细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法技术领域
本发明的涉及人参皂甙的生产技术，尤其涉及细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方
法。
背景技术
人参皂甙是人参主要成分，广泛用于食品，保健品，医药，化工等领域。现代医学认
为人参皂甙具有提高人体免疫力，延缓衰老等作用。传统人参皂甙的提取方法是用多年生
人参植物的根、茎、叶、须根等植物体提取所得。随着人参皂甙需求的不断增加，自然生长和
人工种植的人参数量越来越不能满足市场需求。
目前也有细胞悬浮培养法生产人参皂甙，但是纯度不高，产率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，通过诱导人参愈
伤组织细胞增殖、分裂，通过细胞悬浮培养，收集人参组织细胞提取人参皂甙的工业生产方
法，得到的人参皂甙提高了产率和纯度。
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡5-10分钟，然后用
2-4％的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,葡萄糖20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速30-50r/min,温度25℃±2℃,暗培养5-7天；
(4)将三角瓶接种有10-15kg培养基的种子罐中搅拌，转速30-50r/min,温度25℃
±2℃,培养7-10天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,葡萄糖20g/L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度20-25℃，搅拌速率50-80r/
min,通入过滤空气，速率0.02-0.05m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加6-8倍质量的纯化水，80-100℃煎
煮2次，每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸
附树脂，用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.0-
1.05的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡5-10分钟，然后用
2-4％的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖
20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速30-50r/min,温度25℃±2℃,暗培养5-7天；
(4)将三角瓶接种有10-15kg培养基的种子罐中搅拌，转速30-50r/min,温度25℃
±2℃,培养7-10天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/
L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度20-25℃，
搅拌速率50-80r/min,通入过滤空气，速率0.02-0.05m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加6-8倍质量的纯化水，80-100℃煎
煮2次，每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸
附树脂，用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.0-
1.05的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
本发明的优点在于：
1、在细胞悬浮培养的过程中，每个培养基中都加入植物调节剂6-苄氨基嘌呤，保
持MS培养基的活性，提高培养效果；
2、在人参组织细胞采集步骤(2)中的培养液加入酵母葡聚糖作为添加剂，步骤(4)
中种子罐的培养基中添加香茅醇，诱导细胞分裂，提高人参组织细胞采集量；
3、在悬浮培养过程中的培养基中加入槲皮素作为添加剂，能促进人参悬浮培养细
胞的生长，诱导人参皂甙的合成，提高人参皂甙的产率。
4、采用大孔吸附树脂提取分离人参皂甙，较其他提取分离方法，能大大提高人参
皂甙产物的纯度。
具体实施例
实施例1：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡5分钟，然后用2％
的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖
20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速30r/min,温度25℃±2℃,暗培养5天；
(4)将三角瓶接种有10kg培养基的种子罐中搅拌，转速30r/min,温度25℃±2℃,
培养7天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/
L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度20℃，搅拌
速率50r/min,通入过滤空气，速率0.02m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加6倍质量的纯化水，80℃煎煮2次，
每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树脂，
用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.0的
清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
实施例2：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡7分钟，然后用3％
的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖
20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速40r/min,温度25℃±2℃,暗培养6天；
(4)将三角瓶接种有12kg培养基的种子罐中搅拌，转速40r/min,温度25℃±2℃,
培养8天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/
L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度22℃，搅拌
速率70r/min,通入过滤空气，速率0.04m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加7倍质量的纯化水，90℃煎煮2次，
每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树脂，
用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.02
的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
实施例3：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡10分钟，然后用
4％的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖
20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速50r/min,温度25℃±2℃,暗培养7天；
(4)将三角瓶接种有15kg培养基的种子罐中搅拌，转速50r/min,温度25℃±2℃,
培养10天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/
L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度25℃，搅拌
