一种改良的人体液显色法真菌1,3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用方法技术领域
本发明涉及一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用。
背景技术
深部真菌感染又称侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)。在过去
的二十年里，随着大量广谱抗生素的应用、骨髓器官移植的开展、抗肿瘤药物和糖皮质激素
及免疫抑制剂的应用，导管介入治疗，特别是艾滋病的流行，象念珠菌血症和系统性曲霉菌
病等深部真菌感染的发病率逐渐增多，而且深部真菌感染患者的病理特征不明显，其传统
诊断方法假阴性率高、诊断周期长，现有快诊试剂的稳定性和重复性无法满足临床需求，不
能及时的为临床提供准确的诊断依据，这些因素都造成了系统性真菌感染的诊断、预防和
治疗非常困难，相对应的与这些感染相关的死亡率也非常高，这种状况日益引起医学界的
重视。因此必须对深部真菌感染的诊治有了一定的认识，了解现有诊断方法的不足，开发出
一种新的快速、准确、灵敏诊断方法或试剂，才能增加早期诊断的及时性和正确性，从而减
少误诊率、漏诊率、死亡率。
研究表明，1，3-β-D葡聚糖是除接合菌外，几乎所有的酵母和丝状真菌细胞壁中的
组成成分。当真菌侵入人体血液或组织后，引起免疫应答反应，通过中性粒细胞和吞噬细胞
的作用，人体体液中的1，3-β-D葡聚糖含量升高，在人体的定植真菌或浅部真菌感染中，均
无此现象。因此，1，3-β-D-葡聚糖在血液及无菌体液中的含量成为国际公认的侵袭性真菌
感染诊断标准。
申请号为201210338802.4的中国发明专利“一种人体液真菌(1，3)-β-D 葡聚糖检
测试剂盒及其应用方法”中，公开了一种浊度法检测真菌(1，3)-β-D葡聚糖的试剂盒。然而，
浊度法检测1，3-β-D葡聚糖在侵袭性真菌检测发展的二十年来被广泛应用，属于传统检测
方法，此方法检测灵敏度较低，易受样本及药物引起的非特异性浊度干扰，引起假阳性或假
阴性，检测准确度很难满足临床要求。
公开日为2015年11月4日，申请号为105021817A的中国发明专利申请“一种人体液
的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒”公开了一种检测真菌1，3-β-D-葡聚糖的试剂
盒。然而，其反应主剂制备方法为传统制备方法，无法消除由鲎血细胞内含物质的活性差异
导致的试剂批间差异；其反应主剂中添加的B、C因子抑制剂可抑制G因子外的旁路反应，但
与主剂复溶液混合后，在Mg2+参与下，其反应体系中主剂会失去对内毒素反应的抑制作用，
影响试剂的稳定性和检测的准确性，很难满足临床要求。
申请号为201420382343.4的中国实用新型专利“一种偶氮化终点显色法真菌葡聚
糖检测试剂盒”中，公开了一种偶氮化终点显色法真菌葡聚糖检测试剂盒。在其使用时需样
本处理、添加三种偶氮化试剂、添加终止剂，反应线路长，易受到人为操作干扰，影响检测的
准确度，不易于未来的自动化应用。
申请号为201420382432.9的中国实用新型专利“一种动态显色法真菌葡聚糖检测
鲎试剂盒”中，公开了一种动态显色法真菌葡聚糖检测鲎试剂盒。其样本处理方式使用传统
的加热稀释法，无法完全去除样本中的干扰因素，无法完全释放样本中的1，3-β-D-葡聚糖，
并且使用加热稀释法处理后的样本与反应试剂混合后，使反应体系的液体粘度增加，易发
生局部反应，影响检测结果。另外，其检测方法使用多肽显色基质作为反应指示物，增加了
检测的灵敏度，但也同时放大了由于样本处理不彻底而产生的干扰信号，影响检测的准确
度，很难满足临床要求。
WO2001/052905A1公开了用于检测极小量β-1，3-葡聚糖的组合物，其制 备方法以
及检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。本发明的组合物在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显
示酚氧化酶活性，使用该组合物时，从样本收集样品，将该组合物和钙离子加入样品中，通
过测定酚氧化酶而检测β-1，3-葡聚糖。然而，该方法精度不令人满意。
“(1，3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染的诊断意义”，蒋伟等，实用预防医学，
2014年1期，探讨血浆(1，3)-β-D-葡聚糖[(1，3)-β-D-Glucan，BDG]检测对深部真菌感染的
诊断价值和方法，回顾性分析430例疑似病例的BDG结果及其临床特征，应用MB-80微生物动
态快速检测系统及GKT25M Set动态真菌检测试剂盒定量检测血浆中BDG的含量，结合患者
血液、痰或中段尿标本的真菌培养，用统计学方法计算BDG试验在真菌感染早期诊断中的敏
感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，同时连续检测血清BDG浓度变化，观察其与疾病进
展和预后间的关系。然而，该方法操作比较复杂且检测准确度低。
由上述现有技术可知，本领域需要一种兼具有工艺简单、稳定性高、灵敏度高、准
确度高等多项优点的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。
发明内容
