察小鼠腹腔变化， 至腹部明显明显膨大， 行动不便时， 在腹部插入 5mL 注射器， 抽取淡黄色腹水。一般可抽取 2-3 次。并用 SP2/0 细胞打入另外的小鼠腹腔制备阴性对照 腹水。 0020 （4） 腹水的纯化与保存 粗提腹水IgG ： 腹水3000r/min离心20min， 吸弃表层脂肪， 上层几乎透明的液体为未 纯化腹水。腹水中加入 4 倍体积的醋酸缓冲液 （0.06mol/L， pH4.0） ， 逐滴加入辛酸 （33l/ mL 腹水）边加边搅， 加完后水浴震荡 10min， 全速漩涡震荡 30s， 重复 3 次后 4静止 2h， 6。

18、000r/min， 离心 30min， 去沉淀。取上清加入 1/10 体积的 PBS（0.1mol/L） ， 依次加入终浓 度为 33%、 50% 的饱和硫酸铵， 每次加完后 4静置 2h 或过夜， 6000r/min， 离心 15min。弃上 清， 将沉淀溶于少量 0.01mol/L PBS 中。 0021 ProtienG柱纯化腹水IgG ： 粗提后的腹水经0.22m过滤， 使用AKTA蛋白纯化 系统进行过滤。选用 IgG 纯化柱洗脱得到纯化后的小鼠腹水 IgG。用 PBS 对得到的单克隆 抗体进行超滤离心 （超滤离心管为 30KD） ， 6000r/min， 30min， 重复 4-5 。

19、次， 去除盐离子及浓 说 明 书 CN 103898065 A 5 4/8 页 6 缩， 收集第二峰流出液， 如图 2 所示。纯化后的单克隆抗体中可加入终浓度 0.03% 叠氮纳， 于 -20保存。 0022 实施例 4 单克隆抗体性质的鉴定 （1） 单克隆抗体效价的测定 纯化浓缩后的O157 ： H7单克隆抗体采用间接ELISA法测定其效价， 方法同实施例2。 测 得抗体 OD 值与阴性腹水 OD 值比较， 经 AKTA 纯化后的腹水效价为 1:512000， 如表 1 所示。 0023 表 1 大肠杆菌 O157:H7 单克隆抗体效价测定 （OD450nm） 单抗稀释倍数O157:H7 阴。

20、性腹水对照 20001.5950.117 40001.5440.117 80001.4770.117 160001.4090.117 320001.2390.117 640000.9550.117 1280000.6380.117 2560000.4010.117 5120000.2710.117 10240000.1970.117 20480000.1460.117 （3） 单克隆抗体亚型的鉴定 应用 Sigma 抗体亚型鉴定试纸条对收集的腹水和细胞上清进行单抗亚型的鉴定， 结果 表明， 单抗的亚型为 IgG1， 如图 3 所示。 0024 （4） 单克隆抗体特异性的鉴定 分别用 20 种肠。

21、道菌的灭活菌液包被 ELISA 板， 采用常规间接 ELISA 方法测定单抗腹水 与上述菌液反应的OD450值， 以大肠杆菌O157:H7液做阳性对照， 以阴性腹水做阴性对照。 结 果表明， 制备的单抗与大肠杆菌 O157:H7 具有较高的特异性， P/N 为 13.30， 如表 2 所示。 0025 表 2. 大肠杆菌 O157:H7 与 20 种肠道菌特异性测定结果 包被菌5C3B12F1H5D1阴性腹水 P/N 韦氏柠檬酸杆菌0.2200.118 志贺菌0.1690.108 单增李斯特菌0.3480.106 奇异变形杆菌0.1670.096 黏质沙雷菌0.1550.085 肺炎克雷伯菌0。

22、.1720.091 大肠杆菌0.2070.088 坂崎肠杆菌0.2050.083 邻单孢菌0.1790.089 粪肠球菌0.1840.084 大肠杆菌0.1940.083 大肠杆菌0.1680.086 克雷伯菌0.1690.078 变形杆菌0.1690.071 阴沟肠杆菌0.1940.073 蜡状芽孢杆菌0.2410.065 弗氏柠檬酸杆菌0.1900.105 金黄色葡萄球菌0.2130.084 沙门杆菌0.1860.085 说 明 书 CN 103898065 A 6 5/8 页 7 PBS0.2070.101 大肠杆菌 O157 ： H71.4100.10613.30 （5） 单克隆抗体蛋。

