一种磷脂酶A2的活性测定方法技术领域
本发明涉及酶活性测定，具体地说，涉及一种磷脂酶A2的活性测
定方法。
背景技术
磷脂酶A2(EC 3.1.1.4，phospholipase A2，PLA2)是一种可以
水解磷脂分子中sn-2位酯键，得到溶血磷脂和脂肪酸的酶(王小强
等.蝮蛇毒酸性磷脂酶A2高含钙量的晶体结构研究[J].生物化学与生
物物理学报，1997，29(2):142-149)。磷脂酶A2是一类分布广泛的酶
家族，存在于各种动物组织，尤其是蛇毒、蝎毒、蜂毒等动物毒液和
哺乳动物的胰脏分泌液中(郝彩等.广东眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯
化及其酶活性质[J].中国生物制品学杂志，2011，24(5):575-578)。参
与膜磷脂的降解和代谢、信号传导、宿主防御、血液凝固、细胞膜重
建、二十二烷酸前体生成等(杨武等.分泌型磷脂酶A2亚家族:结构
与功能[J].中国生物化学与分子生物学报，2013，29(10):932-940)。
其中蛇毒中磷脂酶A2还具有某些重要的毒性作用(如神经毒性、
出血毒性、肌肉毒性、心脏毒性等)及多种其他生物学功能(如杀菌、
诱导细胞凋亡、阻止HIV进入宿主细胞、引起水肿等)。正因为磷
脂酶A2的多种毒性与生物学功能，检定其活性非常重要。一方面，
我们需要通过其活性推断其可能带来的生物学功能，另一方面，由于
具有毒性作用，磷脂酶A2作为样品中的杂质的检定也尤为重要。
磷脂酶A2活性测定比较常用的方法是利用自动电位滴定法，以
新鲜蛋黄为底物，加入必需的钙离子以及钠离子和去垢剂如脱氧胆酸
钠、Triton X—100等，调pH8.0左右，通过滴定释放出的脂肪酸，
求出PLA2活力。这种方法操作简单，底物对PLA2也较敏感，但由
于蛋黄中存在杂质，所以多用在要求不太高的场合。还有测活时需将
pH电极浸入底物中，这就要求每次测活底物不少于5ml，且pH不能
太高或过低。
亦有研究用酚红作为pH指示剂，通过比色法测活，这种方法适
用于对样品的大量测定，简单迅速，所需底物也较少，但因指示剂对
PLA2的影响及PLA2活力受pH制约等，准确度还是不高(张翔等.
蛇毒磷脂酶A2:不同测活方法的评估[J].生命的化学，1994，
14(2):41-42)。
用放射性标记的人工合成底物(Dole V P and Meinertz H，
Microdetermination of Long-chain Fatty Acids in Plasma and Tissues[J].
J Biol Chem，1960，235:2595)，可以大大提高测活的灵敏度。因接
触到同位素操作上多有不便。
最近的由MATTHEW HOLZER等(Matthew Holzer and Stephen P.
