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1、(10)申请公布号 CN 103898139 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898139 A (21)申请号 201410109990.2 (22)申请日 2014.03.21 C12N 15/63(2006.01) C07K 14/11(2006.01) C07K 16/10(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61P 31/16(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (71)申请人 上海思齐医疗技术有限公司 地址 201318 上海市浦。
2、东新区周浦镇康新公 路 3377 号 2 号楼 202 室 (72)发明人 李晓辉 (54) 发明名称 一种新型基因重组纯蛋白抗原的制备工艺 (57) 摘要 一种新型基因重组纯蛋白抗原的制备工艺， 它涉及血凝素病毒的防护和检测试剂的开发技术 领域。它的制备工艺为 ： 1、 血凝素 H7 抗原的基因 重组表达 ； 2、 血凝素 H7 抗原的制备 ； 3、 应用血凝 素纯蛋白抗原于动物 / 人体 ； 4、 高纯度的血凝素 H7 抗原用于检测含血凝素 H7 的病毒的检测。它 具备纯度高和抗原性好的特点， 不以颗粒状存在， 即不包含任何 RNA 等遗传物质， 也不包含其它蛋 白杂质， 可用于制备针对 。
3、H7N9 的高特异性抗体， 由于 H7 抗原的蛋白特性， 层析方法可用于该单一 抗原的纯化， 并且实现SEC-HPLC高于90%的纯度， 高纯度的 H7 抗原和高特异性的 H7N9 抗体可用于 开发诊断 H7N9 禽流感的诊断试剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 (10)申请公布号 CN 103898139 A CN 103898139 A 1/1 页 2 1. 一种新型基因重组纯蛋白抗原的制备工艺， 其特征在于它的制备工艺为 ： (1)、 血凝 素 H7 抗原的基因重组表达 。
4、： (a)、 血凝素 H7 的基因克隆到质粒 / 宿主细胞中 ； (b） 、 宿主细 胞的培养 / 质粒的复制 ； (c） 、 宿主细胞表达 H7 抗原 ； (2)、 血凝素 H7 抗原的制备 ： (d)、 宿主 细胞的培养与扩增 ； (e） 、 血凝素纯蛋白抗原的表达 ； (f） 、 血凝素纯蛋白抗原与宿主细胞 ； (g） 、 采用一步和多步层析方法纯化 ； (h） 、 加入稳定剂 / 佐剂做成制剂 ； (3)、 应用血凝素纯 蛋白抗原于动物 / 人体 : (i） 、 应用血凝素纯蛋白抗原于动物产生抗体 ； (j） 、 针对该血凝素 纯蛋白抗原的抗体对含有该血凝素的病毒的感染具有防护作用 ；。
5、 (k） 、 应用该血凝素纯蛋白 抗原预防含有该血凝素的病毒的感染 ； (l） 、 应用该血凝素纯蛋白抗原及抗体开发针对该血 凝素的检测 ； (4)、 高纯度的血凝素 H7 抗原用于检测含血凝素 H7 的病毒的检测 ； (5)、 应用 血凝素 H7 纯抗原预防含血凝素 H7 的病毒的感染， 应用针对血凝素 H7 的抗体治疗含血凝素 H7 的病毒的感染 ； (6)、 采用上述步骤 (1)-(5) 中的方法针对其它亚型的血凝素如 H0、 H1、 H2、 H3、 H5、 H9 等采用基因重组技术制备这些亚型的血凝素的纯蛋白抗原、 注射相应血凝素 纯蛋白到动物 / 人体内 , 应用相应的血凝素纯蛋白抗。
6、原进行该血凝素的检测方法的开发 , 应用针对相应的血凝素的抗体进行该血凝素的检测方法的开发 , 应用血凝素纯抗原预防 含有相应血凝素的病毒的感染 , 应用针对血凝素的抗原治疗含有相应血凝素的病毒的感 染。 权 利 要 求 书 CN 103898139 A 2 1/2 页 3 一种新型基因重组纯蛋白抗原的制备工艺 技术领域 0001 本发明涉及血凝素病毒的防护和检测试剂的开发技术领域， 尤其涉及一种新型基 因重组纯蛋白抗原的制备工艺。 背景技术 0002 H7N9 型禽流感是一种新型禽流感， 于 2013 年 3 月底在上海和安徽两地率先发现。 H7N9 型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，。
7、 尚未纳入我国法定报告传染病监测报告 系统， 并且至 2013 年 4 月初尚未有疫苗推出。被该病毒感染均在早期出现发热等症状， 至 2013 年 4 月尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。2013 年 4 月经调查， H7N9 禽流 感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、 浙江、 江苏鸡群的基因重配。截至 2013 年 5 月 29 日 10 时， 全国已确诊 131 人， 37 人死亡， 76 人痊愈。病例分布于北京、 上海、 江苏、 浙 江、 安徽、 山东、 河南、 台湾、 福建等地。H7N9 禽流感在华东及其他地区导致了大量的感染病 例， 目前尚无有效的预防和治疗手段， 在研的H。
