荧光性标记单链核酸及其用途技术领域
本发明涉及荧光性标记单链核酸及其用途。本发明涉及能够进一步降低荧光背景
的荧光性标记单链核酸及其用途。
关联申请的相互参照
本申请要求2014年3月31日申请的日本特愿2014-72280号的优先权，其全部记载
特别地作为公开而援引于此。
背景技术
在细胞的生命现象的解析及疾病因子的诊断中要求以分子水平的检测、诊断。为
了达成该检测、诊断，需要检测特定的蛋白质、核酸序列，在该检测中，荧光被广泛利用。具
体而言，已知有使用与靶蛋白质、及靶核酸序列那样的靶物质键合而荧光强度增大那样的
荧光物质的方法。作为上述荧光物质，例如利用显示福斯特共振能量转移(FRET)效应的物
质、嵌入双螺旋结构中并通过激发光的照射而发出荧光的物质。
例如，在非专利文献1中记载的Molecular Beacon法中，使用在单独采取茎-环结
构的核酸序列的5’末端、3’末端分别导入了不同的色素的核酸。在没有杂交时通过FRET效
应而消光，若产生特异性杂交则发出荧光。在该方法中，存在序列需要采取茎-环结构、需要
将荧光色素导入末端等制约。
因此，作为代替上述那样的现有技术的其它的消光机制，提出了采用由于两个以
上的色素分子并列地集合而产生的激子效应的方法(非专利文献2～5、专利文献1)。其是使
用复合体标记物质的方法，所述复合体标记物质在同一分子内具有以下的两个以上的色素
分子的化学结构，即，在单链时通过激子效应而不显示荧光发光，但若这些分子与核酸嵌入
或进行沟槽键合(groove binding)，则通过上述集合状态解开而产生荧光发光。
使用将该标记物质导入低聚核苷酸而得到的引物或探针(有时称为激子低聚物)，
可以用于靶核酸的扩增、检测。该激子低聚物等能够以一种色素实现杂交前后的荧光的开
关，此外，在利用于扩增反应的实时监控中的情况下，能够给予序列特有的荧光信号。因此，
能够克服在使用SYBR Green I等嵌人剂时非特异性扩增也被检测这样的现有技术的问题。
进而，由于能够将荧光团导入dT或dC，所以也基本能够避免序列的制约。
专利文献1：日本特开2009-171935号公报(日本专利第4370385号公报)
专利文献2：日本特开2013-183736号公报
专利文献1及2的全部记载特别地作为公开而援引于此。
非专利文献1：Tyagi,S.,Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechnol.14,303-308.
非专利文献2：Ikeda S,Kubota T,Kino K,Okamoto A.,Bioconjug
Chem.2008.19.1719-1725.
非专利文献3：Ikeda S,Kubota T,Yuki M,Okamoto A.,Angew Chem Int Ed
Engl.2009.48.6480-6484.
非专利文献4：Ikeda S,Yuki M,Yanagisawa H,Okamoto A.,Tetrahedron
Lett.2009,51,7191-7195
非专利文献5：Takeshi Hanami,Diane Delobel,Hajime Kanamori,Yuki Tanaka,
Yasumasa Kimura,Ayako Nakasone,Takahiro Soma,Yoshihide Hayashizaki,Kengo
Usui,Matthias Harbers,PLOS ONE,August 2013,volume8,Issue 8,e70942
非专利文献1～5的全部记载特别地作为公开而援引于此。
发明内容
发明所要解决的课题
但是，本发明人们进一步进行了研究，结果判明：即使是使用上述激子低聚物的情
况下，在高灵敏度的测定中，也存在一定的背景。进而，还判明：该背景在使用激子低聚物作
为探针，且在与微量的靶键合时产生的微弱的荧光的检测的方法等中，有时阻碍荧光的检
测。
因此，本发明的目的在于，提供进一步降低了上述激子低聚物所具有的背景的新
型荧光性标记单链核酸、及提供该荧光性标记单链核酸的新用途。
以往的激子低聚物是导入了两个荧光色素(噻唑橙或其类似物)的标记单链核酸，
在单链的状态下通过两个荧光色素形成激发复合体的激子效应，基本不发出荧光。但是，例
如具有以下荧光开关的性质：若与靶DNA杂交，则两个色素彼此分离，通过消除激子效应而
发挥荧光色素本来所具有的荧光性。
但是，本发明人进行了研究，结果判明：由激子效应产生的荧光的消光机制也不完
美，无法将荧光色素本来所具有的荧光性完全消光，因此，单链时的荧光来源的背景虽然少
但存在。因此，以激子低聚物作为基本骨架，为了进一步降低荧光的背景的目的而反复进行
了研究。其结果发现：通过将由激子效应产生的荧光开关与FRET效应组合，能够进一步降低
荧光的背景，从而完成本发明。
用于解决课题的方案
本发明如下所述。
[1]一种标记单链核酸，其特征在于，其是具有至少两个显示激子效应的一对荧光
性原子团的标记单链核酸，
上述一对荧光性原子团中的一个(以下，称为一对荧光性原子团A)所具有的发光
峰值波长比一对荧光性原子团中的另一个(以下，称为一对荧光性原子团B)所具有的激发
峰值波长短，
上述一对荧光性原子团A与上述一对荧光性原子团B具有福斯特共振能量转移
(FRET)效应。
[2]根据[1]所述的标记单链核酸，其中，具有上述一对荧光性原子团A的碱基和具
有上述一对荧光性原子团B的碱基以上述一对荧光性原子团A与上述一对荧光性原子团B具
有FRET效应那样的距离被包含于上述标记单链核酸中。
[3]根据[2]所述的标记单链核酸，其中，
具有上述一对荧光性原子团A的碱基与具有上述一对荧光性原子团B的碱基之间
的距离为1个碱基～11个碱基。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的标记单链核酸，其中，
具有上述显示激子效应的一对荧光性原子团的碱基具有下述式(16)、(16b)、
(17)、或(17b)所表示的结构。
[化学式1]
[化学式2]
[化学式3]
[化学式4]
式(16)、(16b)、(17)、及(17b)中，
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工
核酸碱基骨架的原子团，
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或由它们中的任一者衍生的结构的原子团、
或者(ii)具有肽结构或类肽结构的原子团，
Z11及Z12分别为显示激子效应的荧光性原子团，可以相同，也可以不同，
L1、L2及L3分别为连接片段(交联原子或原子团)，主链长(主链原子数)任意，主链
