miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法技术领域
本发明涉及生物领域，具体地说是一种miR-21在调控CML干细胞
对格列卫原发性耐药的研究方法。
背景技术
慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)是一种
起源于多能造血干细胞并严重威胁人类健康的恶性增殖性疾病，占我
国慢性白血病的90％以上，在所有的急、慢性白血病中约占18％左
右，居白血病的第三位。CML起病缓慢，约75％～85％的慢粒患者在1～
5年由稳定期转入急变期。一旦急变后，半数以上病例在3个月内死
亡，仅个别病例生存期能超过1年。目前唯一能根治CML的方法是异
基因造血干细胞移植，但因供者来源有限、医疗费用高等因素最终只
有不到20％患者能够进行异基因造血干细胞移植。由于超过90％的病
人在确诊为CML时均处于慢性期，因此，针对慢性期的治疗对于控制
病情恶化和延长患者寿命极其重要。格列卫是目前治疗慢性期CML的
特效药，然而，格列卫尽管有效却依然无法治愈CML，患者必须长期
服药以控制病情，给患者造成沉重的经济负担。越来越多的研究已经
显示，白血病干细胞对格列卫原发性耐药是格列卫无法根治CML的根
本原因，因此，阐明白血病干细胞对格列卫原发性耐药的分子机制将
为制定根除白血病干细胞进而根治CML的治疗策提供重要的参考资料
和科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发
性耐药的研究方法。
本发明的miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方
法，包括以下步骤：
(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达
研究
①HSC和LSC的分离、分选和鉴定：通过骨髓穿刺获得健康人和CML
病人骨髓血(5-10ml)，用含500U/ml肝素的生理盐水抗凝。采用
Percoll非连续密度梯度离心法从骨髓血分离单形核细胞，然后用
流式细胞仪分选出LSC(Lin-CD34+CD38-)细胞。纯化的LSC通过双
色双融合荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因。
②miRNAs在HSC和LSC中的表达分析与鉴定：采用Ambion公司的
mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取纯化的HSC和LSC的小分子RNA，
反转录后通过基于TaqMan探针定量PCR的方法对上述两组样品的
324个成熟miRNA进行了检测。以RNU48为内参计算各个miRNA的
相对表达量，再将五名CML病人的miRNA相对表达量与五名健康人
对应miRNA的平均相对表达量进行比较(≥3名病人的miRNA表达
水平上调或下调5倍以上被定义为表达发生明显变化)，鉴定在LSC
中表达明显上调或下调的miRNAs。
(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用
①构建miR-21抑制剂表达载体及检测其抑制效率和时效：根据成
熟miR-21分子的序列构建基于逆转录病毒的miR-21抑制剂表达载
体(MSCV-miR-21-inhibitor)。用MSCV-miR-21-inhibitor转染
LSC不同时间，然后通过定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21的表达水
平，与MSCV-control转染组(对照组)相比较，评价
MSCV-miR-21-inhibitor对miR-21的抑制效率和时效。
②抑制miR-21对IM抑制LSC和HSC克隆形成以及诱导其凋亡的影
响：将MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC和
HSC一定时间后(根据上述时效检测结果)，然后用终浓度为5μM
的IM(此浓度为CML病人在IM用药后体内血浆的峰值和体外有效
抑制BCR-ABL激酶活性的浓度)处理不同时间，处理完成后分别进
行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，
评价miR-21抑制剂和IM联合作用于LSC的特异性。
③抑制LSC的miR-21表达对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：
应用NOD/SCID小鼠建立人白血病移植瘤模型(NOD/SCID小鼠既
缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更
严重的动物模型，异种移植物更易在其身上移植成功。)选取6至
8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成四组：LSC，LSC+IM，LSC(转染
MSCV-control)+IM，LSC(转染MSCV-miR-21-inhibitor)+IM。
移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过
尾静脉将转染和未转染的LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入
小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM治疗(200mg/kg/d)，
连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式
细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋
亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸
润情况。
(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究
①检测HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6
的磷酸化水平：首先将新鲜分离的HSC和LSC进行固定，然后分别
与PTEN和PDCD4蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免
疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察HSC和LSC中PTEN
和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价HSC
和LSC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化情况。
②抑制miR-21表达对PTEN蛋白表达以及AKT和S6磷酸化水平的
影响：用MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC
不同时间后(根据上述时效检测结果)，将LSC进行固定，然后分
别与PTEN蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光
染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平
以及AKT和S6的磷酸化水平，评价抑制miR-21表达对
PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。
③过表达PTEN对AKT和S6磷酸化水平的影响以及对IM抑制LSC
克隆形成和诱导LSC凋亡的影响：根据PTEN基因的序列构建基于逆
转录病毒的PTEN表达载体(MSCV-PTEN)。用MSCV-PTEN转染LSC
不同时间后通过Western blot检测PTEN的表达水平，与MSCV转染
组(对照组)相比较，评价MSCV-PTEN的表达效率和时效。用MSCV
或MSCV-PTEN分别转染LSC一定时间后(根据时效检测结果)进行
以下实验：(1)将LSC进行固定，然后分别与AKT和S6的磷酸化
抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC
中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价过表达
PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。(2)加入终浓度为5μM
的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目
统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况。
④阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM抑制LSC和HSC克隆形成和
诱导其细胞凋亡的影响：不同浓度的PI3K特异性抑制剂(LY294002：
1，5和10μM和雷帕霉素：0.02，0.1和0.5μM)预处理LSC两
小时，然后加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处
理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测
细胞凋亡情况，评价PI3K和mTOR抑制剂与IM联合作用于LSC的特
异性。
⑤阻断LSC的PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM治疗人白血病移植瘤
模型的作用：选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成6组：LSC，
LSC+IM(200mg/kg/d)，LSC+Wortmannin(2mg/kg/d)，LSC+雷
帕霉素(4mg/kg/d)，LSC+Wortmannin+IM，LSC+雷帕霉素+IM。
移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过
尾静脉将LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个
月后以尾静脉注射的方式进行IM、Wortmannin和雷帕霉素单独或联
合治疗，连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，
通过流式细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞
数及其凋亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC
的组织浸润情况。
本发明的研究方法通过比较miRNAs在正常造血干细胞和LSC中的
表达，鉴定在LSC中发生明显表达变化的miRNAs，深入研究其调控LSC
对格列卫原发性耐药过程中的作用及其分子调控机制调控机制，为解
决LSC对格列卫原发性耐药发现潜在的作用靶点。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步具体描述，但本发明的实施方
式不限于此。
miR-21在调控CML干细胞对格列卫原发性耐药的研究方法，包括
以下步骤：
(1)miRNAs在健康人HSC和慢性期CML病人LSC中的差异表达
研究
①HSC和LSC的分离、分选和鉴定：通过骨髓穿刺获得健康人和CML
病人骨髓血(5-10ml)，用含500U/ml肝素的生理盐水抗凝。采用
Percoll非连续密度梯度离心法从骨髓血分离单形核细胞，然后用
流式细胞仪分选出LSC(Lin-CD34+CD38-)细胞。纯化的LSC通过双
色双融合荧光原位杂交方法检测BCR-ABL融合基因。
②miRNAs在HSC和LSC中的表达分析与鉴定：采用Ambion公司的
mirVanaTM miRNA Isolation Kit提取纯化的HSC和LSC的小分子RNA，
反转录后通过基于TaqMan探针定量PCR的方法对上述两组样品的
324个成熟miRNA进行了检测。以RNU48为内参计算各个miRNA的
相对表达量，再将五名CML病人的miRNA相对表达量与五名健康人
对应miRNA的平均相对表达量进行比较(≥3名病人的miRNA表达
水平上调或下调5倍以上被定义为表达发生明显变化)，鉴定在LSC
中表达明显上调或下调的miRNAs。
(2)miR-21在调控LSC对IM原发性耐药中的作用
①构建miR-21抑制剂表达载体及检测其抑制效率和时效：根据成
熟miR-21分子的序列构建基于逆转录病毒的miR-21抑制剂表达载
