急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒及检测方法技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种急性髓系白血病(Acute Myelo cytic
Leukemia,AML)粒细胞抗原表达量检测试剂盒。本发明还涉及急性髓系白血病粒细胞抗原
表达量检测方法。
背景技术
AML是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。它是一个具有高度异质
性的疾病群，可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性变转化。
1976年首先将AML分为7型，即AML-M1至AML-M7。1991年根据细胞的免疫标志特点，又增加了
AML-M0的诊断。
目前，AML的治疗已经取得了很大进展，但化疗仍难以使患者治愈，多数患者在2年
内仍会复发；由于缺乏对白血病细胞的靶向特异性，加大化疗剂量虽然能提高缓解率和无
病生存期，但化疗毒性和相关死亡率也同时增加，因此血液学专家正积极寻找一些新的特
异、安全和高效的治疗手段。随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗
等多种治疗方法的发展，A ML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善，但是仍
有大部分患者出现耐药和复发，预后不良。
单克隆抗体是有淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决
定簇的特异性抗体。因具有分子量小、毒副作用低、靶向性好等优点，近年来已成为肿瘤治
疗用药的主要方式。在90％AML患者中，髓系白血病细胞表面有一相对特异、稳定、高表达的
抗原CD33，而在正常造血多能干细胞及非造血细胞上却不存在这种糖蛋白。因此，CD33成为
AML免疫治疗最适宜的靶抗原。使用CD33单克隆抗体联合化疗治疗16例复发、难治性AML患
者，获得较高的完全缓解率，为部分患者行异基因造血干细胞移植提供了契机，可作为伴有
CD33高表达复发或难治性AML患者的一种较为有效的治疗方法。
美罗他格(Mylotarg,Gemtuzumab Ozogamicin,GO)是人源化抗CD33单克隆抗体与
强效抗肿瘤抗生素——乙酰棘孢霉素偶联物，与髓系白血病细胞表面CD33抗原结合，进入
细胞后释放棘孢霉素，对髓系白血病细胞有明显杀灭作用，用于治疗复发、难治的CD33+
AML，获得良好疗效。GO与其它化疗药物联合应用治疗AML的临床试验正在进行中，如地西他
滨(DAC)联合抗C D33单抗GO治疗难治性AML是安全可行的，尤其是对于一般情况差、不能耐
受高剂量化疗或高剂量挽救化疗失败的患者，不失为一种新的治疗选择。使用该方法对2例
难治性AML患者进行治疗后，均未出现肝静脉闭塞病(Hepa tic Veno-Occlusive Disease,
HVOD)及其它脏器功能损害表现。
针对髓系白血病细胞表面CD33抗原的检测，现有技术中表面等离子体共振
(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物传感器作为一种新兴的生物检测技术，采用自组
装膜技术，在传感芯片表面修饰抗CD33单克隆抗体，利用自行构建的SPR生物传感器检测人
骨髓血液中髓系白血病细胞抗原CD33的表达，能够快速给出定量分析结果；但是这个方法
的缺点也是明显的，即生物固化膜的不稳定性：物质分子在芯片表面吸附的不牢固，时间长
会脱落，难以形成稳定的分子；固定量也难以控制；生物分子在金表面容易丧失活性，尤其
是温度、酸碱度以及离子强度发生变化时更易失活；固定分子的取向也难以控制。
作为现有技术中另一种检测方法，酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immμ
nosorbent Assay,ELISA)采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，通过酶与底物产
生颜色反应，可进行定量测定。目前已建立了ELISA检测CD33单克隆抗体的方法，也开发出
相应的商品化试剂盒，可以检测血清、血浆、组织匀浆液、细胞上清培养液等样本中的含量。
但是ELISA方法仅可检测液体中可溶性蛋白的含量，即检测到髓系细胞分泌到血液或骨髓
中的CD33抗体的含量而无法直接检测细胞表面的抗原表达量。因此利用ELISA方法检测到
的CD33的抗体既可来源于AML患者正常的髓系前体细胞也可来源于异常的髓系白血病细
胞，因此目前尚未将ELISA方法应用与临床评估AML患者的治疗效果上来。
使用放射性核素标记方法也可测定每个细胞表面某种分子的数目，具有特异性强
且灵敏度高的特点。放射性核素标记方法是将非标记抗原与放射性标记抗原同时竞争结合
物(如抗体)上有限的结合位点，然后将结合抗原和未结合的游离抗原分离，用仪器测定放
射性分布，利用标准曲线确定样本中待测物含量。但缺点是受核素半衰期的限制且需特别
