荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体免疫层析试剂盒技术领域
本发明属于动物医学检验领域，涉及一种荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体免疫层
析试剂盒。
背景技术
猪瘟是我国养猪业的一种重要传染病，属于一类动物疫病，给我国的养猪业带来
的危害非常严重。每年给我国造成的经济损失近100亿元，是造成我国养猪业经济损失最大
的疾病。由于其在全球范围内的危害性与广泛性，世界各国学者进行了大量研究，以求建立
一种快速、准确、高灵敏度、易操作且能够定量的猪瘟病毒中和抗体检测技术。
常见的相关检测技术有：病毒分离及鉴定，鸡新城疫病毒强化试验，猪瘟兔体免疫
交互实验，免疫荧光抗体实验，免疫胶体金技术，正向间接血凝试验，中和试验，酶联免疫吸
附试验(ELISA)，反转录-聚合酶链反应，荧光定量PCR技术，基因芯片技术。现有这些检测技
术需要专业的实验室操作人员，中国现有的养殖规模布局中难以普及应用，免疫胶体金技
术虽然简单快捷，但其无法定量，不能有效的指导养猪生产。为了突破现有检测技术的普及
瓶颈，赛孚生物发明提供了一种荧光定量检测猪瘟抗体免疫层析试剂盒。
发明内容
本发明的目的是突破现有检测技术的普及瓶颈，提供一种荧光定量检测猪瘟病毒
中和抗体免疫层析试剂盒。本发明的试剂盒检测特异性强，灵敏度高，检测速度快，可实现
准确的定量检测。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，包括单层试纸条和卡壳
构成，所述的卡壳由卡壳上盖和卡壳下盖扣合构成，在卡壳上盖上开设有加样孔和显示窗，
所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的显示窗位于检测垫的正上方，显示窗的尺寸与检
测垫的尺寸相同；所述的试纸条由样品垫、标记物垫、检测垫、吸水纸顺次搭接粘贴在聚乙
烯塑料底板上构成，且在检测垫上设置有一条检测带；所述的标记物垫上含有偶联猪瘟病
毒E2蛋白的荧光免疫微球；所述的检测带上包被有猪瘟病毒E2蛋白抗原。
进一步，所述偶联猪瘟病毒E2蛋白的荧光免疫微球为100～300nm的羧基修饰微
球，所述的样品垫的材质为玻璃纤维、标记物垫的基材为聚酯纤维，检测垫的材质为硝酸纤
维素包被膜，卡壳上盖和卡壳下盖的材质为塑料。
进一步，所述的荧光微球的激发波长Ex为365nm，发射波长Em为620nm。
进一步，所述的检测带包被有浓度为0.5mg/ml、用量为1μl/cm的猪瘟病毒E2蛋白
抗原。
本发明也公开了一种荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的制备
方法，包括如下步骤：
(1)微球活化
1.a.取100～200μL荧光免疫微球至1.5mL离心管中，用等体积pH＝5、浓度为
25mMol/l的吗啉乙磺酸溶液离心洗涤1～2次，移除上清液；
1.b.用去离子水分别配制50mg/mL的碳二亚胺(EDC)溶液和50mg/mL N-羟基琥珀
酰亚胺(NHS)溶液；
1.c.向经步骤1.a处理过的荧光免疫微球中加入10～50μL EDC溶液和10～50μL
NHS溶液，置于混匀仪上保持微球悬浮，室温活化30～60min，离心洗涤，移除上清液，加入
100μL、pH＝5、浓度为25mMol/L的MES溶液，重新洗涤1～2次，加入100μL MES溶液超声分散
30-60s；
(2)微球与抗原偶联：将猪瘟病毒E2蛋白以500μg/ml的量与步骤1.c活化的荧光免
疫微球混合，在旋转混合器上，室温反应3-12h，加入浓度为0.05Mol/L、含有1％(w/v)牛血
清白蛋白(BSA)的PBS溶液100μL，置于混匀仪上保持微球悬浮，密封，反应30min；微球用浓
度为0.05Mol/L、含有1％(w/v)BSA的PBS溶液离心洗涤3～5次，移除上清液；加入浓度为
0.05Mol/L、含0.02％(w/v)叠氮化钠NaN3和1％(w/v)BSA的PBS溶液100μl作为保存液，在4
℃下保存、备用；
(3)将步骤(2)制备好的偶联猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球用PH＝9.0、含0.5％
酪蛋白和0.1％吐温20的碳酸盐缓冲液稀释20-40倍，用喷金机以3～5μl/cm的喷量喷至标
记物垫(2)上，干燥6-12h，形成标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)；
