基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法技术领域
本发明涉及疾病检测技术领域，更具体的是涉及一种基于胰蛋白酶荧光底物检测
卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备方法。
背景技术
近年来，随着人们的生活方式发生了急剧变化，精神压力也不断增大，我国肿瘤的
发病率逐年攀升。其中，卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位，与乳腺癌不同，卵巢癌早期缺
乏明显症状和有效筛查，生存率低。卵巢癌的肿瘤标志物根据其组织病理类型可分为多种
亚型，其中上皮来源性肿瘤是最为常见的类型，现有肿瘤标志物大多也与卵巢上皮性癌密
切相关，如CA125和人类附睾蛋白4(HE4)等。健康人群血清CA125含量很低，健康成人血清
CA125浓度上限为35kU/L。CA125是重要的卵巢癌相关抗原，联合经阴道盆腔超声或其他标
志物可以提高早期筛查特异性；CA125可用于鉴别良恶性卵巢包块，绝经后女CA125>95kU/
L，阳性预测值达95％；此外，CA125是观察疗效、判断有无复发的良好指标。世界卫生组织已
经作出最新的权威性的结论，恶性肿瘤患者如果能在发病早期发现，治愈率可以达到80％
以上，所以肿瘤的早期诊断与治疗已经成为近年来研究的热点。
由于酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)具有快
速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。随着方法的不断改
进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单
克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA
检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之
一。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110是一种双酰胺衍生物的罗丹明110
(R110)分子探针，是一个敏感的和有选择性的测定蛋白酶在溶液中或在活细胞内底物。这
些荧光底物含有一种氨基酸或肽共价连接到每个R110的氨基，酶裂解后，非荧光双酰胺底
物转化首先对荧光单酰胺然后R110，在荧光的进一步增加。使用荧光酶标仪基板可用于连
续测量细胞提 取物中的酶活性和纯化的酶制剂，或用于细胞内蛋白酶的检测与分析，流式
细胞仪和荧光显微镜等。目前荧光检测因具有优异的光学性质已经被广泛应用于示踪、成
像以及标记等方面，而ELISA则因为它的灵敏度高、特异性强等优点在检测领域处于特殊重
要的地位。所以本文拟研制基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免
疫试剂盒，对卵巢癌肿瘤标志物CA125进行检测，灵敏度提升了将近10000倍。
发明内容
鉴于蛋白标志物在肿瘤检测中的重要地位、荧光检测独特的光学性质以及酶联免
疫检测技术的优势。我们将结合酶联免疫检测和荧光检测两种技术，利用胰蛋白酶和肿瘤
标志物相应抗体Ab2制得检测探针。探针、肿瘤标志物和包埋在酶联免疫ELISA试剂盒的另
一种肿瘤标志物抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹心的结构，最后通过酶
和荧光底物的作用产生荧光，对CA125这种卵巢癌相关肿瘤标志物进行定性定量的检测，建
立蛋白标志物检测的新方法，极大程度提高了检测灵敏度。
本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试
剂盒，其特征是选用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110特异性降解产生的荧光对卵
巢癌肿瘤标志物CA125进行定量检测，其结构式如下：
本发明的技术方案如下：
一种基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试剂盒制备
方法；其步骤如下：
1)将新配制的高碘酸钠NalO4溶液加入到胰蛋白酶Trypsin溶液中，室温下避光搅
拌后，用醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加入碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0～9.3，立即
加入CA125标记抗体Ab2，室温下避光搅拌后加入少量硼氢化钠NaBH4充分反应后用PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，静置过夜处理后用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入BSA封闭处理后再次用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，之后加入标准CA125抗原
缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入上述酶联检测探针Trypsin-Ab2， 用洗
涤缓冲液冲洗96孔酶标板，最后加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标
仪读取96孔酶标板荧光强度值。
所述醋酸盐缓冲液是0.01M pH4.4的缓冲液；碳酸盐缓冲液是0.2M pH9.5的缓冲
液；PBS缓冲液是0.15M pH7.4的缓冲液。
所述胰蛋白酶：高碘酸钠质量比为1:0.8～1.2；胰蛋白酶：CA125标记抗体质量比
为1:1～5；胰蛋白酶：硼氢化钠质量比为15:1。
所述CA125包被抗体Ab1浓度为10～50μg/mL。
所述洗涤缓冲液是含有0.05～0.5％Tween-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液。
所述检测原理是根据胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110降解产生的荧光强
度值和CA125标准抗原浓度之间的关系，定性定量检测卵巢癌肿瘤标志物CA125。
通过高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接，得到酶联检
测探针Trypsin-Ab2。将CA125包被抗体Ab1加入96孔酶标板，4℃过夜后用洗涤缓冲液洗涤
96孔酶标板，加入BSA 37℃封闭处理后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，在96孔酶标板加入
待检样品37℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入上述Trypsin-Ab2检测探针37
℃下反应后用洗涤缓冲液洗涤96孔酶标板，加入胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，
最后用荧光酶标仪读数。如果检测样品有CA125抗原Ag存在，探针Trypsin-Ab2、CA125抗原
Ag和包埋在96孔酶标板上的CA125包被抗体Ab1通过抗体抗原之间的作用，形成一种类似夹
心的结构Trypsin-Ab2-Ag-Ab1，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110在酶的作用下
降解产生荧光；如果检测样品没有CA125抗原Ag存在，则96孔酶标板的检测探针Trypsin-
Ab2将被洗涤缓冲液清洗，此时胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110不会降解，没有荧光
出现。在96孔酶标板上加入不同浓度的标准CA125抗原，建立标准曲线，定性定量检测卵巢
癌肿瘤标志物CA125。
本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免疫试
