一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法.pdf

本发明提供一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法。主要针对城市园林绿化中毛白杨幼苗雌雄株苗期的鉴别。通过配制磷酸缓冲液，利用石蕊试液的显色反应，加之苗期适宜的处理，保障了毛白杨幼苗雌雄株早期的鉴别所需要的各种条件。经过毛白杨幼苗雌雄株的研磨、浸提、离心等步骤，提供一种可在城市园林绿化的生产实践中大面积应用，既可解决毛白杨幼苗雌雄株鉴别难题，又可操作简便、准确率高、缩短鉴别时间、节约成本的有效方法。

权利要求书
1.  一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，其特征在于包括如下步骤：
（一）材料的准备：取毛白杨幼苗叶片，洗净，吸干水分，备用；
（二）检测：
1)称取毛白杨幼苗叶片，剪碎；
2)加入磷酸缓冲液，冰浴研磨呈匀浆；
3)室温下浸提1-1.5h；
4)浸提液在5000rpm离心5min，取上清液；
5)0.1g石蕊溶于50ml水中，静置一昼夜后过滤，在滤液中加入30ml95%的乙醇，再加水稀释至100ml；
6)取上清液2ml，加入0.1%石蕊试液，混匀；
7)置于30℃温度下，观察浸提液颜色变化所需的时间，并每隔2-3min记录毛白杨浸提液的颜色变化。

2.  如权利要求1所述的一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液的pH为6.8。

3.  如权利要求1或2所述的一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，其特征在于：根据浸提液颜色变化判定雌雄株，具体方法为：毛白杨浸提液在加入石蕊试液后均呈紫色，随着时间的不断延长，在10-15min内雌株浸提液由紫色转至红色，雄株浸提液仍为紫色。

说明书一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种植物雌雄株的鉴别方法，特别涉及一种针对毛白杨雌雄株早期的鉴别方法。
背景技术
自然界大部分植物是雌雄同株，而毛白杨等少数树种却是雌雄异株；雄毛白杨只开花不结果，雌毛白杨才会结果；即使将雌毛白杨的枝条嫁接到雄毛白杨树上，也只有这根枝条结果。一般从外观上很难区分毛白杨树是雄是雌。两者在树形上只有细微差别，雌毛白杨的树冠向两边扩张，雄毛白杨的树冠是拼命往上长，只有业内专业人员能区分雌雄株。雄毛白杨由于不结果的原因，被砍伐的比较多，所以目前自然界中，毛白杨树是雌多、雄少。
毛白杨雌雄株的生长习性、形态、特征与用途各不相同，及早并正确地区分雌雄株，在生产实践上具有重要意义。毛白杨高达30-40m，生长迅速，10年成才，因木材轻而细密，淡黄褐色，纹理直，易加工，可供建筑、家具、胶合板、造纸及人造纤维等用。毛白杨干端直，树形高大广阔，颇具雄伟气概，加上抗烟尘和抗污染能力强，在城市园林绿化中最广泛使用的行道树。近几年来在我国发展迅速，种植规模日渐扩大，特别是在城市园林绿化工程中被广泛使用。毛白杨为雌雄异株植物，实生树定植后需5-10年才能开花结果，分出雌雄。毛白杨雌雄异株葇荑花序。城市园林绿化中经常不分雌雄混繁混育，形成雌雄混植。在雌株飞花期，杨絮随风飘荡，不但容易使人体呼吸产生不良反应，而且极易导致皮肤过敏。乱飞的杨花柳絮不仅影响市容，而且会对人体造成影响，甚至会附在汽车水箱散热器和空调冷凝板上，影响散热效果，易发生交通意外。因此，毛白杨雌雄株性别的早期鉴别不仅具有理论意义，而且具有重要的实用价值。