(4)将猪瘟病毒E2蛋白用MES稀释成0.5mg/ml，用划膜机以1μl/cm的量划至检测垫
(3)上，形成一条检测带(4)，将带有检测带(4)的检测垫(3)在37℃干燥2-8h；
(5)将样品垫(1)、标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)、检测垫
(3)及吸水纸(5)顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板(6)上，用裁条机剪裁后，与卡壳组装、备
用。
进一步，步骤1.c中，当1.a中荧光免疫微球的用量为100μL时，EDC溶液和NHS溶液
的加入量的最优值均为20μL。
本发明也公开了一种荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的检测
方法，采集猪静脉血，离心分离血清5min,转速为4000r/min；用0.05Mol/L的PBS溶液稀释15
倍后，取80μL加至荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的加样孔中；待层析
反应15min后，用动物疫病免疫荧光定量检测仪，检测荧光强度，读取检测结果。
本发明的检测原理是：双抗原夹心法，将荧光免疫微球与猪瘟病毒E2蛋白偶联，当
此免疫微球偶联猪瘟病毒E2蛋白抗原与检测样本中的猪瘟病毒中和抗体形成复合物，该复
合物在层析作用下移动至包被膜的检测区，在包被膜的检测区包被有与猪瘟病毒中和抗体
结合的猪瘟病毒E2蛋白抗原，该抗体结合在抗原的另一表位上，形成双抗原夹心的复合物。
利用荧光定量光谱监测系统，由光源激发包被膜上检测区处聚积的荧光微球，荧光胶乳发
射出的荧光被相应的检测系统接收，通过光电变换将光信号转化成电信号，并由自动控制
系统将信号输出，显示出最终的定量结果。
与现有技术相比较，本发明具有如下创新点：
(1)本发明所述的猪瘟病毒中和抗体荧光定量检测试剂盒与RT-PCR方法、ELISA方
法相比，具有操作简便、适合不同数量样本检测且检测速度快(15min左右即可有结果)的优
点；与胶体金免疫层析试纸条相比，本发明具有灵敏度更高、线性范围更宽，且可实现定量
检测等优点。
(2)本发明所述的猪瘟病毒中和抗体荧光定量检测试剂盒，采用荧光微球预先标
记至标记物垫上，随着加样与样本共同被层析至待检区的方法，该方法使反应与信号释放
更加均一，与其他层析法相比，其批量生产的精密度和准确度达到最好效果。配合相应的荧
光定量检测仪，仅需15min即可对猪瘟病毒中和抗体做出灵敏的定量检测结果输出。
附图说明：
图1是本发明所述的试纸条的结构示意图；图中，1.样品垫；2.标记物垫；3.检测
垫；4.检测带；5.吸水垫；6.聚乙烯塑料底板；
图2是本发明所述的荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体层析试剂盒的结构展开示意
图；图中，7.加样孔；8.显示窗；9.试纸条卡槽；10.卡壳上盖；11.试纸条；12.卡槽下盖。
具体实施方式
实施例1试剂盒
一种荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒，其结构如图1和图2所
示，包括单层试纸条11和卡壳构成，所述的卡壳由卡壳上盖10和卡壳下盖12扣合构成，在卡
壳上盖10上开设有加样孔7和显示窗8，所述的加样孔7位于样品垫1的上方，所述的显示窗8
位于检测垫3的正上方，显示窗8的尺寸与检测垫3的尺寸相同；所述的试纸条11由样品垫1、
标记物垫2、检测垫3、吸水纸5顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板6上构成，且在检测垫3上设
置有检测带4；所述的标记物垫2上含有偶联猪瘟病毒E2蛋白的荧光免疫微球；所述的检测
带(4)上包被有猪瘟病毒E2蛋白抗原。
进一步，所述偶联猪瘟病毒E2蛋白的荧光免疫微球为100～300nm的羧基修饰微
球，所述的样品垫的材质为玻璃纤维、标记物垫的基材为聚酯纤维，检测垫的材质为硝酸纤
维素包被膜，卡壳上盖和卡壳下盖的材质为塑料。
进一步，所需荧光微球的激发波长(Ex)为365nm，发射波长(Em)为620nm。
进一步，设置在检测垫(3)上的检测带(4)上包被有浓度为0.5mg/ml，用量为1μl/
cm的猪瘟病毒E2蛋白抗原。
实施例2：制备方法
制备荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒所采用的原料来源如下：
