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1、10申请公布号CN104107423A43申请公布日20141022CN104107423A21申请号201410246465522申请日20140605A61K38/45200601A61P35/00200601A61K31/12220060171申请人华中科技大学地址430074湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号72发明人红凌74专利代理机构华中科技大学专利中心42201代理人廖盈春54发明名称维生素K2及其生物合成酶在制备抗膀胱癌药物中的应用57摘要本发明公开了一种维生素K2及其生物合成酶在制备抗膀胱癌药物中的应用。维生素K2及其医学上可接受的盐或维生素K2的生物合成酶应用于抗膀胱癌药物。
2、的制备。由于维生素K2作为一种天然存在的物质可以直接通过细胞膜被人体吸收，直接发挥作用。同时，因为维生素K2是天然存在的，可以提取，使用成本较低，并且无其他副作用，对人体损伤很小，综合考虑适合于作为治疗膀胱癌的新药物。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图3页10申请公布号CN104107423ACN104107423A1/1页21维生素K2及其医学上可接受的盐或维生素K2的生物合成酶应用于抗膀胱癌药物的制备。2如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述维生素K2的生物合成酶为UBIAD1蛋白。权利要求书CN10。
3、4107423A1/5页3维生素K2及其生物合成酶在制备抗膀胱癌药物中的应用技术领域0001本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及维生素K2及其生物合成酶在制备抗膀胱癌药物中的应用。背景技术0002据有关资料报道，膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤第九位。膀胱癌分为表浅性和浸润性两大分支，前者80会出现局部复发，但转移率低于10，后者有5080会发生转移。0003近年来，浸润性膀胱癌的治疗有很大的进展，目前对浸润性膀胱癌的治疗大多采用根治性全膀胱切除及尿流改造术，部分膀胱癌切除等。以手术为主，放疗和化疗为辅，但这些方法存在创伤较大、副作用明显和患者耐受性低等问题。发明内容000。
4、4针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种维生素K2及其生物合成酶在制备抗膀胱癌药物中的应用，其目的在于通过测定维生素K2及其生物合成酶的细胞毒性及抗膀胱癌活性，开发一种安全有效的抗膀胱癌药物活性成分。0005为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了维生素K2及其医学上可接受的盐或维生素K2的生物合成酶应用于抗膀胱癌药物的制备。0006优选地，所述维生素K2的生物合成酶为UBIAD1蛋白。0007总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于维生素K2作为一种天然存在的物质可以直接通过细胞膜被人体吸收，直接发挥作用。同时，因为维生素K2是天然存在的，可以提取，使用成。
5、本较低，并且无其他副作用，对人体损伤很小，综合考虑适合于应用于抗膀胱癌药物的制备。维生素K2医学上可接受的盐，经吸收后在体内形成维生素K2，作用效果相同，维生素K2的生物合成酶，如UBIAD1蛋白，经吸收或转染后，能将从植物中吸取的维生素K1转化成为维生素K2，因此具有相似的抗膀胱癌活性。因此维生素K2医学上可接受的盐、维生素K2的生物合成酶，均可应用于制备抗膀胱癌药物附图说明0008图1是实施例1维生素K2抗膀胱癌活性MTT检测结果图0009其中，图1A是T24细胞在不同VK2剂量下24H培养细胞活性图；图1B是T24细胞在不同VK2剂量下48H培养细胞活性图；图1C是J82细胞在不同VK2。
6、剂量下24H培养细胞活性图；图1D是J82细胞在不同VK2剂量下48H培养细胞活性图；0010图2是实施例1维生素K2抗膀胱癌活性流式细胞仪分析结果图0011其中，图2A是T24细胞在在未处理条件下48H培养细胞凋亡散点图；图2B是T24细胞在25UMVK2剂量下48H培养细胞凋亡散点图；图2C是J82细胞在未处理条件下48H培养细胞凋亡散点图；图2D是J82细胞在25UMVK2剂量下48H培养细胞凋亡散点图；说明书CN104107423A2/5页40012图3是实施例2中L02细胞在不同VK2剂量下24H培养细胞活性0013图4是实施例3中UBIAD1转染膀胱癌T24细胞活性图。0014图5。
7、是实施例4中UBIAD1转染HEK293细胞的活性图0015在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中具体实施方式0016为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。0017现今治疗膀胱癌主要采取手术和化疗，都会对人体产生重大损伤，且术后有复发的危险。为了克服当前治疗膀胱癌的传统方法带来的副作用，本发明提供了一种生物小分子维生素K2及其生物合成酶应用于抗膀胱癌药。