速率80r/min,通入过滤空气，速率0.05m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加8倍质量的纯化水，100℃煎煮2次，
每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树脂，
用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.05
的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
实施例4：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡5分钟，然后用2％
的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,葡萄糖20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速30r/min,温度25℃±2℃,暗培养5天；
(4)将三角瓶接种有10kg培养基的种子罐中搅拌，转速30-50r/min,温度25℃±2
℃,培养7天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,葡萄糖20g/L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度20℃，搅拌速率50r/min,通
入过滤空气，速率0.02m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加6倍质量的纯化水，80℃煎煮2次，
每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树脂，
用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.0的
清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
对比例1：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡3分钟，然后用5％
的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖
20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速60r/min,温度25℃±2℃,暗培养4天；
(4)将三角瓶接种有18kg培养基的种子罐中搅拌，转速20r/min,温度25℃±2℃,
培养6天；
培养基成分：MS培养基10g/L,6-苄氨基嘌呤1mg/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/
L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,6-苄氨基嘌呤1.5mg/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度18℃，搅拌
速率90r/min,通入过滤空气，速率0.07m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加5倍质量的纯化水，70℃煎煮2次，
每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树脂，
用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.08
的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
对比例2：
细胞悬浮培养法生产人参皂甙的方法，具体步骤为：
一、人参组织细胞采集
(1)取生长3年以上新鲜的人参根和须，洗净，先用75％乙醇浸泡10分钟，然后用
2％的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，用无菌水清洗至次氯酸钠无残留；
(2)将清洗消毒后的人参根须切块，放入打浆机中，加入培养液，每克人参块加
20ml培养液，打浆；
培养液成分：MS培养基10g/L,酵母葡聚糖0.8mg/L,葡萄糖20g/L；
(3)打浆后60目过滤，收集滤液，滤液加入至250ml三角瓶中，每瓶100-150ml，把三
角瓶放在摇床培养，转速50r/min,温度25℃±2℃,暗培养5天；
(4)将三角瓶接种有15kg培养基的种子罐中搅拌，转速30r/min,温度25℃±2℃,
培养8天；
培养基成分：MS培养基10g/L,香茅醇0.55mg/L,葡萄糖20g/L，ph 5.5-6.5；
二、悬浮培养
将种子罐的种子液接种多功能生物培养罐，接种量1：30，培养液成分：MS培养基
20g/L,槲皮素0.6mg/L,，葡萄糖30g/L，ph 5.5-6.5，温度20℃，搅拌速率80r/min,通入过滤
空气，速率0.03m3/s，培养20天；
三、人参组织细胞收集；
将细胞培养液通过离心机收集培养好的组织细胞，烘干粉碎得到人参组织细胞干
粉，备用；
四、提取人参皂甙；
(1)将人参组织细胞干粉加入多功能提取罐，加6-8倍质量的纯化水，90℃煎煮2
次，每次1.5小时，合并煎煮液80目过滤，滤液放置沉降24小时，取上清液过D101大孔吸附树
脂，用水洗脱至无色，上清液和D101大孔吸附树脂的体积比为2:1；
(2)再用3BV的60％乙醇洗脱，洗脱液加入浓缩罐回收乙醇，浓缩至相对密度1.05
的清膏，真空干燥至水分2.5-3.5％的干膏，粉碎，即得人参总皂甙粉。
对比例3：
申请号为：201210127745.5的专利中的权利要求1：
细胞培养法生产人参皂甙及多糖的方法，其特征在于，是一种利用多年生人参的
根细胞培养，利用酶技术缩短细胞培养周期，来生产人参皂甙及多糖的方法，具体流程为：
(1)种子细胞采集：
①取新鲜的多年生人参的根清洗消毒，将洗净的人参块根用10-20％次氯酸钠溶
液浸泡10-30分钟，用无菌水清洗块根至次氯酸钠无残留；
②将清洁后的块根放入打浆机加入MS培养基，每1.5g加入10ml，打浆；
③将打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3-5小时，用50-80微米孔径的微孔滤器
过滤，滤液用低速离心机分离，去杂质及上清液，收集种子细胞；
(2)种子细胞培养：
①将收集到的种子细胞接种到含改良MS培养基的种子罐中，接种量为10-20g/L，
调pH5-6，温度20-25℃；
②摇床或震荡种子罐培养20-30小时，计算细胞数量20000-40000个/ml；
(3)细胞扩大培养：
①将培养好的种子细胞接种于有机械搅拌的生物反应器内，悬浮培养，培养基用
改良的MS培养基，接种量为15-25g/L，搅拌速率90-120r/min，pH 5-6，通入过滤空气，速率
0.01-0.05m3/s；
②加入生长素2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1mg/L，果胶酶50-80mg/L，暗培养20-25天，
细胞计数35000-50000/ml即停止培养；
(4)提取人参总皂甙：
①称取细胞培养出的人参细胞组织，40目磨碎过筛，取15克，加甲醇300ml于索氏
提取器加热回流8小时换取溶剂一次，共提3次，合并提取液，于旋转蒸发器中减压蒸去甲醇
至浅黄色浸膏状，浸膏残留物加50ml水溶解，溶解液移入分液漏斗，每次用30ml乙醚脱脂，
共8次，弃醚底，水层用50ml饱和水正丁醇萃取8次，合并正丁醇提取液，减压回收正丁醇至
干，得浅黄色粉末为粗人参总皂甙；
②取上述提取的粗皂甙分别加1～2ml甲醇溶解，将甲醇溶液缓慢逐渐滴入20ml丙
酮溶液，剧烈搅拌，皂甙以白色絮状沉淀析出，离心，80℃鼓风干燥后，置于干燥器内干燥2
天称重，得精制人参总皂甙。
表1各个实施例及对比例制得的人参皂甙的产率及纯度
从上表数据可以看出，本发明得到的人参皂苷(实施例1-3)的的产率及纯度都高
于实施例4(培养基中未加添加剂)、对比例1(工艺参数不同)、对比例2(培养基中未添加6-
苄氨基嘌呤)、对比例3(其他细胞悬浮培养法)，尤其是以实施例2的效果最佳，可见本发明
在培养基中加入入植物调节剂6-苄氨基嘌呤，再添加酵母葡聚糖、香茅醇、槲皮素作为添加
剂，采用一定的工艺参数，协同作用，得到的产率和纯度高的人参皂苷。