Mackessy.An aqueous endpoint assay of snake venom phospholipase
A2[J].Toxicon，1996，34(10):1149-55)以4-硝基-3-辛酰氧基苯甲
酸为底物，利用磷脂酶A2在钙离子的存在下能催化底物4-硝基-3-辛
酰氧基苯甲酸水解，生成的含发色基团的产物4-硝基-3-羟基苯甲酸，
通过测定其在单位时间内产物生成的量评价反应速率，从而反映磷脂
酶A2的活性。该方法不依赖于特殊仪器，如自动电位滴定仪、同位
素检测仪器；操作安全，不具有放射性；操作简单；检测周期短。
磷脂酶A2催化底物水解反应方程式，如下：
然而，在实际试验中发现，MATTHEW HOLZER的方法存在以
下缺陷：检测限较高，只能达到100U/mL；试验难度大，不易得到良
好线性；加标回收率只能达到50％左右；方法体系所需样品及标准品
体积较大，增加试验成本。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种磷脂
酶A2的活性测定方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种磷脂酶A2的活性测定方法，所述方法包括如下步骤：
1)向梯度稀释的磷脂酶A2标准品和待测样品中分别加入pH8.0
的缓冲溶液混匀；然后分别加入底物4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸进行水
浴反应，终止剂终止反应后检测吸光度值，利用吸光度值与浓度绘制
标准曲线；
2)通过标准曲线及待测样品的吸光度值计算待测样品的磷脂酶
A2活性；
其中，所述缓冲溶液为含Tris-HCl、CaCl2与NaCl的缓冲溶液，
Tris-HCl：CaCl2：NaCl的摩尔浓度范围比为6.0～16.7:1:5.0～13.9。
本发明提供的活性检测方法，与现有技术相比，其中的缓冲溶液
摩尔浓度较大，缓冲能力增强，从而使得活性检测过程中反应体系pH
相对比较稳定，使得该方法线性更好、检测范围更宽。
进一步地，所述缓冲溶液为含180～300mM Tris-HCl、18～30mM
CaCl2、150～250mM NaCl的pH8.0的缓冲溶液。
作为优选，所述缓冲溶液为含220mM Tris-HCl、18mM CaCl2、
200mM NaCl的pH8.0的缓冲溶液。
进一步地，所述水浴反应的温度为40～50℃，反应时间为
30～40min；进一步优选地，所述方法中水浴温度为43℃，反应时间
为30min。
发明人通过大量试验研究发现，在本发明的活性测定方法中磷脂
酶A2在常规酶反应温度37℃并不是其最适温度，反应20分钟也不
是最佳反应时间。试验中催化反应在开始时很慢，经过一段时间才突
然上升，即存在延迟期。当将反应时间控制在30-40分钟时，使测定
时脱离催化反应的延迟期，使得本发明方法的线性得以提高。同时发
现，当将反应温度控制在40～50℃时，避开了其他酶的最适反应温度，
而抑制了其他酶的活性，本发明的准确度也得到提高。
进一步地，所述终止剂为可溶于水且不使缓冲盐析出的有机溶剂
或Cr离子溶液；作为优选，所述有机溶剂选自乙醇、乙腈或甲醇；更
为优选，所述有机溶剂为乙醇。
使用本发明可溶于水且不使缓冲盐析出的有机溶剂作为终止剂，
可迅速有效地终止反应，使测得实验的结果不会产生较大偏差。同时
也可以及时进行下步操作，节省了操作时间。
进一步地，所述方法加入的缓冲溶液与磷脂酶A2标准品和待测样
品的体积比均为1：1；
进一步地，加入的底物与缓冲溶液的体积比为1：5；
进一步地，加入的终止剂与缓冲溶液的体积比为1：1。
进一步地，所述底物浓度为7.5-15mM；优选为9mM。
本发明方法加入的底物总量少，可降低检测成本。在优选的底物
浓度范围内，测定时底物浓度足够大，单位时间内酶促反应速率相对
稳定，提高线性和准确性。
在本发明的实施例中，进一步地，所述待测样品设置对照，对照
中加入的缓冲溶液除不含CaCl2外，其余成分、浓度和体积与待测样
品所加缓冲溶液一致。
进一步地，所述方法可用于检测凝血因子X激活剂原液中的磷脂
酶A2活性。
进一步地，所述方法是在425nm下测吸光度值。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种新的测定磷脂酶A2活性的方法，相较于原有方