本发明为提供一种生产工艺简单、设计合理、稳定性高、灵敏度高、准确度高，可匹
配半自动、全自动检测分析仪开发和应用的一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚
糖检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括：反应主剂、主剂
复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品，反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液
为主要原料制得。
优选地，所述反应主剂含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白及多肽显色基质。
进一步的，所述反应主剂通过包括以下步骤的方法制得：
(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境，解冻8～14小时，将鲎细胞
裂解物(例如至少2.5kg)混合，并在4℃环境下，充分搅拌5～30分钟；
(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4℃环境下，使用
匀浆机匀浆，匀浆机转速为5000rpm～18000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂
解物充分乳化，即得鲎细胞裂解物乳化液；
(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液，在4℃温度下，以8000～12000rpm的
速度离心15-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；
(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入20％-50％的氯仿(体积
比，基于鲎细胞裂解液体积计)，在4℃环境下，充分搅拌1～5分钟，再在4℃温度下，以8000
～12000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液；
(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.3～
1.0mg多肽显色基质；4℃环境下，充分搅拌5～15分钟，冷冻真空干燥，即得反应主剂。
进一步的，所述主剂复溶液可以为0.05～1M的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.0～8.0。
进一步的，所述样本处理液可以为0.05～1.5M的KOH溶液和0.2～2.5M的KCl溶液
的等体积混合溶液。
进一步的，所述无菌水可以为注射用水或超纯水。
进一步的，所述标准品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品添加至含2-10％
(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶3～9∶1(质量比)的混合物，
充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥。
进一步的，所述质控品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品和牛血清添加至
含2-10％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇 比例1∶3～9∶1(质量比)
的混合物，充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥。
进一步的，提供了所述一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂
盒使用酶标仪进行速率法酶动力学检测法，可在40分钟内完成96个检测反应，适用于的半
自动、全自动检测分析仪的开发及应用。
进一步的，本发明还提供了所述一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖
检测试剂盒的用途，其主要应用在人血液及其他人体液样本的1，3-β-D-葡聚糖检测。
与现有技术相比，本发明具有(不限于)以下突出的技术效果：
(1)针对鲎细胞原料活性差异性较大，生产工艺复杂的公知问题，在发明的真菌1，
3-β-D-葡聚糖检测试剂的反应主剂及其制备方法，采用混批制备工艺，无需另外添加促活
剂和B、C因子抑制剂，产品生产工艺简单，稳定性强，批内、批间差异极小。
(2)针对应用鲎试剂检测原理对1，3-β-D-葡聚糖检测时，内毒素旁路反应干扰的
公知问题，本发明提供了一种特别适合真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂的有效主剂复溶液，
其与(1)中所述的反应主剂混合，可有效屏蔽旁路反应干扰。换言之，所述反应主剂与主剂
复溶液之间具有良好的匹配性和协同性，通过发挥协同作用而取得良好的效果。
(3)本发明人还发现，应用鲎试剂检测原理对人体液样本检测时，样本处理无法完
全去除样本中的干扰因素，无法完全释放样本中的1，3-β-D-葡聚糖，影响检测准确度的公