在毛白杨幼苗幼树期，可以采用形态鉴别法、生理生化指标法、同工酶谱和染色体核型鉴定法等方法。虽然凭外部形态特征来鉴别毛白杨性别，方法简单易行，但要等植株达到一定年龄(大约10年以上)才能区分雌雄株，而且毛白杨雌雄株在苗期形态指标差距不大，缺少数字化和图谱的明确标准，因而毛白杨苗期形态鉴定存在一定难度。毛白杨的生理生化指标大多力求从不同侧面寻找已知性别的成年植株之间进行测定，表现出一定的差异性，尽管有些差异在苗期也有反映，但多表现在量的方面，而且随水分、养分、CO2浓度、温度、光照和干扰水平等的不同而有所不同。同工酶谱和染色体核型鉴定法准确率较高，但是酶带差异 不一定是雌雄性别造成的，有可能与其他性状的变异有关，诸如叶片性状等，这些变异在毛白杨雌雄株内普遍存在，且由于在早期鉴定时，可选择的酶种类较少，显色的酶带不多，有时并不能区分开雌雄株。而且操作工序复杂，需要CTAB、PVP、Tris-HCl、酚、氯仿、TE、溴化乙锭等药品，药品昂贵，毒性大，还要引物和PCR仪，仪器设备要求高，要有较高专业知识的人操作，普通实验室难以进行。所以以上这些方法均不宜在城市园林绿化工程中推广。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种毛白杨雌雄株早期的简单易行的鉴别方法，实验药品用量少，仪器设备简单，在园林公司或苗圃，普通工人就可以进行操作，将本发明的技术应用在城市园林绿化工程中，既简便又有效，具有较高的应用价值。
本发明采用的技术方案是：一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，包括如下步骤：
（一）材料的准备：取毛白杨幼苗叶片，洗净，吸干水分，备用；
（二）检测：
1)称取毛白杨幼苗叶片，剪碎；
2)加入磷酸缓冲液，冰浴研磨呈匀浆；
3)室温下浸提1-1.5h；
4)浸提液在5000rpm离心5min，取上清液；
5)0.1g石蕊溶于50ml水中，静置一昼夜后过滤，在滤液中加入30ml95%的乙醇，再加水稀释至100ml；
6)取上清液2ml，加入0.1%石蕊试液4-5ml，混匀；
7)置于30℃温度下，观察浸提液颜色变化所需的时间，并每隔2-3min记录毛白杨浸提液的颜色变化。
上述的毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，所述的磷酸缓冲液的pH为6.8。优选的，pH为6.8的磷酸缓冲液的制备方法如下：将NaH2PO4·H2O27.8g加水配成1000ml溶液，Na2HPO4·7H2O53.65g加水配成1000ml溶液；取62.5ml NaH2PO4·H2O溶液和37.5ml Na2HPO4·7H2O溶液混合，加水稀释至200ml。
制备0.1%石蕊试液：0.1g石蕊溶于50ml水中，静置一昼夜后过滤，在滤液中加入30ml95%的乙醇，再加水稀释至100ml。
上述的毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法，还包括如下步骤：根据浸提液颜色变化判定雌雄株，具体方法为：毛白杨浸提液在加入石蕊试液后均呈紫色，随着时间的不断延长，在10-15min内雌株浸提液由紫色转至红色，雄株浸提液仍为紫色；1-2h后两者都呈红色，差异消失。
本发明的有益效果是：
1.操作简便：本发明由于在毛白杨苗期提供了直观明显的显色反应，比生理指标鉴别法、化学物质分析鉴别法、同工酶图谱鉴定法、染色体核型鉴定法、核酸技术鉴别法等方法简便易行，这些方法都必须有相应的仪器设备和化学药品，鉴定成本昂贵，而且需要有专业人员进行操作，而本方法操作简单，园林公司或苗圃的普通工人就可以进行操作。