法最主要的技术效果体现在：检测范围宽，为20-180U/mL；线性好，
线性值R2＞0.990，准确性与精密度都得到显著提高，具体改进体现在
以下几方面：
1、本发明中反应体系缓冲能力增强，主要是由于加入的缓冲液
中Tris-HCl摩尔浓度增大以及三种物质摩尔浓度的特定比例，提高了
反应体系的缓冲能力，缓冲了反应过程中产生大量辛酸，使反应体系
pH相对稳定，使得该方法线性好，线性值R2>0.990、远大于现有技术
的线性值R2＝0.986，检测范围宽20-180U/mL，最低检测限20U/mL，
远低于现有技术的检测最低限100U/mL。
2、本发明的方法摸索了磷脂酶A2反应时的水浴温度与反应时
间，发现将反应温度控制在40～50℃、反应时间控制在30-40分钟时，
在活性测定时脱离催化反应的延迟期，使得本发明方法的线性得以提
高。同时发现，当将反应温度控制在40～50℃时，与现有技术相比本
发明的加标回收率从50％左右可提高到80～110％，方法准确性更高。
3、本发明方法采用可溶于水且不使缓冲盐析出的有机溶剂作为
终止剂，可完全终止反应，在30分钟内测定结果稳定，RSD不超过2％，
测得实验的结果不会产生较大偏差；同时操作过程中不产生气泡，便
于操作。
4、提高底物浓度，使测定时底物浓度足够大，单位时间内酶促
反应速率相对稳定，提高线性和准确性。
5、缓冲体系的体积和底物的体积用量减少，便于操作，同时底
物的总体用量减少，节约试验成本。
本发明的实施例中还设置了样品对照，减少粗毒和原液中含有的
对底物有轻微水解作用的一些蛋白质的影响，检测结果更准确，避免
检测结果相对实际值稍有偏高的现象。该方法可用于检测凝血因子X
激活剂原液中磷脂酶A2的活性，从而看原液是否符合药用要求。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的标准曲线图；
图2为实施例2步骤3所述本发明方法的标准曲线图；
图3为实施例2步骤3所述MATTHEW HOLZER方法的吸光度值与
反应浓度关系图；
图4为实施例2步骤3所述MATTHEW HOLZER方法的标准曲线
图；
图5为实施例2步骤4所述MATTHEW HOLZER方法的不同测试时
间OD变化图；
图6为实施例3所述的标准曲线图；
图7为实施例4所述的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂：
4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸：(厂家：Enzo Life Sciences，货号：
BML-ST506-0250)
磷脂酶A2标准品溶液：从Sigma购买，在Sigma官方网站上查询本
批次标准品的检测报告，从中查得相应的标准品活性。加超纯水溶解，
使得其活性为200U/ml。0.3ml/支分装，保存在-80℃，有效期6个月。
本发明以对比文件MATTHEW HOLZER方法为对比试验。
实施例1 磷脂酶A2活性测定
1、标准品及待测样品制备
1.1各稀释度标准品配制
磷脂酶A2标准品溶液加超纯水溶解，使得其活性为200U/ml。
0.3ml/支分装，保存在-80℃。
参照下表加入水与磷脂酶A2标准品溶液，制备各稀释度标准品使
各标准品活性分别为0、20、60、100、140、180U/mL，分别对应为
A0-A5。
1.2待测样品制备
粗毒：购买的圆斑蝰蛇粗毒用水配制为10mg/ml的溶液后，稀释
60、70与100倍高中低3个浓度。
凝血因子X激活剂(RVV-X)原液：按照《广西圆斑蝰蛇毒凝血
因子X激活剂的分离纯化及其止血作用的研究》中所述方法制备凝血
因子X激活剂原液。利用3K超滤管超滤置换样品溶剂为水(4000g离
心60min，加水补充溶剂，重复3次)，调整蛋白浓度为1mg/mL左右。
2、测定待测样品活性
2.1分别向每支已加入含100μL 220mM Tris-HCl，18mM CaCl2，
200mM NaCl的pH8.0缓冲溶液的EP管中加入上述制备好的各稀释度
标准品及各稀释度待测样品，每个标准品或样品重复三次，混匀后离
心，再向其中加入20μL 9mM底物4-硝基-3-辛酰氧基苯甲酸，涡旋混
匀5s离心，放置43℃水浴30min。将反应管迅速放置在冰水混合物上
迅速降温，混匀离心。快速加入100μL冰冷乙醇，涡旋混匀5s，终止
反应。
2.2从各EP管中取200μL加入96孔板中，迅速在425nm下测