23、白含量测定 用 BCA 蛋白含量测定试剂盒按说明书操作， 进行单抗蛋白浓度的测定。结果表明， 蛋白 含量为 18.459mg/mL， 标准曲线如图 4 所示。 0026 （6） 单克隆抗体亲和力测定 利用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力。用包被抗原蛋白浓度为 1.25、 2.5、 5.0、 10.0g/mL进行包板， 每孔100L， 37， 2h。 封闭后将单抗从5g/mL开始进行倍比稀释， 按间接 ELISA 方法测定四种包被浓度下不同抗体浓度的 OD450值。以抗体浓度为横坐标， 以 相应的吸光度值为纵坐标， 可得到四条 S 形曲线。将 S 形的顶部设定为 ODmax， 分别找出四 条曲线中。

24、 50% ODmax 对应的抗体浓度。将 4 个浓度两两一组， 根据公式计算单抗的亲和常 数。 0027 Ka=(n-1)/2(nAbt-Abt) 注 ： n为每组中两个包被浓度的倍数， Abt和Abt分别为每组中两个50% ODmax对 应的抗体浓度 （mol/L） 。 0028 结果表明， 得到 6 个 Ka 的平均值为 1.01108M-1， 如图 5 所示。 0029 （7） 单克隆抗体分子量测定 使用 SDS-PAGE 试剂盒按说明书操作， 配制分离胶 （12%） 与浓缩胶 （5%） ， 上样电泳后， 测 定单克隆抗体蛋白的分子量约为 28Ku。 0030 实施例 5 生物素标记的大。

25、肠杆菌 O157:H7 多克隆抗体的制备 （1） 抗原的制备 抗原菌液的制备方法同实施例 1 所述。 0031 （2） 动物免疫及多抗效价测定 取体重为 2kg 的新西兰大耳兔进行首免， 免疫剂量为 1mL/ 只， 皮下多点注射。每隔 2 周进行 1 次免疫， 免疫前耳缘静脉采血， -20保存。4 次免疫后应用常规间接 ELISA 法测 定血清多抗效价。结果表明， 血清抗体效价为 1:25600。 0032 （3） 血清 IgG 的分离 兔麻醉后心脏采血， 4倾斜放置过夜后， 3000r/min 离心 30min， 收集血清， 按照辛 酸 - 饱和硫酸铵法粗提及 AKTA 蛋白纯化系统纯化多克。

26、隆抗体。应用 30KD 超滤离心管离洗 多抗， 3000r/min， 离心 30min， 重复 3-4 次。-20保存多抗。 0033 （4） 多克隆抗体性质鉴定 多抗蛋白含量测定方法同实施例 4 中 （5） 所述， 结果表明蛋白含量为 23.6mg/mL。 0034 多抗效价测定采用常规间接 ELISA 方法， 结果表明， 纯化后多抗效价为 1:25600。 0035 多抗特异性测定同实施例 4 中 （4） 所述， 结果表明， 与大肠杆菌 O157:H7 反应的 P/ N 值为 2.847。 0036 多抗分子量测定同实施例 4 中 （7） 所述。 0037 （5） 生物素用量计算及标记多抗。

27、反应 所需生物素量 （mmol） = 标记蛋白体积 标记蛋白含量 (20/ 标记蛋白分子量 ) 所需生物素溶液体积 （L） = 所需生物素量 433500/2.2 说 明 书 CN 103898065 A 7 6/8 页 8 生物素标记多抗反应采用常规方法进行。 0038 （6） 生物素标记水平的测定 试剂 ： 1.94mLPBS中加入10mg生物素 （Avidin） 和10mmol/L的4 -羟基偶氮苯-2-羧 酸 (HABA) 100L， 配制成 HABA/Avidin 溶液。 0039 微孔板模式测定标记水平 ： 每孔中加入 180L HABA/Avidin 溶液， 测 500nm 处 。

28、吸光度值， 记为 A500HABA/Avidin。再加入 20L 生物素标记蛋白， 混匀后测定 500nm 处吸光 度值， 记为 A500HABA/Avidin/Biotin-sample。 0040 计算标记水平 ： 光度变化值 （ A500） =A500HABA/Avidin-A500HABA/Avidin/Biotin-sample。 0041 反应混合物中生物素浓度 （mmol/mL） = A500/34000 实施例 6 捕获抗体与微球偶联形成偶联体的制备及工作浓度测定 取微球原液室温恢复 30min， 用超声波清洗机进行超声 3min， 漩涡震荡 30s， 使微球均 匀分布。用无菌。

