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1、10申请公布号CN104130320A43申请公布日20141105CN104130320A21申请号201410346982X22申请日20140721C07K14/415200601C12N15/29200601C12N15/10200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人南阳师范学院地址473000河南省南阳市卧龙区卧龙路1638号72发明人杜丽李勇鹏姚瑶张力维74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称香樟低温诱导CBFLIKE转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用57摘要本发明公开一种香樟低温诱导CBFLIKE。
2、转录因子包括CCCBFA基因和CCCBFB基因及其编码的氨基酸序列，CCCBFA基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示；CCCBFB基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。利用香樟CCCBFA和CCCBFB基因构建植物表达载体，通过遗传转化可获得抗逆性改良，特别是抗寒性改良的转基因新种质。本发明的内容对了解CBF基因在植物抗冷和其他逆境因子中的作用，对园林树木抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。51INTCL权利要求书3页说明书12页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书12页10申请公布号CN104130320ACN104130320A1/3页21一种香樟低温诱。
3、导CBFLIKE转录因子，其特征在于，包括香樟低温诱导CBFLIKE转录因子ACCCBFA基因和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子BCCCBFB基因，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A的核苷酸序列如SEQIDNO1所示；所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。2一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的编码蛋白，其特征在于，包括香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO3所示，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白的氨基。
4、酸序列如SEQIDNO4所示。3一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的克隆方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASYSPINPLUS植物RNA快速提取试剂盒提取香樟总RNA，所提RNA加入3050ULDEPC处理水，充分溶解后于80保存；步骤2、反转录PCR；步骤3、香樟CBF基因的3/5RACE克隆，并用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；其中，香樟CBF基因的3/5RACE克隆的反应条件为UPMUPL10UM2ULUPS10UM10ULDDH2O38ULA反应体系为50ULB反应条件94预变性4MIN；5个循环；30个循环；72总延伸10MIN；分别取上述。
5、PCR产物1UL溶于49ULDDH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板TEMPLATE；C3/5RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50UL权利要求书CN104130320A2/3页3D巢式PCR反应条件94预变性4MIN；35个循环；72总延伸10MIN；步骤4、PCR产物的胶回收，具体为琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；步骤5、PCR产物的克隆，AT克隆；步骤51、回收的目的产物与TAKARA公司生产的PMD19TVECTOR16连接过夜，反应体系如下步骤52、大肠杆菌感受态细胞的转化将上述连接产物加于50ULTRANS5大肠杆菌感受态细胞。
6、中，轻轻混匀，冰浴30MIN，42热激90S，冰浴5MIN，缓慢加入400UL新鲜液体LB，37，180RPM50MIN，吸取100UL菌液涂于添加有AMP100MG/L的LB平板上，置于37恒温培养箱中，倒置过夜培养1216H；步骤6、阳性重组子的筛选及鉴定；随机挑取上述转化平板中的阳性菌以PMD19T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于10琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ML添加有AMP100MG/L的液体LB中摇菌培养，送往生工生物工程上海股份有限公司测序，将测序结果进行拼接，从而获得2个香樟CBFLIKE基因的全长CDNACCCBFA和CCC。
7、BFB序列，其核苷酸序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO2；步骤7、对步骤6中的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B使用DNAMAN分子软件分析，得香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白序列权利要求书CN104130320A3/3页4和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白序列，其氨基酸序列分别为SEQIDNO3和SEQIDNO4。4根据权利要求2所述的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的克隆方法，其特征在于，通过RACE技术采用于下述的引物，获得所述基因的3及5核苷酸序列，拼接后获得2个香樟CBFLIKE基因的全长CDNA序列CCCBF。