试吸光度值，绘制标准曲线。通过标准曲线及待测样品的吸光度值计
算待测样品的磷脂酶A2活性。
3、待测样品对照
上述步骤3测定待测样品的同时，每个待测样品管检测设置待测
样品对照管，待测样品对照管中加入含100μL 220mM Tris-HCl，
200mM NaCl的pH8.0缓冲溶液，而后分别加入100μL高中低浓度粗
毒样品和原液样品。
4、检测结果
按照上述方法，标准品在425nm下测定得到以下结果：
表1 标准品及样品在425nm下吸光度值
A0孔作为空白扣除其OD，得到标准曲线上各点OD，将吸光度
值与浓度做线性回归，得到标准曲线如图1所示，其R2＝0.998。从标
准曲线可知，本实施例活性检测方法的线性在20～180U/ml范围内。
样品管及样品对照管OD值如下所示：
表2 待测样品管与待测样品对照管OD值结果
样品管测试结果代入标准曲线中，计算出磷脂酶A2活性，得到结
果如下：
表3 未设待测样品对照组的样品活性结果
由上表可知，测定的低浓度粗毒、原液的磷脂酶A2活性分别为
137.960、94.029U/mL，高中浓度粗毒测定结果超过180U/ml。对于较
高浓度待测样品需再次稀释，使酶活性结果在20～180U/ml检测范围
内。
待测样品管测试结果减去对应的待测样品对照结果，再带入标准
曲线中，计算出磷脂酶A2活性，得到以下结果：
表4 设待测样品对照组的样品测定结果
由结果可知，测定的高中低浓度粗毒的磷脂酶A2活性分别为
168.68、123.806、63.858U/mL。原液测定结果未超过20U/mL标准品
点，即活性不超过20U/mL。
本实施例中，不设置待测样品对照与设置待测样品对照对标准曲
线的绘制没有影响，均可检测出待测样品的活性。
磷脂酶A2是一种钙离子依赖型酶，在缺乏钙离子的溶液中不具有
水解活性，而凝血因子X激活剂在无Ca2+的情况下就具有蛋白水解的
活性(Takeya,H..Coagulation factor Xactivating enzyme from Russell’s
viper venom(RVV-X).A novel metalloproteinase with disintegrin(platelet
aggregation inhibitor)-like and C-typelectin-like
domains.J.Biol.Chem.267(1992)14109-14117)。此外，我们也通过实验
表明，缺乏钙离子的溶液随着溶液中凝血因子X激活剂含量增加，测
试的OD值上升，证明凝血因子X激活剂对底物有轻微的水解作用。
因为粗毒和原液中存在凝血因子X激活剂，凝血因子X激活剂对
底物有轻微水解作用，使得不设置待测样品对照组的结果值偏大。本
实施例中设置待测样品对照组消除了待测样品中凝血因子十激活剂
对底物的水解作用导致的结果值偏高的影响，结果更准确。同时，设
置待测样品对照组还可用于检测凝血因子X激活剂原液中磷脂酶A2
的活性。
实施例2 方法验证
1、准确性
由三位分析人员同时对活性为50、90、130U/ml的三个待测样品
进行检测(按照设置对照组方法)，每人每个样品检测3天。共9次重
复实验计算回收率评价方法准确性。
表5 准确性(加标回收率)考察结果
由表5结果可知，本发明方法在低中高浓度时测试结果均有较好
的准确性，加标回收率在83-108％之间。
对比试验MATTHEW HOLZER方法的加标回收率为50％左右。
2、精密度
2.1重复性
一名实验员测定低中高浓度(50、90、130U/ml)待测样品(按
照设置对照组方法)，共重复6次的实验结果，计算RSD，用于评价方
法的重复性。
表6 重复性考察结果
由表6结果可知，方法具有良好的重复性，RSD小于10％。
2.2中间精密度
三名实验员在不同日期测定低中高浓度(50、90、130U/ml)待
测样品(按照设置对照组方法)，每人重复3次，共9次实验结果，计
算RSD，用于评价方法的中间精密度。
表7 中间精密度考察结果
由表7结果可知，方法中间精密度良好，RSD小于10％。
综上结果，本发明的低中高浓度待测样品RSD均小于10％。与《生
物制品质量控制分析方法验证技术一般原则》中酶活性检测方法的精
密度要求小于20％相比，本发明具有很好的精密度。
3、线性与范围
由图2结果可知，本方法磷脂酶A2活性在20-180U/mL之间时线性
良好，R2＝0.998>0.990。
对比试验MATTHEW HOLZER方法的吸光度值与反应浓度关系