防止其放射性污染。目前尚未开发出用于CD33检测的放射免疫测定试剂盒。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其它生物粒
子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中
测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好、灵敏度高、环境
友好、操作简便等优点。流式细胞术可以同时检测样本细胞的前向角散射(Forward
Scatter,FSC)、侧向角散射(Side Scatter,SSC)及多个荧光通道强度，通过选择合适的荧
光抗体及正确的设门可以准确知道各群细胞的抗体表达情况，但传统的流式细胞术主要是
测定表达目标抗原细胞所占的比例，以及对目标抗原的表达做定性分析，即判断抗体表达
是否为阴性、弱阳性或强阳性，而很少对抗体表达做定量分析。
综上所述，如何对髓系白血病粒细胞表面CD33抗原表达实现快速、准确的定量分
析，成为当前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中髓系白血病粒细胞表面CD33抗原表达定量分
析技术的不足，提供了急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒及检测方法，可快速、
准确的实现对髓系白血病粒细胞CD33抗原表达的定量检测分析，有效的指导CD33单抗药物
对AML的靶向治疗。
为了实现上述技术目的，本发明实施例提供的一种技术方案为：
一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒，其试剂包括不同的荧光标记
的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体。
优选的，所述抗CD45抗体的荧光标记为Percp。
优选的，所述抗CD15抗体的荧光标记为FITC。
优选的，所述抗CD33抗体的荧光标记为PE。
作为前述试剂盒的优选，所述试剂还包括红细胞裂解液和磷酸缓冲盐溶液
(Phosphate Buffer Saline,PBS)溶液。
本发明实施例提供的另一种技术方案为：
一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测方法，包括步骤如下：
S1.采集检测标本：抽取AML患者的外周血或骨髓作为检测标本；
S2.加入抗体及荧光染色：将所述检测标本中加入使用不同的荧光标记的抗CD45
抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体并混匀；
S3.流式细胞术检测：对所述检测标本进行孵育和红细胞裂解后，使用流式细胞术
进行检测，设门分型得到CD15+CD33+的靶标细胞荧光强度；
S4.测定标准曲线：使用流式细胞术在所述检测标本同等条件下测定Qua
ntiBRITE PE Beads荧光，获得Beads(微球)平均荧光强度与抗原表达量的标准曲线；
S5.计算抗原表达量：将所述靶标细胞荧光强度值代入标准曲线换算得到所述检
测标本中髓系白血病粒细胞表面CD33平均抗原表达量。
优选的，执行步骤S2前，对所述检测标本进行白细胞计数，将所述检测标本的细胞
浓度调至3×107/mL。
优选的，步骤S4测定所述标准曲线时，使用流式细胞仪检测QuantiBRIT E PE
Beads荧光强度，以前向角/侧向角设门，以前向角设阈值得到Beads；根据PE荧光强度在将
Beads分群，并得到每群Beads的荧光强度均值；根据Beads提供的分子量和得到的所述每群
Beads的荧光强度均值拟合得到所述标准曲线。
优选的，步骤S2中加入所述检测标本的不同的荧光标记的抗体为：CD45Percp、
CD15FITC和CD33PE。
优选的，对所述检测标本进行设门分型时，在CD45Percp-SSC图中设门得到CD45阳
性的粒细胞，进一步在CD45Percp-CD15FITC图中设门得到C D45+CD15+的非干/祖细胞的粒
细胞，进一步在CD15FITC-CD33PE图中设门得到所述CD15+CD33+的靶标细胞。
本发明的技术方案将所述试剂盒应用于所述检测方法，使用流式细胞术检测AML
患者外周血及骨髓中的粒细胞(非干/祖细胞)的CD33抗原表达量，与传统的流式细胞术主
要测定表达目标抗原细胞比例和进行定性分析相比，其有益效果在于：可快速、准确的实现
对髓系白血病粒细胞CD33抗原表达的定量检测分析，检测结果可用于评估AML单克隆抗体
疗法的疗效，有效的指导CD33单抗药物对AML的靶向治疗。
附图说明
图1所示为本发明实施例AML细胞抗原表达量检测方法的流程图；
图2所示为本发明实施例中QuantiBRITE PE Beads的微球PE荧光强度的Count-PE
直方图；
图3所示为本发明实施例中测定获得微球平均荧光强度和抗原表达量对数值的标
准曲线；
图4所示为本发明实施例使用BD FACSDIVA软件分析数据样本管获得的AML细胞分
型结果。
具体实施方式