知技术问题，针对本领域普遍存在的该问题，本发明创造性地采用碱处理方法，使得可有效
处理人体液样本，大幅度提高检测的重复性及准确性。
(4)针对1，3-β-D-葡聚糖标准品溶解后效价易降低的本领域公知的技术问题，本
发明人经过深入研究和大量实验，发明了一种与所述真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂体系匹
配的1，3-β-D-葡聚糖标准品及其制备方法，采用特定比例的混合赋型剂，标准品效价极稳
定，这样的效果是先前所未预料到的。
(5)针对1，3-β-D-葡聚糖质控品溶解后效价易降低，而且检测效价结果变动范围
较大的本领域公知技术问题，本发明人发明了一种与所述真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂体
系匹配的1，3-β-D-葡聚糖质控品及其制备方法，采用特定比例的混合赋型剂，质控品效价
极稳定。
(6)本发明人还发现，真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂应用时，检测易受非特异性浊
度影响，检测通量小，操作路线长，易受到由人为及环境因素影响而导致检测结果不准确，
检测体系发展空间有限，针对发现的技术问题，经过大量实验和筛选，在本发明中所述真菌
1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒采用酶切多肽显色基质显色，使用酶标仪进行速率法酶动力学
检测的方法，使得可在40分钟内完成96个检测反应，适用于的半自动、全自动检测分析仪的
开发及应用。
附图说明
图1为根据本发明的改良的1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒标准曲线；
具体实施方式
为进一步说明本发明内容、优点和有益效果，列举以下实施例，并结合附图说明：
实施例1：改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的生产制造。
所述改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括：反应主剂、主剂
复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品。
所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：
(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境，解冻10小时，将至少2.5kg
的鲎细胞裂解物混合，并在4℃环境下，充分搅拌20分钟；
(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4 ℃环境下，使用
匀浆机匀浆，匀浆机转速为10000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂解物充分乳
化，即得鲎细胞裂解物乳化液；
(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液，4℃，10000rpm离心20分钟，取上清
液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；
(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入30％的氯仿(体积占
比)，4℃环境下，充分搅拌3分钟，4℃，10000rpm下离心20分钟，取上清液；
(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.5mg
多肽显色基质；4℃环境下，充分搅拌10分钟，冷冻真空干燥，即得反应主剂。
所述主剂复溶液的制备方法为：按配方用量称取Tris盐，置于配液容器内，加无菌
水至Tris盐浓度为0.5M，充分搅拌，用浓盐酸调节pH值至pH7.5，滤菌分装。
所述样本处理液的制备方法为：按配方用量称取KOH，置于配液容器内，加无菌水
至KOH浓度为0.5M，充分搅拌，滤菌分装；按配方用量称取KCl，置于配液容器内，加无菌水至
KCl浓度为1.0M，充分搅拌，滤菌分装。
所述无菌水的制备方法为：将注射用水或超纯水滤菌分装为20mL每瓶。
所述标准品制备方法为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品添加至含8％(质量比)赋型剂的
溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶1(质量比)的混合物，充分搅拌520分钟，滤菌分
装，冷冻真空干燥。
所述质控品制备方法为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品和牛血清添加至含5％(质量比)
赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶1(质量比)的混合物，充分搅拌20分
钟，滤菌分装，冷冻真空干燥。
实施例2：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒检测人血液
样本中1，3-β-D-葡聚糖含量的应用。