8、7N9疫苗包括灭活、 减毒的H7N9病毒、 基因重 组的 H7N9 类病毒颗粒等， 这些病毒和病毒颗粒包含神经氨酸酶、 基质蛋白、 包膜、 核蛋白和 RNA 等杂质， 纯度不高， 并不能抑制病毒的扩散。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种新型基因重组纯蛋白抗原的制备工艺， 它具备纯度高和 抗原性好的特点， 不以颗粒状存在， 即不包含任何 RNA 等遗传物质， 也不包含其它蛋白杂 质， 可用于制备针对 H7N9 的高特异性抗体， 由于 H7 抗原的蛋白特性， 层析方法可用于该单 一抗原的纯化， 并且实现 SEC-HPLC 高于 90% 的纯度， 高纯度的 H7 抗原和高特异性的 H7N9。
9、 抗体可用于开发诊断 H7N9 禽流感的诊断试剂。 0004 为了解决背景技术所存在的问题， 本发明是采用以下技术方案 ： 它的制备工艺为 ： 1、 血凝素 H7 抗原的基因重组表达 ： (a)、 血凝素 H7 的基因克隆到质粒 / 宿主细胞中 ； (b） 、 宿主细胞的培养 / 质粒的复制 ； (c） 、 宿主细胞表达 H7 抗原 ； 2、 血凝素 H7 抗原的制备 ： (d)、 宿主细胞的培养与扩增 ； (e） 、 血凝素纯蛋白抗原的表达 ； (f） 、 血凝素纯蛋白抗原与宿主细 胞 ； (g） 、 采用一步和多步层析方法纯化 ； (h） 、 加入稳定剂/佐剂做成制剂 ； 3、 应用血凝素。
10、纯 蛋白抗原于动物 / 人体 : (i） 、 应用血凝素纯蛋白抗原于动物产生抗体 ； (j） 、 针对该血凝素 纯蛋白抗原的抗体对含有该血凝素的病毒的感染具有防护作用 ； (k） 、 应用该血凝素纯蛋白 抗原预防含有该血凝素的病毒的感染 ； (l） 、 应用该血凝素纯蛋白抗原及抗体开发针对该血 凝素的检测 ； 4、 高纯度的血凝素 H7 抗原用于检测含血凝素 H7 的病毒的检测 ； 5、 应用血凝 素H7纯抗原预防含血凝素H7的病毒的感染， 应用针对血凝素H7的抗体治疗含血凝素H7的 病毒的感染 ； 6、 采用上述步骤 1-5 中的方法针对其它亚型的血凝素如 H0、 H1、 H2、 H3、 H。
11、5、 H9 等采用基因重组技术制备这些亚型的血凝素的纯蛋白抗原、 注射相应血凝素纯蛋白到动物 / 人体内， 应用相应的血凝素纯蛋白抗原进行该血凝素的检测方法的开发， 应用针对相应的 血凝素的抗体进行该血凝素的检测方法的开发， 应用血凝素纯抗原预防含有相应血凝素的 说 明 书 CN 103898139 A 3 2/2 页 4 病毒的感染， 应用针对血凝素的抗原治疗含有相应血凝素的病毒的感染。 0005 本发明具备纯度高和抗原性好的特点， 不以颗粒状存在， 即不包含任何 RNA 等遗 传物质， 也不包含其它蛋白杂质， 可用于制备针对 H7N9 的高特异性抗体， 由于 H7 抗原的蛋 白特性， 层析。
12、方法可用于该单一抗原的纯化， 并且实现SEC-HPLC高于90%的纯度， 高纯度的 H7 抗原和高特异性的 H7N9 抗体可用于开发诊断 H7N9 禽流感的诊断试剂。 0006 具体实施方式 ： 本具体实施方式采用以下技术方案 ： 它的制备工艺为 ： 1、 血凝素 H7 抗原的基因重组表 达 ： (a)、 血凝素 H7 的基因克隆到质粒 / 宿主细胞中 ； (b） 、 宿主细胞的培养 / 质粒的复制 ； (c） 、 宿主细胞表达 H7 抗原 ； 2、 血凝素 H7 抗原的制备 ： (d)、 宿主细胞的培养与扩增 ； (e） 、 血 凝素纯蛋白抗原的表达 ； (f） 、 血凝素纯蛋白抗原与宿主细。
13、胞 ； (g） 、 采用一步和多步层析方 法纯化 ； (h） 、 加入稳定剂 / 佐剂做成制剂 ； 3、 应用血凝素纯蛋白抗原于动物 / 人体 : (i） 、 应用血凝素纯蛋白抗原于动物产生抗体 ； (j） 、 针对该血凝素纯蛋白抗原的抗体对含有该血 凝素的病毒的感染具有防护作用 ； (k） 、 应用该血凝素纯蛋白抗原预防含有该血凝素的病毒 的感染 ； (l） 、 应用该血凝素纯蛋白抗原及抗体开发针对该血凝素的检测 ； 4、 高纯度的血凝 素 H7 抗原用于检测含血凝素 H7 的病毒的检测 ； 5、 应用血凝素 H7 纯抗原预防含血凝素 H7 的病毒的感染， 应用针对血凝素H7的抗体治疗含血凝。
14、素H7的病毒的感染 ； 6、 采用上述步骤 1-5 中的方法针对其它亚型的血凝素如 H0、 H1、 H2、 H3、 H5、 H9 等采用基因重组技术制备这 些亚型的血凝素的纯蛋白抗原、 注射相应血凝素纯蛋白到动物 / 人体内， 应用相应的血凝 素纯蛋白抗原进行该血凝素的检测方法的开发， 应用针对相应的血凝素的抗体进行该血凝 素的检测方法的开发， 应用血凝素纯抗原预防含有相应血凝素的病毒的感染， 应用针对血 凝素的抗原治疗含有相应血凝素的病毒的感染。 0007 本具体实施方式具备纯度高和抗原性好的特点， 不以颗粒状存在， 即不包含任何 RNA等遗传物质， 也不包含其它蛋白杂质， 可用于制备针对H7N9的高特异性抗体， 由于H7抗 原的蛋白特性， 层析方法可用于该单一抗原的纯化， 并且实现SEC-HPLC高于90%的纯度， 高 纯度的 H7 抗原和高特异性的 H7N9 抗体可用于开发诊断 H7N9 禽流感的诊断试剂。 说 明 书 CN 103898139 A 4 。