玻璃纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、棉浆板、PVC膜均购自上海金标生物科技有限
公司；卡壳购自沧州盛丰塑胶制品有限公司；荧光免疫微球购自南京微测生物科技有限公
司。
荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)微球活化
1.a.取200μL、尺寸在100nm荧光免疫微球至1.5mL离心管中，用等体积pH＝5、浓度
为25mMol/l的吗啉乙磺酸溶液离心洗涤1次，移除上清液；
1.b.用去离子水分别配制50mg/mL的EDC溶液和50mg/mL的NHS溶液；
1.c.向经步骤1.a处理过的荧光免疫微球中加入10μL EDC溶液和10μL NHS溶液，
置于混匀仪上保持微球悬浮，室温活化30min，离心洗涤，移除上清液，加入100μL、pH＝5、浓
度为25mMol/L的MES溶液，重新洗涤2次，加入100μL MES溶液超声分散30s；
(2)微球与抗原偶联：将猪瘟病毒E2蛋白以500μg/ml的量与步骤1.c活化的荧光免
疫微球混合，在旋转混合器上，室温反应3h，加入浓度为0.05mol/l、含有1％(w/v)BSA的PBS
溶液100μL，置于混匀仪上保持微球悬浮，密封，反应30min；微球用浓度为0.05mol/l、含有
1％(w/v)BSA的PBS溶液离心洗涤3次，移除上清液；加入浓度为0.05mol/l、含0.02％(w/v)
叠氮化钠NaN3和1％(w/v)BSA的PBS溶液200μL作为保存液，在4℃下保存、备用；
(3)将步骤(2)制备好的偶联猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球用PH＝9.0、含0.5％
酪蛋白和0.1％吐温20的碳酸盐缓冲液稀释20倍，用喷金机以5μl/cm的喷量喷至标记物垫
(2)上，干燥6h，形成标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)；
(4)将猪瘟病毒E2蛋白用MES稀释成1mg/ml，用划膜机以1μl/cm的量划至检测垫
(3)上，形成一条检测带(4)，将带有检测带(4)的检测垫(3)在37℃温度条件下干燥2h；
(5)将样品垫(1)、标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)、检测垫
(3)及吸水纸(5)顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板(6)上，用裁条机剪裁后，与卡壳组装、备
用。
实施例3：制备方法
制备荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒所采用的原料来源如下：
玻璃纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、棉浆板、PVC膜均购自上海金标生物科技有限
公司；卡壳购自沧州盛丰塑胶制品有限公司；荧光免疫微球购自南京微测生物科技有限公
司。
荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)微球活化
1.a.取100μL、尺寸在200nm的羧基修饰荧光免疫微球至1.5mL离心管中，用等体积
pH＝5、浓度为25mMol/l的吗啉乙磺酸溶液离心洗涤2次，移除上清液；
1.b.用去离子水分别配制50mg/mL的EDC溶液和50mg/mL的NHS溶液；
1.c.向经步骤1.a处理过的荧光免疫微球中加入20μL EDC溶液和20μL NHS溶液，
置于混匀仪上保持微球悬浮，室温活化60min，离心洗涤，移除上清液，加入100μL、pH＝5、浓
度为25mMol/L的MES溶液，重新洗涤1次，加入100μL MES溶液超声分散60s；
(2)微球与抗原偶联：将猪瘟病毒E2蛋白以500μg/ml的量与步骤1.c活化的荧光免
疫微球混合，在旋转混合器上，室温反应6h，加入浓度为0.05mol/l、含有1％(w/v)BSA的PBS
溶液100μL，置于混匀仪上保持微球悬浮，密封，反应30min；微球用浓度为0.05Mol/L、含有
1％(w/v)BSA的PBS溶液离心洗涤4次，移除上清液；加入浓度为0.05mol/l、含0.02％(w/v)
叠氮化钠NaN3和1％(w/v)BSA的PBS溶液100μL作为保存液，在4℃下保存、备用；