所述试剂盒得自实施例1。所述试剂盒应用的实现步骤包括：标准曲线制作、阳性
血清样本的制备、样本处理、添加反应主剂、上机检测，具体步骤如下：
1.标准曲线的制作：
(1)标准溶液的准备
取1支试剂盒标准品，加入无菌水溶解，配制成200pg/mL 1，3-β-D-葡聚糖标准品
溶液，漩涡混合不少于30秒，将其用无菌水梯度稀释至100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、
12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.125pg/mL，使用无菌水为空白对照。
试剂盒对样本处理时进行了5倍稀释，所以制备标准曲线时，标准溶液对应的样本
浓度值需乘以5，分别为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/rmL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/
mL、15.625pg/mL。
(2)复溶反应主剂
取1支试剂盒反应主剂，以反应主剂规格为3.2mL为例，先加入1.6mL无菌水，轻微
震荡，待其完全溶解后，加入1.6mL主剂复溶液，震荡混匀，备用。
(3)添加
向微孔板中每孔加入50μL标准品溶液，阴性对照孔加入50μL无菌水，再加入100μL
复溶后反应主剂。
(4)上机检测
使用酶标仪进行速率法酶动力学检测，反应时间为40min。
反应结束后，将所测得的反应浓度值(x)与反应速率(y)进行线性回归分析(表1)，
计算标准曲线的线性系数(r)：
表1：糖标准品测试数据
根据上述数据拟合标准曲线：y＝0.0155x-0.0447，r＝0.999，符合实验标准要求，
标准曲线制作有效(图1)。
2.检测样本的制备
(1)阳性血清样本的制备
用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为150pg/mL的血清样本，
备用。
(2)质控样本的制备
取1支试剂盒质控品，以试剂盒质控品规格为1.5mL为例，加入1.5mL无菌水复溶质
控，备用。
3.样本处理
向微孔板中加入血液阳性血清样本、健康人血清样本和质控样本，每孔加样量为
10μL，然后加入40μL样本处理液，振荡混匀10s，37℃温浴10min。
4.添加反应主剂
取1支试剂盒反应主剂，以反应主剂规格为3.2mL为例，先加入1.6mL无菌水，轻微
震荡，待其完全溶解后，加入1.6mL主剂复溶液，震荡混匀， 每检测孔中加入100μL反应主
剂。
5.上机检测
使用酶标仪进行速率法酶动力学检测，反应时间为40min。
6.实验结果分析
将血清样本及质控样本的反应速率值代入1中的标准曲线，检测结果(如表2所示)
与试验预期相符，试剂盒质控品参考范围为125～141pg/mL，试剂受控，本次检测结果有效。
表2：样本检测结果
实施例3：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒检测准确度
的验证。
所述试剂盒的检测准确度验证的实现步骤包括：制备试验血清样本、上机检测、统
计分析结果。
1.制备试验血清样本
(1)高值血清样本
用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为500pg/mL的血清样本，
备用，即为样本A。
(2)低值血清样本
用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为50pg/mL的血清样本，备
用，即为样本B。
(3)混合样本
将样本A和样本B按体积比例为1∶9混合，备用，即为样本C。
2.上机检测
使用所述试剂盒对样本A、B、C进行检测，检测方法同实施例二中所述样本方法，重
复检测三次得样本A、B、C浓度的平均值，按公式(1)计算回收率
式中：
v：样品A的体积；
v0：样品B的体积；
C：样品B加入样本A后的检测浓度；
C0：样品B的浓度；
Cs：样品A的浓度。
3.统计分析结果
表3：试剂盒检测准确度的验证检测结果
将表3检测结果代入公式(1)，得
可见，所述试剂盒检测人血清样本时，回收率为105.9％，检测准确度高。
实施例4：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒批间差的验
证。
所述试剂盒的准确度批间差验证的实现步骤包括：制备试验血清样本、上机检测、
统计分析结果。
1.制备试验血清样本
用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为200pg/mL的血清样本，
备用。
2.上机检测
分别使用3个不同生产批号的所述试剂盒检测1中的血清样品，每个批次重复检测
10次，按公式(2)计算30次检测的变异系数。
式中：
CV：变异系数；
S：标准差；
：测量值的均值。
3.统计分析结果
表4：试剂盒批间差的验证检测结果
由表4结果可得，所述三个不同批次试剂盒检测结果均值标准差S＝
0.63，代入公式(2)，得：
CV＝0.63/201.32×100％＝0.31％
由上述数据可以清楚地看出，所述试剂盒批间检测差异为0.31％，批间差极小，并
且具有非常高的检测重复性及准确性。
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