8、3GSP1TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示；CCCBF3GSP2TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如SEQIDNO6所示；CCCBF5GSP1ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如SEQIDNO7所示；CCCBF5GSP2ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如SEQIDNO8所示；。5一种如权利要求1所述的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。权利要求书CN104130320A1/12页5香樟低温诱导CBFLIKE转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用技术领域。
9、0001本发明属于分子生物学及园林植物育种技术领域，具体涉及一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用。背景技术0002樟树又名香樟、乌樟，樟科樟属CINNAMOMUMCAMPHORAL；其树冠广展，浓荫遍地，气势雄伟，是优良的行道树及庭荫树；香樟在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，香樟被引种栽植到黄河流域的一些省分。然而北方漫长而寒冷冬季往往导致香樟生长受损，严重时甚至树体死亡，造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在。
10、北方城市顺利推广及应用的一个亟待解决的问题，解决这一问题的主要方法可采取加强栽培管理和选育抗寒新品种，而后者是根本途径，但目前没有相关报道。发明内容0003本发明的目的是提供香樟低温诱导CBFLIKE转录因子，具体涉及2个香樟抗逆相关的低温诱导CBFLIKE转录因子AGENBANK登录号为KJ958932和BGENBANK登录号为KJ958933CINNNAMOMUMCAMPHORACBFLIKETRANSCRIPTIONFACTOR,CCCBFAANDCCCBFB基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研究香樟CBFLIKE基因的功能，以及CBF基因改良作物抗逆性，特别是改良抗寒性的应用。
11、奠定良好的基础。0004本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的编码蛋白。0005本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的克隆方法。0006本发明的另一目的是提供一种上述的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。0007本发明所采用的第一技术方案是，一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子，包括香樟低温诱导CBFLIKE转录因子ACCCBFA基因和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子BCCCBFB基因，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A的核苷酸序列如SEQIDNO1所示；所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B的。
12、核苷酸序列如SEQIDNO2所示。0008本发明所采用的第二技术方案是，一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子编码蛋白，包括香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO3所示，所述香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO4所示。0009本发明所采用的第三技术方案是，一种香樟低温诱导CBFLIKE转录因子的克隆方法，具体按照以下步骤实施0010步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASYSPINPLUS植物RNA快速提取试剂盒提取说明书CN104。
13、130320A2/12页6香樟总RNA，所提RNA加入3050ULDEPC处理水，充分溶解后于80保存；0011步骤2、反转录PCR；0012步骤3、香樟CBF基因的3/5RACE克隆，并用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；0013其中，香樟CBF基因的3/5RACE克隆的反应条件为0014UPMUPL10UM2ULUPS10UM10ULDDH2O38UL0015A反应体系为50UL00160017B反应条件001894预变性4MIN；5个循环；30个循环；72总延伸10MIN。0019分别取上述PCR产物1UL溶于49ULDDH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板TEMPLATE。0020。
14、C3/5RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50UL0021说明书CN104130320A3/12页70022D巢式PCR反应条件002394预变性4MIN；35个循环；72总延伸10MIN；0024步骤4、PCR产物的胶回收，具体为琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；0025步骤5、PCR产物的克隆，AT克隆；0026步骤51、回收的目的产物与TAKARA公司生产的PMD19TVECTOR16连接过夜，反应体系如下00270028步骤52、大肠杆菌感受态细胞的转化0029将上述连接产物加于50ULTRANS5大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30。