中可以分别包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主链中可以分别包含或不包含单键、双键、三键、
酰胺键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键及硫酯键，L1、L2及L3彼此可以相同，也可以不
同，
D为CR、N、P、P＝O、B或SiR，R为氢原子、烷基或任意的取代基，
b为单键、双键或三键，
或者，上述式(16)及(16b)中，L1及L2为上述连接片段，L3、D及b不存在，L1及L2也可
以与B直接键合，
其中，式(16)、及(17)中，E为上述(i)的原子团，磷酸交联中的至少一个O原子也可
以被S原子取代，
式(16b)、及(17b)中，E为上述(ii)的原子团，
式(17)及(17b)中，各B可以相同，也可以不同，各E可以相同，也可以不同。
[5]根据[4]所述的标记单链核酸，其中，
上述式(16)所表示的结构为下述式(16-1)或(16-2)所表示的结构，
上述式(16b)所表示的结构为下述式(16b-1)或(16b-2)所表示的结构，
上述式(17)所表示的结构为下述式(17-1)所表示的结构，
上述式(17b)所表示的结构为下述式(17b-1)所表示的结构。
[化学式5]
[化学式6]
[化学式7]
[化学式8]
[化学式9]
[化学式10]
式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)及(17b-1)中，
l、m及n为任意的正整数，可以相同，也可以不同，主链中可以分别包含或不包含C、
N、O、S、P及Si，主链中可以分别包含或不包含单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、亚氨
基、醚键、硫醚键及硫酯键，
B、E、Z11、Z12及b与上述式(16)、(16b)、(17)及(17b)相同，
上述式(16-1)、(16-2)及(17-1)中，磷酸交联中的O原子的一个以上也可以被S原
子取代。
[6]根据[4]或[5]所述的标记单链核酸，其中，
具有上述显示激子效应的一对荧光性原子团的碱基具有上述式(16)所表示的结
构。
[7]根据[4]～[6]中任一项所述的标记单链核酸，其中，
Z11及Z12分别独立地为下述式(7)～(10)中的任一者所表示的原子团。
[化学式11]
[化学式12]
[化学式13]
[化学式14]
式(7)～(9)中，
X1及X2为S或O，
n为0或正整数，
R1～R10、R13～R21分别独立地为氢原子、卤素原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或
氨基，
R11及R12中的一者为与上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L1或L2键合的连结基
团，另一者为氢原子或低级烷基，
R15在式(7)、(8)或(9)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
R16在式(7)、(8)或(9)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
Z11中的X1、X2及R1～R21与Z12中的X1、X2及R1～R21彼此可以相同，也可以不同，
式(10)中，
E为S或O，
R2～R12分别独立地为氢原子、卤素原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基，
R1为与上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L1或L2键合的连结基团，
R3在式(10)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
R4在式(10)中存在多个时，可以相同，也可以不同。
[8]根据[7]所述的标记单链核酸，其中，
Z11及Z12分别独立地为上述式(7)或(8)所表示的原子团，
上述式(7)或(8)所表示的Z11及Z12为下述式(19)或(20)所示的基团。
[化学式15]
[化学式16]
式(19)及(20)中，
X1、R1至R10、R13及R14、R11以及R12与式(7)～(9)相同。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的标记单链核酸，
其作为用于扩增靶核酸的引物或用于与靶核酸杂交的探针使用。
[10]一种靶核酸的检测方法，其中，
以[1]～[8]中任一项所述的标记单链核酸作为探针，在能够与靶核酸杂交的条件
下，通过测定荧光而求出有无与探针的杂交。
[11]一种靶核酸的扩增方法，
其包括以下工序：使用[1]～[8]中任一项所述的标记单链核酸作为引物，将靶核
酸进行扩增。
发明效果
根据本发明，能够提供以激子低聚物作为基本骨架的标记单链核酸、即能够进一
步降低荧光的背景的标记单链核酸。
附图说明
图1A表示实施例1中得到的本发明的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光
核酸探针的光谱测定结果。这里表示使用低聚核苷酸(EX16-12TOTP)的结果，其中所述低聚
核苷酸在自3’末端起第12个碱基上具有噻唑粉(TP)、且在自3’末端起第16个碱基上具有噻
唑橙(TO)。
图1B表示实施例1中得到的导入了一个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(现有技术)的光谱测定结果。这里表示使用具有与EX16-12TOTP相同的序列、且在自3’末端
起第16个碱基上具有噻唑橙(TO)的低聚核苷酸(EX16.TO)的结果。
图1C表示实施例1中得到的导入了一个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(现有技术)的光谱测定结果。这里表示使用具有与EX16-12TOTP相同的序列、且在自3’末端
起第12个碱基上具有噻唑粉(TP)的低聚核苷酸(EX16.TP)的结果。
图2A表示实施例1中得到的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(EX8-12TOTP)的熔化曲线解析结果(噻唑橙(TO、自3’末端起第8个碱基)与噻唑粉(TP、自3’
末端起第12个碱基)间的距离：3个碱基)。作为比较，还示出在与上述相同的位置仅导入了
噻唑橙(TO)的荧光核酸探针的熔化曲线解析结果。