(3)将步骤(2)制备好的偶联猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球用PH＝9.0、含0.5％
酪蛋白和0.1％吐温20的碳酸盐缓冲液稀释30倍，用喷金机以3μl/cm的喷量喷至标记物垫
(2)上，干燥8h，形成标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)；
(4)将猪瘟病毒E2蛋白用MES稀释成0.5mg/ml，用划膜机以1μl/cm的量划至检测垫
(3)上，形成一条检测带(4)，将带有检测带(4)的检测垫(3)在37℃下干燥6h；
(5)将样品垫(1)、标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)、检测垫
(3)及吸水纸(5)顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板(6)上，用裁条机剪裁后，与卡壳组装、备
用。
实施例4：制备方法
制备荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒所采用的原料来源如下：
玻璃纤维、聚酯纤维、硝酸纤维素膜、棉浆板、PVC膜均购自上海金标生物科技有限
公司；卡壳购自沧州盛丰塑胶制品有限公司；荧光免疫微球购自南京微测生物科技有限公
司。
荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)微球活化
1.a.取100μL、尺寸在300nm的荧光免疫微球至1.5mL离心管中，用等体积pH＝5、浓
度为25mMol/l的吗啉乙磺酸溶液离心洗涤2次，移除上清液；
1.b.用去离子水分别配制50mg/mL的EDC溶液和50mg/mL的NHS溶液；
1.c.向经步骤1.a处理过的荧光免疫微球中加入50μL EDC溶液和50μL NHS溶液，
置于混匀仪上保持微球悬浮，室温活化45min，离心洗涤，移除上清液，加入100μL、pH＝5、质
量浓度为25mMol/L MES溶液，重新洗涤2次，加入100μL MES溶液超声分散45s；
(2)微球与抗原偶联：将猪瘟病毒E2蛋白以500μg/ml的量与步骤1.c活化的荧光免
疫微球混合，在旋转混合器上，室温反应12h，加入浓度为0.05mol/l、含有1％(w/v)BSA的
PBS溶液100μL，置于混匀仪上保持微球悬浮，密封，反应30min；微球用浓度为0.05mol/L、含
有1％(w/v)BSA的PBS溶液离心洗涤5次，移除上清液；加入浓度为0.05mol/L、含0.02％(w/
v)叠氮化钠NaN3和1％(w/v)BSA的PBS溶液100μL作为保存液，在4℃下保存、备用；
(3)将步骤(2)制备好的偶联猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球用PH＝9.0、含0.5％
酪蛋白和0.1％吐温20的碳酸盐缓冲液稀释40倍，用喷金机以3μl/cm的喷量喷至标记物垫
(2)上，干燥12h，形成标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)；
(4)将猪瘟病毒E2蛋白用MES稀释成0.5mg/ml，用划膜机以1μl/cm的量划至检测垫
(3)上，形成一条检测带(4)，将带有检测带(4)的检测垫(3)在37℃下干燥8h；
(5)将样品垫(1)、标记有猪瘟病毒E2蛋白的免疫荧光微球的标记物垫(2)、检测垫
(3)及吸水纸(5)顺次搭接粘贴在聚乙烯塑料底板(6)上，用裁条机剪裁后，与卡壳组装、备
用。
实施例5：检测猪瘟阳性国家参考品
采用实施例3制备的荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒作为检测
试剂盒。本试剂盒需与郑州赛孚生物工程有限公司自主研制的动物疫病免疫荧光定量检测
仪(型号：SF-100A型)配套使用；在荧光定量检测仪中储备有试剂定标曲线，该定标曲线以
高免血清(企业自制)为标准品，以标准品制备浓度分别为25SFU、50SFU、100SFU、200SFU、
500SFU、1000SFU的标准管，以每个标准管检测的荧光强度信号值为纵坐标、以荧光计算浓
度的半对数为横坐标的拟合曲线，该定标曲线可以与本发明涉及的荧光定量检测猪瘟病毒
中和抗体免疫层析试剂盒检测到的数值联用，定量确定抗体浓度。(本发明所述的猪瘟病毒
中和抗体免疫层析检测试剂盒，在实际应用中，可在卡壳外表面涂覆可供荧光仪扫描识别