2.准确率高：毛白杨雄株苗木主干树皮发青绿色。叶片较厚、浓绿色，背面密生白色绒毛。苗干中、下部的休眠芽向外开张。侧枝与主干的夹角较小，多近于60°，主稍生长势强。毛白杨雌株苗木主干树皮呈带有浅淡红褐色的绿色，也有的呈带有浅淡黄褐色的绿色。叶片较薄、黄绿色，背面白色绒毛极少。苗木中、下部的休眠芽紧紧贴主千生长。侧枝与主干的夹角较大，多近于90°，主稍生长势较弱，并多略带弯曲。形态鉴别法简单方便，但经验性强，可靠性不足。本发明以石蕊试液进行显色反应，毛白杨雌雄株颜色变化明显，在毛白杨苗期就可以确定雌雄，准确率可达100%，比形态鉴别法准确率高，可以在城市园林绿化工程中推广。
3.缩短鉴别时间：本发明由于采用pH6.8磷酸缓冲液进行处理，观察颜色变化所需时间大大缩短，毛白杨雌雄株处理大约10min就可以表现出明显差异，比其它方法所需时间都短，在30min内即可确定雌雄株。
4.节约成本：毛白杨生长快、材质好、寿命长、抗逆性强，树干通直、树体高大，是我国北方园林绿化的主要速生树种。毛白杨雄株花开得比较早，3月中上旬，叶子还没长满树就挂满黑色的“毛毛虫”(柔荑花序，像一个下垂的狗尾巴草花穗)，树叶快长出来的时候黑色“毛毛虫”就掉光了，所以雄株不飘絮。讨人烦的杨絮是雌株惹的祸，刚开始雌株的花序也是黑色的像毛毛虫，但“毛毛虫”不掉，而是很快变成绿色，与叶子一起生长，等到4月中旬叶子长满树冠的时候它也开始飘絮了。实生树定植后需10-15年才能开花结果，分出雌雄。本方法在苗期就可以确定雌雄，避免毛白杨成熟以后产生不良结果，造成不必要的经济损失。
具体实施方式
实施例1温度和pH值对毛白杨雌雄株鉴别方法的影响
（一）材料与方法
分别取10株20年生已知的成熟毛白杨雌雄株叶片和10株3年生已知雌雄的毛白杨幼苗叶片，洗净，吸干水分，备用。
称取0.5-1.0g毛白杨叶片，剪碎，加入4-5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨呈匀浆，室温下浸提1-1.5h；浸提液在5000rpm离心5min。取上清液2ml，加入0.1%石蕊试液4-5ml，混匀，观察环境温度和磷酸缓冲液的pH值对浸提液颜色变化的影响。
（二）温度对颜色变化的影响
固定磷酸缓冲液的pH6.8，分别在20℃、25℃、30℃、35℃温度下观察浸提液颜色变化情况。试验发现，温度和浸提液颜色变化的关系很密切。20℃下观察，雌雄株浸提液出现颜色差异和差异消失的时间分别是约40min左右和约2h左右；25℃下观察，雌雄株浸提液出现颜色差异和差异消失的时间分别是约30min左右和约1h左右；30℃则分别缩短到15min左右和0.5h；35℃下观察，雌雄株浸提液出现颜色差异和差异消失的时间分别是约35min左右和约1.5h左右。由此可知，30℃为观察浸提液颜色变化的最佳温度。
（三）不同pH值磷酸缓冲液的影响
以pH6.0、pH6.4、pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.5磷酸缓冲液浸提，然后在30℃的环境下，观察浸提液的颜色变化。预先为其创造一个微酸环境，以蒸馏水(pH6.2)浸提液为对照，观察雌雄株浸提液颜色变化的情况。结果表明，pH7.0、pH7.5磷酸缓冲液的浸提液基本保持起始时的颜色，雌雄株浸提液颜色始终无明显差异，不能达到区分雌雄株的目的；pH6.0磷酸缓冲液的浸提液，虽然起始时的颜色已接近变色临界点，却不能使颜色变化的进程提早，情况基本与对照一致。但是以pH6.8磷酸缓冲液浸提，不仅雌雄株浸提液出现颜色差异的时间提前，从而为观察提供了足够的时间。因此，pH6.8磷酸缓冲液为优选磷酸缓冲液。