图2B表示实施例1中得到的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(EX10-12TOTP)的熔化曲线解析结果(噻唑橙(TO、自3’末端起第10个碱基)与噻唑粉(TP、自
3’末端起第12个碱基)间的距离：1个碱基)。作为比较，还示出在与上述相同的位置仅导入
了噻唑橙(TO)的荧光核酸探针的熔化曲线解析结果。
图2C表示实施例1中得到的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(EX14-12TOTP)的熔化曲线解析结果(噻唑橙(TO、自3’末端起第14个碱基)与噻唑粉(TP、自
3’末端起第12个碱基)间的距离：1个碱基)。作为比较，还示出在与上述相同的位置仅导入
了噻唑橙(TO)的荧光核酸探针的熔化曲线解析结果。
图2D表示实施例1中得到的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(EX16-12TOTP)的熔化曲线解析结果(噻唑橙(TO、自3’末端起第16个碱基)与噻唑粉(TP、自
3’末端起第12个碱基)间的距离：4个碱基)。作为比较，还示出在与上述相同的位置仅导入
了噻唑橙(TO)的荧光核酸探针的熔化曲线解析结果。
图2E表示实施例1中得到的导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针
(EX18-12TOTP)的熔化曲线解析结果(噻唑橙(TO、自3’末端起第18个碱基)与噻唑粉(TP、自
3’末端起第12个碱基)间的距离：8个碱基)。作为比较，还示出在与上述相同的位置仅导入
了噻唑橙(TO)的荧光核酸探针的熔化曲线解析结果。
具体实施方式
<标记单链核酸>
本发明为具有至少两个显示激子效应的一对荧光性原子团的标记单链核酸。并
且，该本发明的标记单链核酸的特征在于，
(a)上述一对荧光性原子团中的一个(一对荧光性原子团A)所具有的发光峰值波
长比一对荧光性原子团中的另一个(一对荧光性原子团B)所具有的激发峰值波长短，并且，
(b)上述一对荧光性原子团A与上述一对荧光性原子团B具有福斯特共振能量转移
(FRET)效应。
关于显示激子效应的一对荧光性原子团，以及关于具有该显示激子效应的一对荧
光性原子团的标记单链核酸，在专利文献1及2、以及非专利文献2～5中有记载。但是，具有
上述(a)及(b)的特征的具有至少两个显示激子效应的一对荧光性原子团的标记单链核酸
在专利文献1及2、以及非专利文献2～5中没有记载。
本发明的标记单链核酸是具有至少两个显示激子效应的一对荧光性原子团的单
链核酸。
单链核酸可以是DNA或RNA或其混成物、进而部分或全部具有非天然的核酸碱基的
核酸。此外，本发明的标记单链核酸只要是可以与靶核酸杂交，则也可以部分地包含双链结
构。详细情况在后面叙述。
对于标记单链核酸的碱基长度没有特别限制，但由于主要用途为探针或引物，进
而为具有至少两个显示激子效应的一对荧光性原子团的单链核酸，并且为满足上述(b)的
单链核酸，所以单链核酸的碱基长度例如为4～100个碱基长的范围，优选为10～50个碱基
长的范围，更优选为10～40个碱基长的范围，进一步优选为10～30个碱基长的范围。碱基长
度可以根据用途而适当选择。例如在用于mRNA的捕获剂的情况下适宜使用约80个碱基长的
单链核酸，在作为PCR引物使用的情况下，适宜使用约40个碱基长的单链核酸，在作为探针
使用的情况下，适宜使用约30个碱基长的单链核酸。
标记单链核酸所具有的显示激子效应的一对荧光性原子团的数目至少为2个，可
以为2个、及3个以上。在实用上，为了发挥FRET效应，显示激子效应的一对荧光性原子团的
数目只要为两个即可。但是，考虑标记单链核酸的用途、荧光性原子团的种类、一对荧光性
原子团的距离、FRET效应的程度等，也可以为3个，进而也可以为4个以上。
根据激子效应，例如能够抑制单链状态下的荧光强度，有效地检测双螺旋结构。所
谓激子效应(exciton coupling)例如是通过多个色素并列地集合并形成H聚集体(H-
aggregate)，从而变得基本不显示荧光发光的效应。认为该效应是因色素的激发状态通过
Davydov splitting而分裂成两个能级，向高能级的激发→向低能级的内部转换(internal
conversion)→发光发生热禁戒这样的理由而产生的。但是，这些说明不对本发明作任何限
制。所谓可以引起激子效应可以通过形成H聚集体的色素的吸收带在比单一色素的吸收带
短的波长处出现来确认。作为显示这样的效应的色素，例如可列举出上述的噻唑橙和其衍
生物、噻唑粉和其衍生物、噁唑黄和其衍生物、花青和其衍生物、半菁和其衍生物、甲基红和
其衍生物、另外一般被称为花青色素、偶氮色素的色素组。
这些色素通过嵌入双链而容易键合，所述双链是由形成了双螺旋的DNA-DNA双链
或DNA-RNA双链、或者硫代磷酸酯核酸或PNA(肽核酸)或锁核酸(LNA)(BNA)那样的人工核
酸、与DNA或RNA形成的。若将多个这样的色素导入单链核酸中，则在通常的单链状态(例如
杂交前的仅探针或引物的状态)下通过激子效应被强烈消光，但若与靶DNA或RNA杂交则聚
集体被解除，各色素分散地嵌入双链中。由于此时在色素间没有电子的相互作用，所以不产
生激子效应，显示强的荧光发光。此时的色素的吸收带与单一色素的吸收带相同，显示在色
素间没有产生激子效应。此外，在色素嵌入双链中时，由于色素本来所具有的结构上的扭曲
被消除，所以有时进一步增强荧光发光。
特征(a)
一对荧光性原子团中的一个(一对荧光性原子团A)所具有的发光峰值波长比剩余
的一对荧光性原子团中的一个(一对荧光性原子团B)所具有的激发峰值波长短。发光峰值
波长是指一对荧光性原子团A被照射激发光时产生的发光光谱的峰值波长，根据荧光性原
子团A的种类而发生变化。激发峰值波长是指一对荧光性原子团B可以吸收的激发光光谱的
峰值波长，根据荧光性原子团B的种类而发生变化。对于一对荧光性原子团A所具有的发光
峰值波长及一对荧光性原子团B所具有的激发峰值波长分别没有限制。但是，在本发明的标
记单链核酸作为探针或引物使用，并将荧光标记用于检测的情况下，由于荧光发光为来自
荧光性原子团B的发光，所以可以选择具有适于检测的发光强度及波长的荧光性原子团B，
在考虑荧光性原子团B所具有的激发峰值波长的基础上，选择荧光性原子团A。此外，荧光性
原子团A所具有的发光峰值波长与荧光性原子团B所具有的激发峰值波长的关系可以考虑
在两者之间得到的FRET效应而决定。另外，一对荧光性原子团A所具有的两个荧光性原子团
可以相同，也可以不同，一对荧光性原子团B所具有的两个荧光性原子团也可以相同，也可
以不同。一对荧光性原子团A所具有的两个荧光性原子团及一对荧光性原子团B所具有的两