15、MIN，42热激90S，冰浴5MIN，缓慢加入400UL新鲜液体LB，37，180RPM50MIN，吸取100UL菌液涂于添加有AMP100MG/L的LB平板上，置于37恒温培养箱中，倒置过夜培养1216H；0030步骤6、阳性重组子的筛选及鉴定；随机挑取上述转化平板中的阳性菌以PMD19T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于10琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ML添加有AMP100MG/L的液体LB中摇菌培养，送往上海生工生物工程有限公司测序，从而获得2个香樟CBFLIKE基因的全长CDNACCCBFA和说明书CN104130320A4/12页8C。
16、CCBFB序列，其核苷酸序列分别为SEQIDNO1和SEQIDNO2；0031步骤7、对步骤6中的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B使用DNAMAN分子软件分析，得香樟低温诱导CBFLIKE转录因子A编码蛋白序列和香樟低温诱导CBFLIKE转录因子B编码蛋白序列，其氨基酸序列分别为SEQIDNO3和SEQIDNO4。0032本发明的特点还在于，0033用于扩增香樟CBFLIKE基因全长CDNA序列所用的引物0034CCCBF3GSP1TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示；0035CCCBF3GSP2TCTGCTAG。
17、CGCCAAGGACAT，其核苷酸序列如SEQIDNO6所示；0036CCCBF5GSP1ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如SEQIDNO7所示；0037CCCBF5GSP2ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如SEQIDNO8所示。0038本发明所采用的第四技术方案是，如上述的香樟低温诱导CBFLIKE转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。0039本发明的有益效果是本发明所获得的2个香樟CBFLIKE基因是利用同源克隆的方法获得香樟CBF基因的一段核心片段序列，结合RACE技术获得该基因的3及5核苷酸序列，进行拼接从而获得2个香樟CBFLI。
18、KE基因的全长CDNACCCBFA和CCCBFB序列，本发明的内容对了解CBF基因在植物抗冷和其他逆境因子中的作用，对园林树木抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。本发明的重要应用前景在于利用香樟CCCBFA和CCCBFB基因构建植物表达载体，通过遗传转化可获得抗逆性改良，特别是抗寒性改良的转基因新种质。具体实施方式0040下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，如无特别说明为常规方法。0041本发明的思想是很多植物在经历一段时间的非冰冻低温胁迫后，其对低温的耐性会得到提高，这一现象称为冷驯化COLDACCLIMATION，CA。冷驯化是植物长期进化的结果，当外界温度下降时，植物感受低温信号，。
19、引起许多基因表达的变化。在植物冷驯化过程中，CBF/DREB1CRT/DREBINDINGFACTOR是一种调控植物冷驯化相关基因表达的转录因子，它能感受上游传递的低温信号，在低温诱导下迅速合成，并与位于抗寒相关基因启动子上游的相应的顺式作用元件CRT/DRECREPEAT/DEHYDRATIONRESPONSIVEELEMENT结合，促进下游抗逆基因的转录，进而合成糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质，提高植物的耐寒性。CBF/DREB1转录因子能够在转录水平上能够调控多个抗逆基因，这一发现为用基因工程手段提高植物耐寒性提供了一条新途径。0042CBF途径在植物抵抗低温等逆境胁迫中具有非常重要的作。
20、用，对于香樟这种冷敏感植物，了解CBF基因在其抗冷和其他逆境因子中的作用，对香樟抗逆分子辅助育种具有非常重要的意义。因此，对香樟CBF基因的克隆，以及它们对低温等逆境因子的响应研究，是深入研究这些基因功能并在分子育种工作中加以利用的基础。本发明香樟低温诱导CBFLIKE转录因子CINNNAMOMUMCAMPHORACBFLIKETRANSCRIPTIONFACTOR,CCCBF属于DREB1/CBF家族，所编码的蛋白属于一种和低温诱导相关的CBF转录因子。到目前为止，还未见从香樟中克隆到CBF基因的相关报道，对该基因的功能还不清楚。本研究首次获得了2个香樟CBFLIKE基因核苷酸序列及其编码的。
21、氨基酸序列。在本发明的基础上，构建香说明书CN104130320A5/12页9樟CBFLIKE基因的植物表达载体，将其转入烟草和香樟中，可以对香樟CBFLIKE基因的功能进行分析，有助于进一步揭示该基因在植物抗寒过程中的功能，从而进行作物品种改良。0043实施例100441植物CBF基因进化分析0045所得香樟CCCBFA基因CDNA序列总长909BP，经DNAMAN分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为714BP，起始密码子ATG位于转录起始位点后72BP，终止密码子TAG后还有一段124BP的非编码序列，并带有真核生物典型的POLYA尾巴；该基因编码237个氨基酸，分子量为262。
22、KD，等电点PI为501HTTP/WEBEXPASYORG/COMPUTE_PI/。香樟CCCBFB基因CDNA序列总长941BP，经DNAMAN分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为729BP，起始密码子ATG位于转录起始位点后67BP，终止密码子TAG后还有一段146BP的非编码序列，同样带有真核生物典型的POLYA尾巴，该基因编码242个氨基酸，分子量为265KD，等电点PI为511HTTP/WEBEXPASYORG/COMPUTE_PI/。将所得香樟CCCBFA和CCCBFB所编码的核苷酸序列氨基酸序列在NCBI网站HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV，进行“PROTE。