29、水分别配制 50mg/mL 的 EDC 和 NHS。然后取 200L 的微球原液置于 1.5mL 的离心管中， 14000 r/min， 离心 5min。取出后弃上清， 加入 NHS 和 EDC 各 10L， 再加入 80L 的活化缓冲液。混匀后， 用铝箔纸包好， 置于 37摇床 120 r/min， 20min， 然后 14000 r/min， 离心 5min， 小心移去上清。加入 500L 稀释至 250ug/mL 的捕获抗体， 重悬混匀， 置 于 37摇床 120 r/min， 孵育 2h。取出后离心弃上清， 用 500L 的 PBS 进行洗涤， 洗涤后加 入 500L 1 BSA 的 。

30、PBS 溶液， 重悬微球， 37水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后 4保存。 0042 检测结果表明， 当单抗浓度为250ug/mL时， 其MFI值达到最大， 故单抗最佳的工作 浓度为 250ug/mL， 如图 6 所示。 0043 实施例 7 应用液相芯片检测单增生李斯特氏菌的方法 将已偶联的微球混合液室温恢复 10min， 漩涡振荡器震荡约 3min。取约 5000 个微球， 加入108 CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7 10L， 用PBS-TBN补足体积到100L。 置于37摇 床 120r/min， 1h。取出后离心弃上清， 用 200L PBS-TBN 洗两次。加入已稀释的检。

31、测抗体 10L， 用PBS-TBN补足体积到100L。 置于37摇床120r/min， 1h。 取出后离心， 弃上清， 用 PBS-TBN 洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔 IgG 10L， 用 PBS-TBN 补足 体积到 100L。 置于 37摇床反应 1h。取出后离心弃上清， 用 PBS-TBN 洗两次。再加入 SA-PE， 用 PBS-TBN 补足体积到 100L， 置于 37摇床反应， 取出后离心弃上清， 用 PBS-TBN 洗涤两次。重悬于 100L PBS-TBN 中， 上机进行检测。 0044 灵敏度检测结果表明， 所建立方法在菌液浓度达到 103CFU/mL 时仍可。

32、被检出。因 此本方法的灵敏度较高， 如图 7 所示。 0045 特异性检测结果表明， 所建立的方法分别检测单增李斯特菌 （ATCC54002） ， 空肠 弯曲杆菌 （ATCC33291） ， 霍乱弧菌 (JL080118)， 沙门氏菌 (ATCC9150)， 绿脓杆菌， 志贺氏菌 （JL08036） ， 阪崎杆菌 （JL08106） ， 粪肠球菌 （ATCC14506） ， 金葡菌， 以及大肠杆菌 O157:H7 （ATCC11229） ， 从图 8 可看出此方法特异性良好， 与其它细菌无交叉反应。 0046 重复性检测结果表明， 在 1d， 5d， 7d 用所建立的方法分别检测阳性菌和阴性菌。

33、， 如 图 9 所示可见阳性菌和阴性菌 MFI 值上下浮动都不大， 由此证明本方法重复性较好。 0047 实际样品检测结果表明， 分别在鸡肉和兔肉中添加大肠杆菌 O157:H7、 沙门氏菌， 说 明 书 CN 103898065 A 8 7/8 页 9 并做空白对照， 如表3所示在添加了实际样品后应用本方法仍可将大肠杆菌O157:H7检出。 0048 表 3. 实际样品检测结果 实施例 8 大肠杆菌 O157:H7 胶体金试纸条的制备 （1） 胶体金探针的制备 取0.01%氯金酸水溶液100ml于洁净的锥形瓶中， 加热至沸腾， 磁力搅拌器下准确加入 1.5mL新鲜配制的1%柠檬酸三钠水溶液， 。