个荧光性原子团中的任一者不同时，关于各荧光性原子团，一对荧光性原子团A所具有的两
个荧光性原子团中的至少一个荧光性原子团的发光峰值波长比一对荧光性原子团B所具有
的两个荧光性原子团中的至少一个荧光性原子团的激发峰值波长短。优选一对荧光性原子
团A所具有的两个荧光性原子团的发光峰值波长比一对荧光性原子团B所具有的两个荧光
性原子团的激发峰值波长短。
特征(b)
一对荧光性原子团A与一对荧光性原子团B显示FRET效应。福斯特共振能量转移
(FRET)效应也称为荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer)，是指
在接近的两个发色团之间激发能量没有变成电磁波而通过电子的共振直接转移的现象。能
量通过被一个发色团(给予体)吸收的光的能量向另一个发色团(受体)转移，在受体为荧光
分子的情况下由受体放射荧光。在本发明的标记单链核酸中，将具有比一对荧光性原子团B
所具有的激发峰值波长短的发光峰值波长的一对荧光性原子团A按照与一对荧光性原子团
B显示FRET效应的方式配置。所谓一对荧光性原子团A与一对荧光性原子团B显示FRET效应
的配置例如是具有一对荧光性原子团A的碱基与具有一对荧光性原子团B的碱基以一对荧
光性原子团A与上述一对荧光性原子团B具有FRET效应那样的距离被包含于上述标记单链
核酸中的情况。一对荧光性原子团A与一对荧光性原子团B具有FRET效应那样的距离(碱基
长)根据荧光性原子团A及B的种类、组合而不同，例如为1个碱基～11个碱基，优选为2～8个
碱基，进一步优选为2～7个碱基，更优选为2～6个碱基，进一步更优选为2～5个碱基，更进
一步优选为2～4个碱基。另外，这里，所谓1个碱基的距离是指在一对荧光性原子团A与一对
荧光性原子团B之间，存在一个不具有荧光性原子团的核酸。作为荧光性原子团A与荧光性
原子团B的组合，例如可列举出噻唑橙(D514)与噻唑粉(D570)或D640的组合、D436与噻唑橙
(D514)、噻唑粉(D570)或D640的组合。
本发明的标记单链核酸除了满足上述特征(a)及(b)以外，任意，且一对荧光性原
子团A及一对荧光性原子团B中的任一原子团均位于从该标记单链核酸的两末端起数位于
两个碱基以上内侧的碱基上。通过满足该特征，能够发挥激子效应和FRET效应这两者。
具有显示激子效应的一对荧光性原子团的碱基可例示出专利文献1及2、以及非专
利文献2～5中记载的碱基。以下具体地进行记载。
具有显示激子效应的一对荧光性原子团的碱基可以具有下述式(16)、(16b)、
(17)、或(17b)所表示的结构。
[化学式17]
[化学式18]
[化学式19]
[化学式20]
式(16)、(16b)、(17)、及(17b)中，
B为具有天然核酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工
核酸碱基骨架的原子团，
E为(i)具有脱氧核糖骨架、核糖骨架、或由它们中的任一者衍生的结构的原子团、
或(ii)具有肽结构或类肽结构的原子团，
Z11及Z12分别为显示荧光性的原子团，可以相同，也可以不同，
L1、L2及L3分别为连接片段(交联原子或原子团)，主链长(主链原子数)任意，主链
中可以分别包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主链中可以分别包含或不包含单键、双键、三键、
酰胺键、酯键、二硫键、亚氨基、醚键、硫醚键及硫酯键，L1、L2及L3彼此可以相同，也可以不
同，
D为CR、N、P、P＝O、B或SiR，R为氢原子、烷基或任意的取代基，
b为单键、双键或三键，
或者，在上述式(16)及(16b)中，L1及L2为上述连接片段，L3、D及b不存在，L1及L2也
可以与B直接键合，
其中，式(16)、及(17)中，E为上述(i)的原子团，磷酸交联中的至少一个O原子也可
以被S原子取代，
式(16b)、及(17b)中，E为上述(ii)的原子团，
式(17)及(17b)中，各B可以相同，也可以不同，各E可以相同，也可以不同。
上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中，L1、L2及L3的主链长(主链原子数)分别优选
为2以上的整数。L1、L2及L3的主链长(主链原子数)的上限没有特别限制，但例如为100以下，
更优选为30以下，特别优选为10以下。
优选上述式(16)所表示的结构为下述式(16-1)或(16-2)所表示的结构，上述式
(16b)所表示的结构为下述式(16b-1)或(16b-2)所表示的结构，上述式(17)所表示的结构
为下述式(17-1)所表示的结构，上述式(17b)所表示的结构为下述式(17b-1)所表示的结
构。
[化学式21]
[化学式22]
[化学式23]
[化学式24]
[化学式25]
[化学式26]
式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)及(17b-1)中，
l、m及n为任意的正整数，可以相同，也可以不同，主链中可以分别包含或不包含C、
N、O、S、P及Si，主链中可以分别包含或不包含单键、双键、三键、酰胺键、酯键、二硫键、亚氨
基、醚键、硫醚键及硫酯键，B、E、Z11、Z12及b与上述式(16)、(16b)、(17)及(17b)相同。
上述式(16-1)、(16-2)及(17-1)中，磷酸交联中的O原子的一个以上也可以被S原
子取代。
Z11及Z12为显示激子效应的具有荧光性的原子团。由此，例如变成双螺旋结构时的
荧光的增大较大，能够进一步有效地检测双螺旋结构。
Z11及Z12只要是显示激子效应的具有荧光性的原子团即可，上述具有荧光性的原
子团没有特别限制。从显示激子效应的观点出发，优选使用具有芳香族性的原子团。Z11及
Z12例如分别独立地更优选为由噻唑橙、噻唑粉、噁唑黄、花青、半菁、其他的花青色素、甲基
红、偶氮色素或它们的衍生物衍生的基团。此外，也可以适宜使用由其他的公知的色素衍生
的基团。通过与DNA等核酸键合而使荧光强度变化的荧光色素被报道有许多。典型的例子
中，已知溴化乙锭嵌入DNA的双螺旋结构中而显示强的荧光，经常被用于DNA检测。此外，还
已知有芘羧酰胺、氟硅酸钠那样的能够根据微观的极性来控制荧光强度的荧光色素。此外，
上述噻唑橙是将苯并噻唑环与喹啉环以次甲基连结而成的荧光色素，通常显示微弱的荧
光，但通过嵌入具有双螺旋结构的DNA中而给予强的荧光发光。此外，例如还可列举出荧光
素、Cy3等色素。
Z11及Z12分别独立地更优选为下述式(7)至(10)中的任一者所表示的原子团。