剂盒优势在于：
1.采用胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110这种具有优异的光学性质的双酰
胺衍生物的罗丹明110(R110)分子探针，通过酶的放大作用，将极大的提高检测灵敏度，降
低检测非特异性吸附。
2.采用酶联免疫检测ELISA这种具有灵敏度高、特异性强等优点的传统检测技术，
有利于调高检测效率。
3.采用高碘酸钠NalO4作用将CA125记抗体Ab2和胰蛋白酶Trypsin连接得到酶联检
测探针Trypsin-Ab2，夹心结构降解荧光底物产生的荧光强度，定性定量检测卵巢癌肿瘤标
志物CA125，有效地降低了检测荧光背景。
如图1所示，胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110酶裂解后，非荧光双酰胺底
物率先转化为一对弱荧光的单酰胺，然后转化为强荧光的R110，荧光进一步增加，实现超灵
敏检测。如图2所示，根据荧光酶标仪可知加入不同浓度标准CA125抗原所得荧光强度分别
是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623；图3紫外照片也可以看出随着
CA125抗原浓度的增加酶标板孔荧光强度依次增加。
附图说明
图1本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免
疫试剂盒底物降解图。
图2本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免
疫试剂盒荧光值曲线。
图3本发明制备的基于胰蛋白酶荧光底物检测卵巢癌肿瘤标志物CA125的酶联免
疫试剂盒紫外激发照片。
具体实施方式
下面的实施案例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施案例1：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(21.39mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶
Trypsin溶液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处
理，通过加入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记
抗体Ab2，室温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M
PH7.4PBS缓冲液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，
最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧
光强度值。
实施案例2：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶
液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加
入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室
温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，
最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧
光强度值。
实施案例3：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(30mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶
液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加
入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室
温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，
最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧
光强度值。
实施案例4：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶
液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加
入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.2，立即加入5mg CA125标记抗体Ab2，室
温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(10μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，
最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧
光强度值。
实施案例5：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶
液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加
入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.3，立即加入25mg CA125标记抗体Ab2，室
温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(50μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(50mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后加入100μL CA125标准抗原缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔
酶标板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，
最后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧
光强度值。
实施案例6：
1)将新配制的0.2mL高碘酸钠NalO4溶液(20mg/mL)加入到1mL胰蛋白酶Trypsin溶
液(5mg/mL)中，室温下避光搅拌20min后，用1mM PH4.4醋酸盐缓冲液透析过夜处理，通过加
入20μL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液使体系pH达到9.0，立即加入10mg CA125标记抗体Ab2，室
温下避光搅拌2h后加入0.1mL硼氢化钠NaBH4(4mg/mL)充分反应后用0.15M PH7.4PBS缓冲
液透析过夜，得到酶联检测探针Trypsin-Ab2；
2)将100μL CA125包被抗体Ab1(24μg/mL)加入96孔酶标板，4℃静置过夜处理后用
洗涤缓冲液冲洗96孔酶标板，加入300μL BSA(10mg/mL)37℃封闭1h处理后再次用洗涤缓冲
液冲洗96孔酶标板，之后每孔加入100μL CA125标准抗原的浓度分别为100U/mL、10U/mL、
1U/mL、0.1U/mL、0.01U/mL、0.001U/mL、0U/mL，缓慢摇晃孵育，用洗涤缓冲液冲洗96孔酶标
板，加入100μL上述酶联检测探针Trypsin-Ab2稀释液，用洗涤 缓冲液冲洗96孔酶标板，最
后加入100μL胰蛋白酶荧光底物(CBZ-Ala-Arg)2-R110，用荧光酶标仪读取96孔酶标板荧光
强度值。建立标准曲线。
如图2所示，根据荧光酶标仪可知加入不同浓度标准甲胎蛋白抗原所得荧光强度
分别是194335、284399、302187、316222、349462、374451、421623 。