体(MSCV-miR-21-inhibitor)。用MSCV-miR-21-inhibitor转染
LSC不同时间，然后通过定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21的表达水
平，与MSCV-control转染组(对照组)相比较，评价
MSCV-miR-21-inhibitor对miR-21的抑制效率和时效。
②抑制miR-21对IM抑制LSC和HSC克隆形成以及诱导其凋亡的影
响：将MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC和
HSC一定时间后(根据上述时效检测结果)，然后用终浓度为5μM
的IM(此浓度为CML病人在IM用药后体内血浆的峰值和体外有效
抑制BCR-ABL激酶活性的浓度)处理不同时间，处理完成后分别进
行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况，
评价miR-21抑制剂和IM联合作用于LSC的特异性。
③抑制LSC的miR-21表达对IM治疗人白血病移植瘤模型的作用：
应用NOD/SCID小鼠建立人白血病移植瘤模型(NOD/SCID小鼠既
缺乏T和B淋巴细胞功能，又有先天免疫缺陷，是一种免疫缺陷更
严重的动物模型，异种移植物更易在其身上移植成功。)选取6至
8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成四组：LSC，LSC+IM，LSC(转染
MSCV-control)+IM，LSC(转染MSCV-miR-21-inhibitor)+IM。
移植前对NOD/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过
尾静脉将转染和未转染的LSC(1×106cells/只小鼠)分别注射入
小鼠。移植1个月后以尾静脉注射的方式进行IM治疗(200mg/kg/d)，
连续治疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式
细胞仪检测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋
亡情况。另外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸
润情况。
(3)miR-21调控LSC对IM原发性耐药的分子机制研究
①检测HSC和LSC中PTEN和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6
的磷酸化水平：首先将新鲜分离的HSC和LSC进行固定，然后分别
与PTEN和PDCD4蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免
疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察HSC和LSC中PTEN
和PDCD4蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价HSC
和LSC中PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化情况。
②抑制miR-21表达对PTEN蛋白表达以及AKT和S6磷酸化水平的
影响：用MSCV-control或MSCV-miR-21-inhibitor分别转染LSC
不同时间后(根据上述时效检测结果)，将LSC进行固定，然后分
别与PTEN蛋白抗体以及AKT和S6的磷酸化抗体孵育进行免疫荧光
染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC中PTEN蛋白的表达水平
以及AKT和S6的磷酸化水平，评价抑制miR-21表达对
PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。
③过表达PTEN对AKT和S6磷酸化水平的影响以及对IM抑制LSC
克隆形成和诱导LSC凋亡的影响：根据PTEN基因的序列构建基于逆
转录病毒的PTEN表达载体(MSCV-PTEN)。用MSCV-PTEN转染LSC
不同时间后通过Western blot检测PTEN的表达水平，与MSCV转染
组(对照组)相比较，评价MSCV-PTEN的表达效率和时效。用MSCV
或MSCV-PTEN分别转染LSC一定时间后(根据时效检测结果)进行
以下实验：(1)将LSC进行固定，然后分别与AKT和S6的磷酸化
抗体孵育进行免疫荧光染色，最后通过激光共聚焦显微镜观察LSC
中PTEN蛋白的表达水平以及AKT和S6的磷酸化水平，评价过表达
PTEN对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。(2)加入终浓度为5μM
的IM或对照溶剂处理不同时间，处理完成后分别进行克隆形成数目
统计及Annexin-PE/7AAD双染检测细胞凋亡情况。
④阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM抑制LSC和HSC克隆形成和
诱导其细胞凋亡的影响：不同浓度的PI3K特异性抑制剂(LY294002：
1，5和10μM和雷帕霉素：0.02，0.1和0.5μM)预处理LSC两
小时，然后加入终浓度为5μM的IM或对照溶剂处理不同时间，处
理完成后分别进行克隆形成数目统计及Annexin-PE/7AAD双染检测
细胞凋亡情况，评价PI3K和mTOR抑制剂与IM联合作用于LSC的特
异性。
⑤阻断LSC的PI3K/AKT/mTOR信号通路对IM治疗人白血病移植瘤模
型的作用：选取6至8周龄的NOD/SCID雌鼠，分成6组：LSC，LSC+IM
(200mg/kg/d)，LSC+Wortmannin(2mg/kg/d)，LSC+雷帕霉素(4
mg/kg/d)，LSC+Wortmannin+IM，LSC+雷帕霉素+IM。移植前对NOD
/SCID小鼠全身照射钴60(300cGy)，24小时后通过尾静脉将LSC
(1×106cells/只小鼠)分别注射入小鼠。移植1个月后以尾静脉注
射的方式进行IM、Wortmannin和雷帕霉素单独或联合治疗，连续治
疗4周或8周后将小鼠处死，取外周血和骨髓血，通过流式细胞仪检
测外周血中人CD45+细胞数和骨髓中人CD34+细胞数及其凋亡情况。另
外，取肝、脾和肺组织进行HE染色，检测LSC的组织浸润情况。