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
[化学式30]
式(7)～(9)中，
X1及X2为S或O，
n为0或正整数，
R1～R10、R13～R21分别独立地为氢原子、卤素原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或
氨基，
R11及R12中的一者为与上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L1或L2键合的连结基
团，另一者为氢原子或低级烷基，
R15在式(7)、(8)或(9)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
R16在式(7)、(8)或(9)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
Z11中的X1、X2及R1～R21与Z12中的X1、X2及R1～R21彼此可以相同，也可以不同。
式(10)中，
E为S或O，
R2～R12分别独立地为氢原子、卤素原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基，
R1为与上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L1或L2键合的连结基团，
R3在式(10)中存在多个时，可以相同，也可以不同，
R4在式(10)中存在多个时，可以相同，也可以不同。
上述式(7)～(9)中，在R1～R21中，上述低级烷基为碳原子数为1～6的直链或支链
烷基，上述低级烷氧基进一步优选为碳原子数为1～6的直链或支链烷氧基。上述式(10)中，
在R2～R12中，上述低级烷基为碳原子数为1～6的直链或支链烷基，上述低级烷氧基进一步
优选为碳原子数为1～6的直链或支链烷氧基。
上述式(7)～(9)中，在R11及R12中，此外，上述式(10)中，在R1中，上述连结基团为碳
原子数为2以上的聚亚甲基羰基，进一步优选以羰基部分与上述式(16)、(16b)、(17)、及
(17b)中的L1或L2键合。上述聚亚甲基羰基的碳原子数其上限没有特别限制，但例如为100以
下，优选为50以下，更优选为30以下，特别优选为10以下。
Z11及Z12以上述式(7)～(9)表示时，例如分别独立地更优选为式(19)或(20)所示
的基团。
[化学式31]
[化学式32]
式(19)及(20)中，X1表示-S-或-O-。R1到R10、R13及R14分别独立地表示氢原子、卤素
原子、低级烷基、低级烷氧基、硝基、或氨基。R11及R12中的一者表示与上述式(16)、(17)、
(16b)、及(17b)中的L1及L2键合的连结基团，R11及R12中的另一者表示氢原子、或低级烷基。
优选的方式如下。
(i)Z11及Z12分别独立地为上述式(19)所表示的原子团，上述式(19)中，X1为S，R1到
R10为氢原子，R11及R12中的一者为与上述式(16)、(17)、(16b)及(17b)中的L1或L2键合的连结
基团，另一者为甲基。
(ii)Z11及Z12分别独立地为上述式(19)所表示的原子团，上述式(19)中，X1为S，R1、
R4、R5、R6、R7、R9及R10为氢原子，R2、R3及R12为甲基，R8为卤素原子，R11为与上述式(16)、(17)、
(16b)及(17b)中的L1或L2键合的连结基团。
(iii)Z11及Z12分别独立地为上述式(7)所表示的原子团，上述式(7)中，X1为S，n为
1，R1到R10、R15、R16及R17为氢原子，R11为与上述式(16)、(17)、(16b)及(17b)中的L1或L2键合
的连结基团，R12为甲基。
Z11及Z12分别独立地可以为下述的各化学式中的任一者所表示的原子团。它们依
次为噻唑橙(D514)、D640、D436、D534、D543、及噻唑粉(D570)。另外，关于以原子团D开头的
名称，参照非专利文献3。
[化学式33]
[化学式34]
[化学式35]
[化学式36]
[化学式37]
[化学式38]
上述各化学式中，n为正整数。
上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中，B可以具有天然核酸碱基骨架，但如上所述，
也可以具有人工核酸碱基骨架。例如，B优选为Py(嘧啶环)、Py der.、Pu(嘌呤环)、或Pu
der.所表示的结构。其中，上述所谓Py是以下述式(11)表示的6元环中的在1位具有与E键合
的共价键、在5位具有与连接片段部键合的共价键的原子团，上述所谓Py der.是上述Py的6
元环的全部原子的至少一个被N、C、S或O原子取代的原子团，上述N、C、S或O原子也可以适当
具有电荷、氢原子或取代基，上述所谓Pu是以下述式(12)表示的稠合环中的在9位具有与E
键合的共价键、在8位具有与连接片段部键合的共价键的原子团，上述所谓Pu der.是上述
Pu的5元环的全部原子的至少一个被N、C、S或O原子取代的原子团，上述N、C、S或O原子也可
以适当具有电荷、氢原子或取代基。
[化学式39]
本发明的标记单链核酸中，核酸的基本骨架没有特别限制，例如可以是低聚核苷
酸、修饰低聚核苷酸、低聚核苷、修饰低聚核苷、聚核苷酸、修饰聚核苷酸、聚核苷、修饰聚核
苷、DNA、修饰DNA、RNA、修饰DNA、LNA、PNA(肽核酸)、或这些嵌合体分子中的任一者，也可以
是其他的结构。此外，上述核酸的基本骨架可以是天然的，也可以是人工合成的。上述核酸
在本发明的引物或引物对的情况下，例如只要是可以形成碱基对键的核酸即可，在核酸试
样或靶核酸序列的情况下，例如只要是作为用于合成互补链的模板发挥功能即可。因此，上
述核酸例如也可以是部分地、或整体完全由人工的结构构成的核苷酸衍生物。作为构成上
述核酸的人工碱基，例如可以从2-氨基-6-(N,N-二甲基氨基)嘌呤吡啶-2-酮、5-甲基吡啶-
2-酮、2-氨基-6-(2-噻嗯基)嘌呤、吡咯-2-甲醛、9-甲基咪唑并[(4,5)-b]吡啶、5-碘-2-氧
代(1H)吡啶、2-氧代-(1H)吡啶、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤、7-(2-噻嗯基)-咪唑并[4,5-b]
吡啶、溴胸腺嘧啶、氮杂腺嘌呤或氮杂鸟嘌呤中选择。
作为本发明的标记单链核酸，优选基本骨架为例如低聚核苷酸、聚核苷酸、DNA、它
们的修饰体。本发明中，所谓“核苷酸”例如可以是脱氧核苷酸及核糖核苷酸中的任一者，
“低聚核苷酸”及“聚核苷酸”例如可以由脱氧核苷酸及核糖核苷酸中的任一者构成，也可以
包含两者。本发明中，核酸的构成碱基数没有特别限制。所谓核酸的用语一般与所谓聚核苷