以下结合附图通过实施例对本发明做进一步说明，以便更好地理解本发明。
本发明的技术方案将所述试剂盒应用于所述检测方法，使用流式细胞术检测AML
患者外周血及骨髓中的粒细胞(非干/祖细胞)的CD33抗原表达量。
本发明一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测试剂盒的实施例，其试剂包括
不同的荧光标记的抗CD45抗体、抗CD15抗体和抗CD33抗体。
作为一种优选的实施方式，前述试剂盒中，抗CD45抗体的荧光标记为P ercp，抗
CD15抗体的荧光标记为FITC，抗CD33抗体的荧光标记为PE；试剂还可包括红细胞裂解液和
PBS。
本发明一种急性髓系白血病粒细胞抗原表达量检测方法的实施例，如图1所示，包
括步骤如下：
S1.采集检测标本：抽取AML患者的外周血或骨髓，患者的外周血或骨髓作为检测
标本；
S2.加入抗体及荧光染色：将检测标本中加入使用不同的荧光标记的抗CD45抗体、
抗CD15抗体和抗CD33抗体并混匀；
S3.流式细胞术检测：对检测标本进行孵育和红细胞裂解后，使用流式细胞术进行
检测，设门分型得到CD15+CD33+靶标细胞的荧光强度；
S4.测定标准曲线：使用流式细胞术在检测标本同等条件下测定QuantiB RITE PE
Beads荧光，获得Beads平均荧光强度与抗原表达量的标准曲线；
S5.计算抗原表达量：将靶标细胞荧光强度值代入标准曲线换算得到检测标本中
髓系白血病粒细胞表面CD33平均抗原表达量。
具体的检测技术方案如下：荧光标记的抗体使用CD45Percp/CD15FITC/CD33PE；
试剂用量及添加标准，标本与抗体的添加比例为：细胞浓度调至3×107个/mL，向
流式管中加70μL标本；单次检测(test)中，试剂按照试剂说明添加CD45Percp 10μL/test、
CD15FITC 20μL/test、CD33PE 20μL/test，确保抗体充足；
使用美国BD公司(Becton,Dickinson and Company)的QuantiBRITE PE Beads，同
时根据QuantiBRITE PE Beads中不同Beads群的平均荧光强度及Beads上的分子量绘制标
准曲线。将检测标本中粒细胞的CD33的平均荧光强度带入标准曲线，计算出粒细胞上CD33
的平均抗原表达量。
作为一种优选的实施方式，具体操作流程为：
步骤S1中，抽取AML患者的外周血作为检测标本，对检测标本进行白细胞计数，将
细胞浓度调至3×107/mL；
步骤S2中，取一支专用的流式管，向流式管中加入CD45-Percp 10μL、CD15FITC 20
μL、CD33PE 10μL；向流式管内加入检测标本70μL，低速涡旋混匀；
步骤S3中，将混匀检测标本室温避光孵育20min；向流式管内加入红细胞裂解液
1mL，低速涡旋混匀，室温避光裂解红细胞10min；裂解结束后立即以1500r/min离心5min，离
心结束后弃上清，然后向管内加入1mL PBS，低速涡旋混匀，以1500r/min离心5min；离心结
束后弃上清；向管内加入0.5mL的PBS重悬细胞，低速涡旋混匀，24h内使用流式细胞仪上机
检测；在检测时，调节好个通道电压，收集P1门内细胞100万；
步骤S4中，取一支PE Beads，加入500μL缓冲液(0.3％甲醛溶液)，与前述检测标本
同样条件使用流式细胞仪上机检测；应用BD FACSDIVA软件分析数据，在SSC-FSC散点图中
设门得到Beads，绘制如图2所示的Count-PE的直方图中，根据PE荧光强度的不同将Beads分
为Low、MedLow、MedHigh和High四个群，得到每群Beads的荧光强度的均值；以Beads提供的
分子量的对数值为横坐标与测定获得的Beads荧光强度均值的对数值为纵坐标，拟合得到
如图3的Beads荧光强度和抗原表达量的标准曲线；
步骤S5中，应用BD FACSDIVA软件分析检测标本的流式管，如图4所示：
在CD45Percp-SSC图中设门得到CD45阳性且SSC较大的粒细胞，CD45Percp-
CD15FITC图中设门的到CD45+CD15+的粒细胞(非干/祖细胞)，在CD15FITC-CD33PE图中得到
CD15+CD33+的靶标细胞，读取靶标细胞的荧光强度的均值，取对数代入Beads荧光强度和抗
原表达量的标准曲线，得到CD33抗原表达量的对数值，从而得到粒细胞(非干/祖细胞)上的
CD33平均抗原表达量。
在本发明中，上标“+”代表阳性，即表示该抗原在细胞表面有表达。
若未特别指明，以上各实施例中所用技术手段为本技术领域技术人员的常规手
段，所用原料均为可取得的市售产品。
应理解，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于供本领域技
术人员了解本发明的内容并据以实施，并非具体实施方式的穷举，并不能以此限制本发明
的保护范围。凡根据本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案
的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。