8、物的制备，首先对维生素K2及其生物合成酶进行了抗膀胱癌活性实验，然后对维生素K2及其生物合成酶进行了细胞安全性实验。并经过后续研究，解读了维生素K2及其前体抗膀胱癌原理。0018维生素K2及其前体抗膀胱癌活性实验，包括以下步骤001911将实验用膀胱癌细胞进行体外培养；002012用不同浓度的维生素K2或其前体处理步骤11中培养的细胞；002113统计经不同浓度维生素K2或其生物合成酶处理的细胞的存活率；002214根据步骤13的结果，绘制维生素K2或其生物合成酶的抗膀胱癌活性检测结果图。0023维生素K2及其生物合成酶细胞安全性实验，包括以下步骤002421将实验用体细胞进行体外培养；002。
9、521用不同浓度的维生素K2或其生物合成酶处理步骤11中培养的细胞；002623统计经不同浓度维生素K2或其生物合成酶处理的细胞的存活率；002724根据步骤23的结果，绘制维生素K2或其生物合成酶的细胞安全性检测结果图。0028实验证实维生素K2及其生物合成酶的添加或转染，对于实验用膀胱癌细胞具有明显的抑制效果。同时维生素K2作为一种天然存在的物质可以直接通过细胞膜被人体吸收，直接发挥作用。因为维生素K2是天然存在的，可以提取，使用成本较低，并且无其他副作用，对人体损伤很小，综合考虑适合于作为治疗膀胱癌的新药物。0029维生素K2通过JNK通路促进抑癌基因P53的表达，P53的大量表达会快速。
10、诱促并产生有促进凋亡作用的PUMA蛋白。PUMA蛋白不仅能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,还能增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性,是非常有前景的肿瘤基因治疗靶点。同时会激活PARR修复酶，共同调节细胞凋亡。0030由于UBIAD1蛋白等维生素K2的生物合成酶，其添加，能促进合成的维生素K2，因此具有抑制膀胱癌的效果。0031以下为实施例0032实施例1维生素K2抗膀胱癌活性实验说明书CN104107423A3/5页5003311将膀胱癌细胞株J82和T24用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000个细胞接种到96孔板，每孔体积200UL，培养至细胞贴壁。00341。
11、2向步骤11中培养的细胞，分别加入5UM,10UM，25UM，50UM，100UM的维生素K2于细胞培养液中，并设计空白对照UNTREATED，培养24小时和48小时后进行检测。003513统计经不同浓度维生素K2或其前体处理的细胞的存活率0036采用MTT技术检测细胞存活率0037培养35天后，每孔加MTT溶液5MG/ML用PBS配制，PH7420UL，继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ULDMSO二甲基亚砜，振荡10MIN，使结晶物充分融解。比色检测细胞浓度选择490NM波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结。
12、果。0038采用流式细胞仪技术检测细胞存活率0039将步骤12中培养的细胞其细胞悬液加入2ML圆底离心管中，转速1500RPM离心5分钟，弃去上清液后加入PBS缓冲液1ML离心洗涤1次，再加入2ML预冷的70酒精，4固定30MIN，或是20固定过夜，获得固定的细胞悬液。将固定的细胞悬液离心，弃去上清液并洗涤后加入RNASEA工作浓度20UG/ML于500UL1PBS中，37孵育30MIN，再次洗涤1次后加入PI工作浓度50UG/ML于500UL1PBS中，室温避光孵育30MIN，混匀后过300目筛网，置流式管中，4冰箱保存，及流式细胞仪待测样品，用流式细胞仪进行分析。004024根据步骤23的。
13、结果，绘制维生素K2或其生物合成酶的细胞安全性检测结果图。0041绘制维生素K2抗膀胱癌活性检测结果图，如图1所示。用流式细胞仪进行分析该样品结果如图2所示。0042由图1可知，MTT检测结果说明在细胞水平上能够说明维生素K2对于膀胱癌细胞具有明显强烈的抑制作用。流式细胞仪检测结果如图2所示，图2的每个子图中，第一象限代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞；第二象限代表晚期凋亡细胞；第三象限代表活细胞；第四象限代表早期凋亡细胞。图2B和图2D中第二象限内的散点明显多于图2A和图2C，图2B和图2D中第三象限内的三点明显少于图2A和图2C，说明对于T24细胞和J82细胞，维生素K2具有明显的促进细胞。
14、凋亡的作用。综上所述，维生素K2在细胞水平上表现出明显的抗膀胱癌作用，可推知在个体水平上也能达到治疗癌症的效果。0043实施例2维生素K2细胞安全性实验004421将正常肝细胞L02细胞按照实施例1中步骤11的培养方法进行体外培养；004521向步骤21中培养的细胞，分别加入5UM,10UM，25UM，50UM，100UM的维生素K2于细胞培养液中，并设计空白对照，培养24小时和48小时后进行检测。004623采用MTT技术检测细胞存活率培养35天后，每孔加MTT溶液5MG/ML用PBS配制，PH7420UL，继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培。