酸的用语含义相同。所谓低聚核苷酸的用语一般作为表示聚核苷酸中的特别是构成碱基数
少的核苷酸的用语使用。一般将例如2～100个碱基长、更一般将2～50个碱基长左右的聚核
苷酸称为“低聚核苷酸”，但并不限定于这些数值。所谓聚核苷酸的用语在本发明中，例如也
包含聚核苷酸及低聚核苷酸、以及肽核酸、吗啉代核酸、甲基膦酸酯核酸、S-低聚核酸等人
工合成核酸。
上述肽核酸(PNA)一般具有低聚核苷酸的脱氧核糖主链被肽主链取代的结构。作
为上述肽主链，例如可列举出通过酰胺键而键合的N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重复单元。作
为与PNA的肽主链键合的碱基，例如可列举出胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤
核苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、硫代尿嘧啶及2,6-二氨基嘌呤等天然存在的碱基、溴胸腺嘧
啶、氮杂腺嘌呤及氮杂鸟嘌呤等人工碱基，但并不限定于此。
LNA一般是在糖-磷酸骨架中，核糖的2'位的氧原子与4'位的碳原子之间以亚甲基
交联键合的具有两个环状结构的核酸。若包含LNA的低聚核苷酸与DNA进行退火，则双链的
构象发生变化，热稳定性上升。由于LNA与通常的低聚核苷酸相比，对于核酸的键合力较强，
所以例如通过低聚核苷酸的设计条件，能够实现更可靠、牢固的杂交。
本发明的标记单链核酸是包含具有至少两个上述的一对荧光性原子团的标记结
构的核酸，其结果是，与例如不包含上述荧光性原子团的未标记核酸相比，对于靶的特异性
高，有时杂交变强。即，本发明的标记单链核酸例如与基本骨架为相同的碱基序列且为相同
的核酸片段长的未标记核酸相比，有时熔化温度(Tm值)提高。因此，与上述未标记核酸相
比，有时能够更牢固地与靶进行杂交。因此，在具有这样的性质的本发明的标记单链核酸的
情况下，例如能够实现高效、特异性高的检测。
本发明的标记单链核酸由于还具有这样的特征，所以例如与以往的PNA或LNA等同
样地，可以成为通过提高Tm值而使扩增的特异性提高这样的应用技术。此外，通过使本发明
的标记引物的基本骨架为PNA或LNA，与未标记的PNA或LNA相比，有时能够进一步提高Tm值，
所以有可能能够更进一步提高杂交的效率。特别是如后述那样，在识别1个碱基到几个碱基
的突变的情况、或检测插入、缺失的情况下，通过使用本发明的标记单链核酸(例如也包含
标记PNA、标记LNA等)，能够实现高效、特异性高的检测。若将本发明的标记单链核酸作为例
如引物或探针使用，则根据对于靶序列的完全匹配或错配而Tm值的差大，有时杂交效率不
同。因此，有可能1个碱基识别等突变的检测进一步变得容易。此外，本发明中的标记单链核
酸由于与未标记核酸相比Tm值变高，所以还有可能实现例如与特定区域牢固地键合并将该
区域掩蔽而不成为扩增的模板那样的PCR clamp法、PNA PCR clamp法、LNA PCR clamp法、
PNA-LNA PCR clamp法中的作为引物的应用。
若示出式(1)所表示的结构的具体例子，则为下式(1-3)～(1-10)所表示的核苷酸
结构、或它们的几何异构体、立体异构体或作为盐的结构。
[化学式40-1]
[化学式40-2]
[化学式40-3]
[化学式40-4]
上述式(1-3)～(1-10)中，n为正整数。
作为本发明的标记单链核酸特别优选为具有上述的(1-1)～(1-10)所示的一对荧
光性原子团的标记单链核酸。
接着，本发明的标记单链核酸中的一对荧光性原子团的特征在于，
(i)为一个分子内的两个平面化学结构不为同一平面内，以某一定的角度而存在，
但在该分子与核酸嵌入或进行沟槽键合(groove binding)时通过两个平面化学结构按照
在同一平面内排列的方式配置而产生荧光发光的原子团，或者
(ii)为由通过由于两个以上的色素分子并列地集合而产生的激子效应而不显示
荧光发光，但在这些分子与核酸嵌入或进行沟槽键合(groove binding)时，通过上述集合
状态解开而产生荧光发光的两个以上的色素分子组构成的原子团，或者
(iii)在同一分子内具有两个以上的色素分子的化学结构，该化学结构不会因用
于两个以上的色素分子并列地集合而产生的激子效应而显示荧光发光，但在这些分子嵌入
或沟槽键合(groove binding)于核酸时，通过上述集合状态解开而产生荧光发光。
在上述(ii)或(iii)的情况下，上述色素分子优选为上述(i)记载的分子。
[标记单链核酸的合成]
本发明中的标记单链核酸可以参照专利文献1及2中记载的方法来制备。例如，上
述式(1-1)～(1-10)中所示的化合物也可以参照专利文献1及2中记载的方法来合成。
作为本发明的标记单链核酸的制造中能够应用的制造方法(合成方法)，例如有以
下的方法。即，首先，作为DNA的简便的标记化法，广泛采用使DNA中的活性氨基与标记化剂
中的经活化的羧基在缓冲溶液中反应的方法。该方法特别是能够应用于连接片段或色素的
导入。作为氨基的导入法，有利用GLEN RESEARCH公司销售的氨基修饰亚磷酰胺的方法等。
熟知有以修饰DNA作为基本骨架的核酸的合成方法，例如可以通过所谓的亚磷酰
胺法等来合成。成为其原料的亚磷酰胺试剂也可以通过公知的方法简便地合成。在本发明
的核酸为DNA、特别是短的低聚DNA的情况下，例如可以利用DNA自动合成机等简便地进行合
成。此外，例如通过PCR等，还可以合成长链状的核酸(DNA)等。DNA与色素分子的键合部位如
上所述没有特别限制，例如特别优选胸苷的5位。已知从胸苷的5位延长了各种取代基的核
苷酸衍生物的三磷酸利用DNA聚合酶的导入效率比较良好。由此，例如不仅是在本发明的核
酸为短的低聚DNA的情况下，在为长链DNA的情况下也能够简便地合成。
例如，利用了噻唑橙的单链DNA即本发明的荧光引物(标记核酸)例如具有以下等
优点：(1)仅通过使以DNA自动合成机合成的DNA在缓冲溶液中接触色素就可以制备，合成容
易；(2)通过使以酶制备的长链DNA与色素反应，还能够制作长链的荧光引物。此外，例如能
够以500nm附近的比较长波长的光来激发。
本发明的标记单链核酸作为用于与靶核酸杂交的探针或用于扩增靶核酸的引物
使用。
本发明包含一种靶核酸的检测方法，以本发明的标记单链核酸作为探针，在可以
与靶核酸杂交的条件下，通过测定荧光而求出有无与探针的杂交。可以用于靶核酸的检测
方法的核酸扩增方法具体而言如下。
该核酸扩增方法是扩增核酸试样中的靶核酸序列的方法，包含下述(A)工序和下
述(B')工序。
(A)准备上述核酸试样的工序；