34、煮沸2-3min， 溶液颜色由黄色变为紫红色， 继续煮 沸 15min， 冷却至室温后以蒸馏水恢复到原体积， 4避光保存。 0049 采用 0.1mol/L 的 K2CO3溶液调节上述处理胶体金溶液 pH 值为 8.0-8.5， 优选 8.3， 将纯化的大肠杆菌 O157 单克隆抗体用 5mM PB（pH8.0） 稀释至 25.5 g/mL。 0050 （2） 胶体金的抗体标记 取20mL胶体金溶液 （pH8.3） ， 在室温磁力搅拌下缓慢加入0.2mL待标记的单克隆抗体 （终浓度为 25.5g/mL） ， 搅拌 20-30min。加入一定量的 10% 的 BSA， 使之终浓度为 0.1%， 。

35、搅 拌 5min。继续加入一定量的 10% 的 PEG2000， 使之终浓度为 0.2%， 搅拌 5min。14000 r/min 离心50rnin， 小心吸除上清液， 加2ml保存液悬浮沉淀， 用0.45m滤膜过滤， 获得胶体金标 记的单克隆抗体， 4保存备用。 0051 （3） 金标垫的制备 取上述金标抗体原液 1mL， 加入工作液 2-5mL 稀释， 混匀后均匀地喷涂在玻璃纤维素膜 上， 制成金标抗体玻璃纤维素膜， 自然干燥后密封保存子 4冰箱中备用。 0052 （4） 包被抗体硝酸纤维素膜的制备 用 10mM pH7.6 的 PBS 分别稀释 O157:H7 多克隆抗体 （1.5 mg。

36、/mL） 和羊抗鼠 IgG（1.0 mg/mL） ， 采用隔流金划线机以 50mm/s 的速度喷膜包被到硝酸纤维素膜上， 分别作为检测线 和对照线， 检测线与对照线平行， 室温自然干燥。 0053 （5） 胶体金试纸条的组装 以 PVC 为基础底板， 分别将样品垫、 金标垫、 包被有多抗和羊抗鼠 IgG 硝酸纤维素膜及 吸水垫按图 10 顺序组装。 0054 实施例 9 大肠杆菌 O157:H7 胶体金试纸条的使用方法 将待检样品检测液滴在试纸条上的样品垫上或将试纸条的样品垫插入样品检测液中， 说 明 书 CN 103898065 A 9 8/8 页 10 然后平放1-5min， 判定结果。 。

37、检测线和对照线均出现红色或棕红色为阳性， 仅对照线显色为 阴性， 若二者均不显色， 表明操作有误或试纸条失效。 0055 实施例 10 大肠杆菌 O157:H7 胶体金试纸条的检验 （1） 特异性 将大肠杆菌 O157:H7 标准株、 大肠杆菌 O26:H11、 大肠杆菌 O127:H6、 大肠杆菌 K88、 大 肠杆菌 K99、 金黄色葡萄球菌、 志贺杆菌、 肺炎克雷伯菌、 铜绿假单胞菌、 副溶血弧菌、 沙门氏 菌、 腊样芽孢杆菌、 链球菌、 弗氏柠檬酸杆菌、 魏氏梭菌等 15 种细菌培养物用无菌 PBS 稀释 至 109CFU/mL， 用检测试纸条检验其特异性， 结果表明， 仅 O157:。

38、H7 为阳性， 其他均为阴性。 0056 （2） 敏感性 将大肠杆菌 O157:H7培养物用无菌PBS分别稀释至104-109CFU/mL， 用胶体金免疫层析 检测试纸条检测其敏感度， 结果表明， 敏感性为 105 CFU/mL。 0057 （3） 实用性 分别在奶粉、 面粉、 自来水、 饮料、 饼干、 蛋糕和牛肉等食品样品中加入终浓度为 104-109CFU/mL 的大肠杆菌 O157:H7， 制成模拟现场检测样品， 用检测试纸条检测其实用性， 结果表明， 大肠杆菌O157:H7的检出数为105 CFU/mL， 在1-5min内得出检测结果， 适用于现 场样品的检测。 0058 （4） 重复。

39、性 用制备的 10 个批次试纸条， 分别对 15 种各 10 份样品进行检测， 其检测结果完全一致， 即 10 份 O157:H7 样品全为阳性， 其他受试样品均为阴性。 0059 （5） 稳定性 用置于 4和 25存放不同时间的试纸条与新制备的试纸条平行检测阳性和阴性样 本， 结果表明， 4保存有效期为 18 个月， 25保存有效期为 12 个月。 说 明 书 CN 103898065 A 10 1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103898065 A 11 2/4 页 12 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103898065 A 12 3/4 页 13 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103898065 A 13 4/4 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103898065 A 14 。