15、养上清液。每孔加150ULDMSO二甲基亚砜，振荡10MIN，使结晶物充分融解。比色检测细胞浓度选择490NM波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。004724根据步骤23的结果，绘制维生素K2或其生物合成酶的细胞安全性检测说明书CN104107423A4/5页6结果图，如图3所示。0048结果由图3可知，在100UM的剂量下，L02细胞活性几乎没有影响。据此，可以说明维生素K2的安全性是没有问题的。说明维生素K2在细胞水平上几乎没有毒性，可推论在个体水平上安全性高。0049实施例3维生素K2生物合成酶UBIAD1蛋白抗膀胱癌活性实验005011将实验用膀胱癌细胞进行体外培养；0。
16、051将膀胱癌细胞株T24细胞在孔培养板上培养,向每孔中加入2ML含105个细胞的培养基,37,18CO2培养基，培养至4060汇合时。005212用UBIAD1基因转染步骤11中培养的细胞；0053每孔细胞，按照如下操作转染配制转染A液用不含血清培养基稀释UBIAD1基因的DNA，使其浓度为在1UG至10UG之间；配制转染B液，用不含血清培养基稀释脂质体，使其浓度在2UG至50UG之间；取A转染A液100UL和转染B液100UL，轻轻混合，室温下放置10至15分钟，出现微浊现象，即制得转染液；将多孔板中培养的一份细胞用2ML不含血清培养基漂洗2次,再加入1ML不含血清培养基后，缓慢加入转染液。
17、摇匀，37下反应6至24小时，吸除转染液，置于培养基中继续培养。005413统计经用UBIAD1基因转染的细胞的存活率；0055采用MTT技术检测细胞存活率每孔加MTT溶液5MG/ML用PBS配制，PH7420UL，继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ULDMSO二甲基亚砜，振荡10MIN，使结晶物充分融解。比色检测细胞浓度选择490NM波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。005614根据步骤13的结果，UBIAD1基因抗膀胱癌活性检测结果图。0057分别检测正常组、副对照组不加UBIAD1基因DNA，其他转。
18、染步骤相同的实验组和转染组的细胞存活率，制作对比图如图4所示。由图4可知采用MTT分析转染UBIAD1后膀胱癌细胞的活性，在细胞水平上能够说明UBIAD1对于膀胱癌细胞具有明显强烈的抑制作用。0058实施例4维生素K2生物合成酶UBIAD1蛋白细胞安全性实验005921将正常体细胞HEK293受体细胞进行体外培养；0060将正常体细胞HEK293受体细胞在孔培养板上培养,向每孔中加入2ML含105个细胞的培养基,37,18CO2培养基，培养至4060汇合时。006122用UBIAD1基因转染步骤21中培养的细胞；0062每孔细胞，按照如下操作转染配制转染A液用不含血清培养基稀释UBIAD1基因。
19、的DNA，使其浓度为在1UG至10UG之间；配制转染B液，用不含血清培养基稀释脂质体，使其浓度在2UG至50UG之间；取A转染A液100UL和转染B液100UL，轻轻混合，室温下放置10至15分钟，出现微浊现象，即制得转染液；将多孔板中培养的一份细胞用2ML不含血清培养基漂洗2次,再加入1ML不含血清培养基后，缓慢加入转染液摇匀，37下反应6至24小时，吸除转染液，置于培养基中继续培养。006323统计经用UBIAD1基因转染的细胞的存活率；0064采用MTT技术检测细胞存活率每孔加MTT溶液5MG/ML用PBS配制，PH说明书CN104107423A5/5页77420UL，继续孵育4小时，终。
20、止培养。小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ULDMSO二甲基亚砜，振荡10MIN，使结晶物充分融解。比色检测细胞浓度选择490NM波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。006524根据步骤23的结果，UBIAD1蛋白抗膀胱癌活性检测结果图。0066如图5所示，相对于空白对照组UNTREATED，不进行转染操作，质粒单独使用对照PCDNA31，转染操作步骤仅使用A液，且A液仅含PCDNA31质粒，不带有UBIAD1蛋白、脂质体单独使用对照LIPO，转染操作仅使用B液以及转染组UBIAD1无明显抑制作用。结论采用MTT分析转染UBIAD1后HEK293细胞的活性，在细胞水平上能够说明UBIAD1对于正常细胞没有抑制作用。0067本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104107423A1/3页8图1说明书附图CN104107423A2/3页9图2图3说明书附图CN104107423A3/3页10图4图5说明书附图CN104107423A10。