(B')包含下述(B1')工序及(B2')工序的工序；
(B1')使用引物、或包含一对引物的引物对，扩增核酸试样中的靶核酸序列的工
序，
(B2')进行上述(B1')工序中扩增的单链的核酸序列与由本发明的标记单链核酸
构成的探针的杂交的工序。
由上述本发明的标记单链核酸构成的探针例如可以为包含至少一个上述式(16)、
(16b)、(17)、或(17b)所表示的结构的探针。
上述的核酸扩增方法中的引物及引物对没有特别限制，例如可以根据目标靶核酸
序列、核酸扩增反应的种类等而适当设定。此外，本发明中的核酸扩增方法的种类没有特别
限制，可列举出上述那样的SMAP法或LAMP法等各种等温扩增法或PCR法等，可以与上述第一
核酸扩增方法同样地进行。
作为探针使用的本发明的标记单链核酸的碱基序列可以根据靶核酸序列而适当
设计，按照在严格的条件下与上述靶核酸杂交的方式设计。“严格的条件”例如依赖于本发
明的探针与其互补链的双链的熔化温度Tm(℃)、及杂交溶液的盐浓度等而决定。作为具体
例子，可以参照J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition,
Cold Spring Harbor Laboratory(1989)(其全部记载特别地作为公开而援引于此)等。
根据上述的核酸扩增方法，由于将本发明的标记单链核酸作为探针使用，所以例
如仅通过检测核酸扩增反应液的荧光强度，例如能够判断有无靶核酸序列的扩增。这例如
基于以下那样的理由。若探针与互补的核酸序列杂交，则由于形成双链核酸，所以上述标记
引物的原子团(色素)嵌入或沟槽键合于上述双链核酸。此时，由于不产生例如上述那样的
上述原子团(色素)的激子效应，所以上述原子团产生荧光发光。另一方面，在没有杂交的情
况下，由于产生激子效应，所以上述原子团不产生荧光发光。因此，例如在探针没有与通过
核酸扩增反应而得到的扩增产物杂交时、或没有引起扩增时，见不到产生荧光发光的原子
团、或者没有增加。因此，若检测荧光强度，则在增加的情况下，能够判断靶核酸序列扩增，
在未增加的情况下，可以判断靶核酸序列没有扩增。特别是本发明的标记单链核酸具有以
下优点：没有杂交时的荧光背景与使用以往的具有激子效应的标记探针的情况相比，检测
灵敏度变高。
上述标记单链核酸探针例如可以在上述(B1')工序的核酸扩增反应之前添加到反
应液中，也可以在上述(B1')工序的核酸扩增反应之后添加到反应液中。在前者的情况下，
荧光强度的检测例如与上述(B1')工序的核酸扩增反应同时连续地或间歇地进行，也可以
在上述(B1')工序结束后进行。在上述(B1')工序的反应结束后进行的情况下，作为背景，优
选也一并在上述(B1')工序的反应开始前进行检测。另一方面，在分别进行上述(B1')工序
和(B2')工序的情况下，例如优选在上述(B1')工序的核酸扩增反应之后将上述标记单链核
酸探针添加到反应液中。这种情况下，荧光强度的检测例如在(B1')工序之后进行。此时，作
为背景，例如优选一并检测上述(B1')工序之后、且上述标记单链核酸探针的添加前或刚添
加后的荧光强度。检测方法的具体例子如上所述。
(1)本发明中的标记单链核酸探针可以以液相的同源分析(使用96孔微板或毛细
管等)来使用。
(2)本发明的标记单链核酸探针可以作为PCR探针使用。可以作为DNA扩增反应中
的扩增曲线的检测(实时PCR)、代替TaqMan探针的廉价的方法应用。可以作为引物的标记、
或内部标记探针使用。
(3)本发明的标记单链核酸探针可以作为DNA芯片中的捕捉探针或标记探针使用。
为高通量且不需要试剂的系统，不需要标记过程·清洗过程。能够大大地避免人为产生的
误差。能够实现玻璃或代替其的固相载体原材料(金、ITO、铜等基板、金刚石或塑料等能够
贴附多检体的原材料)中的同时多项目(高通量)的解析。
(4)本发明的标记单链核酸探针可以在珠子、纤维、或水凝胶上固定化。能够在半
液体·半固体的环境下检测基因。能够具有液体那样的测定环境，并且像固体那样搬运。
(5)本发明的标记单链核酸探针可以作为印迹(Southern blot、Northern Blot、
dot blot等)用的探针使用。能够使仅目标基因片段发光而进行检测。根据本发明的方法，
在杂交操作之后，不需要清洗。
(6)本发明的标记单链核酸探针可以作为用于细胞内核酸的检测·追踪的探针使
用。由此，能够进行细胞内的DNA/RNA的时空间的解析。可以使用荧光显微镜或细胞分类计。
能够应用于DNA的标记、向RNA的转印·剪接的追踪、RNAi的功能解析等。在本发明的方法
中，由于不需要清洗，所以适于活细胞的功能追踪。
(7)本发明的标记单链核酸探针可以作为荧光原位杂交(FISH)的探针使用。通过
本发明的方法，可以进行组织的染色等。本发明的方法中，由于不需要清洗，所以人为产生
的误差小。即，本发明的标记单链核酸探针由于作为在没有识别靶生物分子时不发出荧光
的荧光色素起作用，所以若使用其，则能够建立不需要复杂的清洗工序的生物成像。这关系
到高可靠性、低劳力且实时的荧光观测。
(8)本发明的标记核酸探针由于能够利用多个波长的色素团，所以在以1分子水平
进行检测·追踪时，能够容易地构筑大大避免这些激发光的背景光、散射光的波长的设计。
例如，在以1分子水平观测生物分子的情况下，变成激发光的泄漏等背景光、散射光扰乱的
状态，避免此的方法成为各种必须。在这样的情况下本发明特别有用。
本发明的标记单链核酸探针的荧光强度例如通过所键合的色素部分的激子相互
作用的控制，能够有效地发生变化。本发明中，特别是根据利用激子相互作用的接近，作为
on-off探针发挥功能，所以能够得到充分高的消光性能。这样的on-off荧光核苷酸的设计
例如对于建立不需要清洗的生物成像分析是非常重要的。利用激子效应的探针所显示的光
物理性质不仅非常具有特征性，而且适合于用于DNA测序(序列确定)、基因分型(基因型解
析)、DNA结构转变的监测及基因表达观测的新型荧光DNA探针的设计。
此外，若将本发明的标记单链核酸作为探针使用，则例如通过对靶核酸序列进行
定量，能够立刻检测该序列的扩增·分解·蛋白键等现象的产生，并且对这些现象量进行
定量。该检测及定量可以通过以下的说明来进行，该说明为例示，并不限定本发明。即，首
先，本发明的探针(核酸)与上述靶核酸序列以一定的物质量比进行杂交，形成双链。由于所
形成的双链的物质量与上述靶核酸序列的物质量成正比例，所以通过测定上述双链的荧光
强度，能够检测靶核酸序列，并且对其物质量进行定量。这种情况下，本发明的标记单链核
酸由于背景的荧光发光进一步得到抑制，所以不会妨碍上述双链的荧光强度测定，能够进
行更准确的测定。
包含一种靶核酸的扩增方法，其包含将本发明的标记单链核酸作为引物使用，将