图(图3)及其标准曲线(图4)显示，对比试验检测线较高，大于
100U/mL，剔除250U/mL点后，线性系数R2＝0.986<0.99。
4、终止反应后30分钟内测试结果
按照实施例1操作(设置待测样品对照)，反应终止后，不同时间
检测结果如表8：
表8 终止反应后30分钟内测试磷脂酶A2活性结果
由结果可知，本发明的检测方法在反应终止30min内测试，不同
时间测试的结果RSD不超过2％。
对比试验MATTHEW HOLZER方法在不同的测试时间内测定吸
光度值，各个浓度的标准品测试吸光度值一直在上升(图5)。对比试
验的终止液Triton X-100没有完全终止反应，甚至有文献中提到去污
剂对其活力有促进作用(王志清等.广西产眼镜蛇毒酸性磷脂酶A2的
分离纯化及性质研究[J].蛇志.1999,11(4):12-17)。该方法水浴20min并
没有脱离延迟期。且表面活性剂Triton X-100的加入会使体系产生大
量气泡影响实验操作。
实施例3：改变缓冲溶液的磷脂酶A2活性测定
操作同实施例1步骤1-3中设置待测样品对照组的步骤，数据处
理方法同实施例1步骤4检测结果中的方法处理，区别在于：
所述标准品与待测样品管中缓冲溶液为180mM Tris-HCl、30mM
CaCl2、250mM NaCl、pH8.0的缓冲溶液，所述待测样品对照管中缓
冲溶液为180mM Tris-HCl、250mM NaCl、pH8.0的缓冲溶液，底物
浓度为7.5mM，水浴温度为40摄氏度，反应时间为30分钟，所述有
机溶剂为乙腈。
得到标准曲线如图6所示，其R2＝0.997。从标准曲线可知，本实
施例活性检测方法的线性在20～180U/ml范围内。
表9中的OD值为待测样品管测试结果减去对应的待测样品对照
结果后的平均值，带入标准曲线，计算磷脂酶A2活性，得到检测结
果如下：
表9 设置对照组后的样品测定结果
由结果可知，测定的高中低浓度粗毒的磷脂酶A2活性分别为
195.00、148.65、90.53U/mL。原液测定结果未超过20U/mL标准品点，
即活性不超过20U/mL。
同理，对实施例2中的方法进行方法学验证，操作方式参照实施
例2：
1)准确性：测得的加标回收率在80-110％之间，说明实施例3中
的方法有较好的准确度；
2)精密度：重复性及精密度测定的RSD均小于10％，说明实施
例3中的方法重复性和精密度良好。
实施例4 改变缓冲溶液及反应条件的磷脂酶A2活性测定
操作同实施例1步骤1-3中设置待测样品对照组的步骤，数据处
理方法同实施例1步骤4检测结果中的方法处理，区别在于：
所述标准品与待测样品管中缓冲溶液为300mM Tris-HCl、18mM
CaCl2、150mM NaCl、pH8.0的缓冲溶液；所述待测样品对照管中缓
冲溶液为300mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0的缓冲溶液，底物
浓度为15mM，水浴温度为50摄氏度，反应时间为40分钟，所述有
机溶剂为Cr离子溶液。
得到标准曲线如图7所示，其R2＝0.995。从标准曲线可知，本实
施例活性检测方法的线性在20～180U/ml范围内。
表10中的OD值为待测样品管测试结果减去对应的待测样品对
照结果后的平均值，带入标准曲线，计算磷脂酶A2活性，得到检测
结果如下：
表10 设置对照组后的样品测定结果
由结果可知，测定的高中低浓度粗毒的磷脂酶A2活性分别为
165.62、121.814、65.522U/mL。原液测定结果未超过20U/mL标准品
点，即活性不超过20U/mL。
同理，对实施例2中的方法进行方法学验证，操作方式参照实施
例2：
1)准确性：测得的加标回收率在80-110％之间，说明实施例4中
的方法有较好的准确度；
2)精密度：重复性及精密度测定的RSD均小于10％，说明实施
例4中的方法重复性和精密度良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详
尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本
领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础
上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。