的产品信息喷码，经荧光定量检测仪扫描后写入ID芯片中。)
本实施例中，将猪瘟阳性血清国家参考品(兔体中和试验；产品编号：S07500-3；规
格：1ml；含量：中和效价为1:847±1)(购自中国兽医药品监察所)。该参考品经猪瘟抗体检
测试剂盒(酶联免疫法)(来源于郑州赛孚生物工程有限公司)检测，OD值为0.68。将该参考
品分别作1:15、1:30、1:60稀释，用郑州赛孚生物工程有限公司自主研制的动物疫病免疫荧
光定量检测仪检测荧光强度，读取检测结果如表1所示。
表1猪瘟阳性血清国家参考品不同比例抗体浓度检测结果
稀释比例
1：15
1：30
1：60
抗体浓度(SFU)
218
116
63
对比检测不同稀释比例的猪瘟阳性血清的抗体值可知，本实施例所建立的定标曲
线能够检测出已确定的猪瘟阳性血清，且随着稀释比例的增加，其检测抗体浓度逐渐降低，
说明本试剂盒检测的抗体为猪瘟病毒中和抗体，检测结果与实际相符，具有实际使用意义。
实施例6：检测不同阶段猪体内猪瘟病毒中和抗体
采用实施例3制备的荧光定量检测猪瘟病毒中和抗体的免疫层析试剂盒作为检测
试剂盒。
分别选取20日龄、40日龄、65日龄、90日龄、105日龄、120日龄、后备母猪及经产母
猪八个阶段各取10头采集静脉血，离心分离血清5min,4000r/min，用0.05Mol/LPBS溶液稀
释15倍后，取80μL加至加样孔中；待层析反应进行15min后，用郑州赛孚生物工程有限公司
自主研制的动物疫病免疫荧光定量检测仪，检测荧光强度，读取检测结果。
本发明通过对实施例中的80例样本进行检测，同时用酶联免疫吸附(ELISA)试剂
盒进行检测比较。共检测80份猪不同阶段的样本，其中8份为Elisa检测可疑，除去可疑样
本，4份样本两种方法检测结果不一致，具体结果如表2所示：
表2本发明所述方法与ELISA检测结果比较
表3本发明所述方法与ELISA检测结果比较详细结果
由表2“本发明所述方法与ELISA检测结果比较”可知，从本实施例结果与ELISA方
法对比中发现，两者之间的总符合率高达94.4％，证明本发明所提供的检测方法与ELISA方
法检测结果符合率较高，说明本发明所提供的检测方法所测得的检测结果真实可靠。由于
间接ELISA法的酶标抗体为抗猪IgG的抗体，是二抗与抗体的结合，具有一定的局限性，存在
一定比例的假阳性，而本实验所建立的荧光微球定量检测方法，基于双抗原夹心法，通过两
个抗原特异性的和待测样本中的猪瘟抗体结合，使得试剂对样本检测的结合更直接更专
一，从而保证了产品的特异性。另外，荧光微球本身具有灵敏度高的特点，又能从根本上提
升本产品检测的灵敏度。
本领域的技术人员公知，仔猪免疫成功的关键是排除母源性抗体干扰，确定合适
的首免日龄。母源性抗体的存在，可使仔猪一定时间内被动地得到保护，同时，当仔猪体内
存在一定量的母源性抗体时，接种疫苗后，一部分疫苗毒被母源性抗体中和，使按原剂量注
射的疫苗毒达不到抗原阈值而造成免疫失败。范学政等用Elisa方法测定10窝仔猪(每窝选
5头)猪不同日龄的母源性抗体水平并于81D和35D进行攻毒保护实验研究，结果表明，81日
龄仔猪不能抵抗强毒攻击，35日龄仔猪大部分能抵抗强毒攻击，但母源性抗体不能完全阻
断猪瘟强毒攻击，35日龄时母源性抗体处于临界水平。为整个群体的免疫安全期间，首免日
龄应确定为25～35日龄。由表3“本发明所述方法与ELISA检测结果比较详细结果”也进一步
验证了范学政等人的研究，从20日龄到40日龄，猪瘟抗体的水平明显下降。首免后，到65日
龄时，抗体水平得到明显的提升，进一步随着时间的推移，猪瘟抗体又呈现了明显的下降趋
势。
猪瘟抗体水平的另一个显著规律就是，随着疫苗免疫次数的增加而提高。后备母
猪和经产母猪的免疫次数明显多于仔猪和育肥猪。所以，正如表3所体现的结果，后备母猪
和经产母猪这两个阶段的猪瘟抗体水平明显高于其它阶段的整体水平。
由表3“本发明所述方法与ELISA检测结果比较详细结果”可知，本发明所提供的检
测方法，所检测的结果，既符合母源性抗体消长规律同时也符合免疫学的规律，具有较强的
实际应用价值。
目前，市面上销售的应用ELISA方法检测食猪瘟病毒中和抗体的试剂盒的操作需
要大量的时间，相比之下，本发明结合了免疫微球富集技术和荧光定量检测技术，15min即
可获得准确可靠的检测数据，且操作简便。
以上是针对本发明的可行实施实例的具体说明，当该实施实例并非用以限制本发
明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专
利范围中。