（四）石蕊试液和溴代麝香草酚蓝溶液的显色区别
溴代麝香草酚蓝溶液是一种酸碱指示剂，指示范围是pH6.8-7.6。在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈黄色。但是，溴代麝香草酚蓝这种药品很难买到。一般在县级市的医药公司化学试剂商店和其它颜料商店不易买到，而且实验时用量很少。
我们经过多次试验、探索，用石蕊试液代替溴代麝香草酚蓝溶液，结果实验非常成功， 效果也非常好。现把溴代麝香草酚蓝和石蕊两种指示剂作一比较：

从上表可看出，石蕊试剂的pH5.0-8.0，与BTB溶液的pH相似。新鲜配制的石蕊试液在12h内使用效果最好，能在较短的时间（大约30min）鉴别出雌雄株。因此，生物在含有这种试剂的水中短时间生活也是没有影响的，而且这种试剂化学实验室中就有，使用比较方便。
实施例2一种毛白杨幼苗雌雄株的鉴别方法
一、步骤如下：
（一）材料的准备：
1）选取毛白杨幼苗生长健壮的叶片；
2）叶片经流水冲洗4-5min；
3）吸干水分；
4）用保鲜袋密封；
5）4℃冰箱保存备用；
（二）检测方法：
1)制备磷酸缓冲液，方法如下：将NaH2PO4·H2O27.8g加水配成1000ml溶液，Na2HPO4·7H2O53.65g加水配成1000ml溶液；取62.5ml NaH2PO4·H2O溶液和37.5mlNa2HPO4·7H2O溶液混合，加水稀释至200ml，得浓度为0.2mol/L，pH为6.8的磷酸缓冲液；
2)制备0.1%石蕊试液：0.1g石蕊溶于50ml水中，静置一昼夜后过滤，在滤液中加入30ml95%的乙醇，再加水稀释至100ml；
3)称取0.5-1.0g毛白杨叶片，剪碎；
4)加入4-5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨呈匀浆；
5)室温下浸提1-1.5h；
6)浸提液在5000rpm离心5min，取上清液；
7)取上清液2ml，加入0.1%石蕊试液4-5ml，混匀；
8)置于30℃温度下，观察浸提液颜色变化所需时间的长短，并每隔2-3min记录毛白杨浸提液的颜色变化；
（三）根据浸提液颜色变化判定雌雄株，具体方法为：
毛白杨浸提液在加入石蕊试液后均呈紫色，随着时间的不断延长，在10-15min内雌株浸提液由紫色转至红色，雄株浸提液仍为紫色；1-2h后两者都呈红色，差异消失。
二、实验结果
1、形态鉴别法采用：
（1）雄株苗木主干树皮发青绿色。叶片较厚、浓绿色，背面密生白色绒毛；雌株苗木主干树皮呈带有浅淡红褐色的绿色，也有的呈带有浅淡黄褐色的绿色。叶片较薄、黄绿色，背面白色绒毛极少。
（2）雄株苗木中、下部的休眠芽向外开张。侧枝与主干的夹角较小，多近于60°；雌株苗木中、下部的休眠芽紧紧贴主千生长。侧枝与主干的夹角较大，多近于90°。
（3）雄株主稍生长势强。雌株主稍生长势较弱，并多略带弯曲。
（4）雄株的皮孔多为散生，较大呈菱形；雌株枝条皮孔较小，多横向连生，呈线状排列。
（5）雄株冬芽有明显的两种，一为膨大的园锥状雄花芽，一为瘦小的叶芽；而雌株上的冬芽瘦小，难辩出花叶或叶芽。
2、结论
①用本发明的方法和形态鉴别法分别对50株20年生成熟毛白杨已知的雌雄株进行鉴定，结果表明：形态鉴别法准确率为95%。形态鉴别法经验性强，即使经验丰富的人员也很难准确鉴别，而且毛白杨雌雄株苗期形态差异不大，无法进行外部形态鉴别。而采用本发明以石蕊试液进行显色反应的方法准确率为100%。
②用本发明的方法对50株3年生毛白杨幼苗已知雌雄株进行鉴定，准确率为100%。