靶核酸进行扩增。将本发明的标记单链核酸作为引物使用的靶核酸的扩增方法可例示出以
往公知的各种核酸扩增方法，其反应形式没有任何限制。作为上述核酸扩增方法，例如可列
举出等温扩增法、聚合酶链式反应(PCR)法等。上述等温扩增法一般是在等温下进行核酸扩
增反应的方法。作为这样的方法，例如可列举出日本特公平7-114718号公报(其全部记载特
别地作为公开而援引于此)等中公开的链置换型扩增(SDA；strand displacement
amplification)法；美国专利第5824517号说明书(其全部记载特别地作为公开而援引于
此)、国际公开第99/09211号小册子(其全部记载特别地作为公开而援引于此)或国际公开
第95/25180号小册子(其全部记载特别地作为公开而援引于此)等中公开的改良SDA法；日
本专利第2650159号公报(其全部记载特别地作为公开而援引于此)等中公开的核酸序列扩
增(NASBA；nucleic acid sequence based amplification)法；国际公开第00/28082号小
册子(其全部记载特别地作为公开而援引于此)等中公开的环介导等温扩增法(LAMP；Loop-
Mediated Isothermal Amplification)法；国际公开第02/16639号小册子(其全部记载特
别地作为公开而援引于此)等中公开的ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-
initiated Amplification of Nucleic acids)；自主序列复制(3SR；self-
sustainedsequence replication)法；TMA(transcription-mediated amplification，转
录介导扩增)法；日本国专利第2710159号公报(其全部记载特别地作为公开而援引于此)中
公开的Qβ复制酶法；日本国专利第389726号公报(其全部记载特别地作为公开而援引于
此)、日本专利第3942627号公报(其全部记载特别地作为公开而援引于此)及NATURE
METHODS(Vol.4，No.3，March 2007，pp.257-262)(其全部记载特别地作为公开而援引于
此)、Mitani Y.,等2007.,Nat.Methods 4(3)：257-262.(其全部记载特别地作为公开而援
引于此)等中公开的方法(以下，称为“SmartAmp(Smart Amplification Process，智能扩增
检测)法”)、Invader法、RCA(rolling cycle amplification，滚环扩增)法等。
实施例
通过以下的实施例对本发明进一步进行具体说明，但本发明不受以下的实施例的
限定。
[实施例1]
导入了噻唑橙(TO)与噻唑粉(TP)的骨架(日文：足場)的低聚DNA链的合成通过专
利文献2中记载的酰胺法(例如参照实施例2)来进行合成。TO的导入通过在目标位置导入
NHS-Carboxy-dT后立即与TO2二酰胺反应，之后的序列通过以往那样的方法来进行合成。从
CPG的切出及脱保护在28％氨水中，在55℃下用4小时来进行。纯化利用装备有反相(RP-18)
柱的HPLC来进行。
[化学式41]
TO2二酰胺
TO2二酰胺
之后，按照专利文献1中记载的方法(例如参照实施例6(在1分子中导入了两处由
噻唑橙衍生的结构的化合物的合成))，使纯化而得到的核酸与TP-酯在碳酸氢钠缓冲液下
反应，利用装备有反相(RP-18)柱的HPLC进行纯化，得到目标物。
[化学式42]
TP-酯
TP-酯
通过上述方法制备的导入了噻唑橙(TO)和噻唑粉(TP)的低聚DNA链(序列号1(5个
均碱基序列共同))如下。
20-mer.EX16-12TOTP：5'-TGTGZATCtTTCTCTTTCTC-3'
20-mer.EX8-12TOTP：5'-TGTGTATCtTTCZCTTTCTC-3'
20-mer.EX10-12TOTP：5'-TGTGTATCtTZCTCTTTCTC-3'
20-mer.EX14-12TOTP：5'-TGTGTAZCtTTCTCTTTCTC-3'
20-mer.EX18-12TOTP：5'-TGZGTATCtTTCTCTTTCTC-3'
(Z表示TO标记的T，t表示TP标记的T)
[实施例2]
(导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针与以往的具有激子效应的
荧光探针的光谱比较实验)
以噻唑橙的激发波长(490nm)进行激发，进行光谱的测定。光谱测定使用岛津公司
的荧光测定装置(RF5300)来进行。关于浓度，各荧光探针、及互补链(序列号2)均以1μM、在
温度23℃下进行测定。将结果示于图1A～C中。图1A是使用导入了两个具有激子效应的荧光
色素的荧光核酸探针的情况，图1B及C是以往的具有激子效应的荧光探针的光谱。在图1A中
所示的具有两个激子效应的情况下，可以确认由FRET效果产生的噻唑粉的波长(601nm)的
荧光。此时，单链时(背景)与双链时(测定时)的信号强度的比(S/N比)为4.6。在导入了两个
具有激子效应的荧光色素的情况下，测定对象的波长的S/N比为4.6，与一个的情况(图1B：
S/N＝2.1、图1C：S/N＝1.8)相比良好2倍以上。
这表示，在单链的情况下，噻唑橙(533nm)通过激子效应，荧光能量以一定程度失
活，但是通过噻唑粉靠近地存在，受到FRET的效应并接收能量，同时该能量也通过激子效应
而失活。
[实施例3]
导入了两个具有激子效应的荧光色素的荧光核酸探针的熔化曲线解析使用
BioRad公司的实时PCR装置(CFX96)来进行。关于浓度，各荧光探针、及互补链均以1μM、且25
μl的容量来进行测定。一边从4℃到95℃为止以0.5℃刻度进行升温一边进行测定。将结果
示于图2A～E中。图2中所示的结果是噻唑橙的荧光的比较(激发波长：495nm)。噻唑橙与噻
唑粉间的距离适当的情况下通过FRET的效应，噻唑橙的荧光大大降低。
由图2A～E的结果认为，在本实施例中使用的荧光标记单链核酸(DNA)中，关于具
有两个激子效应的荧光色素间的距离，间隔的碱基为3个左右最发挥FRET的效应。获知过近
(间隔的碱基为一个)或过远(间隔的碱基为5个)的情况下，有时FRET的效应变低。为了得到
图2A～E中所示的熔化曲线解析结果而使用的各荧光核酸探针的碱基序列如下。
产业上的可利用性
本发明在利用荧光标记探针或引物的领域是有用的。
序列号1：实施例1中合成的低聚DNA链(20mer)的碱基序列
序列号2：实施例1中合成的低聚DNA链(20mer)的互补链的碱基序列