23、INBLAST”分析，结果表明所得香樟CBFLIKE基因与杨树CBF序列最为相似，蛋白质结构中含有AP2结构域，属于AP2超家族中的DREB1/CBF家族。0046经NCBI网站对香樟2个基因进行序列比对分析，香樟CCCBFA和CCCBFB基因具有很高的核苷酸序列同源性，其同源性为83NUCLEOTIDEBLAST；2个基因的氨基酸序列同样具有较高的同源性，CCCBFA基因编码237个氨基酸，香樟CCCBFB基因编码242个氨基酸，2种蛋白有有88的氨基酸相同，相似性达91PROTEINBLAST。00472香樟总RNA的提取0048香樟总RNA的提取采用EASYSPINPLUS植物RNA快速。
24、提取试剂盒北京艾德莱公司说明书进行操作，涉及RNA的实验用枪头和离心管均为RNASEFREEAXYGEN公司。0049所提RNA加入3050ULDEPC处理水，充分溶解后于80保存。00503RTPCR反转录PCR0051参照SMARTERRACECDNAAMPLICATIONKITCLONTECH公司使用说明书，进行反转录，分别合成5RACEREADYCDNA和3RACEREADYCDNA；实验所用反转录酶为SMARTSCRIBETMREVERSETRANSCRIPTASECLONTECH公司，所用引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。0052RACE通用引物UPL、UPS、NUP由SMA。
25、RTERRACECDNAAMPLICATIONKIT提供CLONTECH公司。0053香樟CBFLIKE基因的全长CDNA序列，是用简并引物首先获得香樟CBFLIKE基因核心片段，根据核心片段设计了下列基因特异引物CC3GSP1、CC3GSP2、CC5GSP1、CC5GSP2，利用3/5RACERAPIDAMPLICATIONOFCDNAENDS技术获得0054用于扩增香樟CBFLIKE基因全长CDNA序列所用的引物0055CCCBF3GSP1TCGGCGTGGCTCTTGCCAAT，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示；0056CCCBF3GSP2TCTGCTAGCGCCAAGGACAT，其核。
26、苷酸序列如SEQIDNO6所示；0057CCCBF5GSP1ATGTCCTTGGCGCTAGCAGA，其核苷酸序列如SEQIDNO7所示；0058CCCBF5GSP2ATTGGCAAGAGCCACGCCGA，其核苷酸序列如SEQIDNO8所示。00594香樟CBF基因的3/5RACE克隆说明书CN104130320A6/12页100060UPMUPL10UM2ULUPS10UM10ULDDH2O38UL0061A反应体系为50UL00620063B反应条件006494预变性4MIN；5个循环；30个循环；72总延伸10MIN。0065分别取上述PCR产物1UL溶于49ULDDH2O中，充分溶解。
27、混匀，做巢式PCR的模板TEMPLATE。0066C3/5RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50UL0067说明书CN104130320A107/12页110068D巢式PCR反应条件006994预变性4MIN；35个循环；72总延伸10MIN。00705用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DL2000为TAKARA公司生产。00716PCR产物的胶回收0072琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，所用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒为北京艾德莱公司生产。00737PCR产物的克隆，AT克隆00741连接反应0075回收的目的产物与TAKARA公司生产的PMD19TVECTOR16连接过夜，反应。
28、体系如下007600772大肠杆菌感受态细胞的转化0078将上述连接产物加于50ULTRANS5大肠杆菌感受态细胞北京全式金公司中，轻轻混匀，冰浴30MIN，42热激90S，冰浴5MIN，缓慢加入400UL新鲜液体LB，37，180RPM50MIN，吸取100UL菌液涂于添加有AMP100MG/L的LB平板上，置于37恒温培养箱中，倒置过夜培养1216H。00793阳性重组子的筛选及鉴定0080随机挑取上述转化平板中的阳性菌以PMD19T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于10琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ML添加有AMP100MG/L的液体LB中。
29、摇菌培养，送往上海生工生物工程有限公司测序。生工生物工程上海股份有限公司00818测序结果经拼接获得香樟CBF基因的全长CDNA序列分析0082将测序结果进行拼接，从而获得2个香樟CBFLIKE基因的全长CDNACCCBFA和CCCBFB序列，所得香樟CCCBFA基因CDNA序列总长909BP，经DNAMAN分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为714BP，起始密码子ATG位于转录起始位点后72BP，终止密码子TAG后还有一段124BP的非编码序列，并带有真核生物典型的POLYA尾巴；该基因编码237个氨基酸，分子量为262KD，等电点PI为501HTTP/WEBEXPASYORG/。
30、COMPUTE_PI/。香樟CCCBFB基因CDNA序列总长941BP，经DNAMAN分子软件分析，该序列含有完整开放阅读框，ORF为729BP，起始密码子ATG位于转录起始位点后67BP，终止密码子TAG后还有一段146BP的非编码序列，同样带有真核生物典型的POLYA尾巴，该基因编码242个氨基酸，分子量为265KD，等电点PI为511HTTP/WEBEXPASYORG/COMPUTE_PI/。将所说明书CN104130320A118/12页12得香樟CCCBFA和CCCBFB所编码的核苷酸序列氨基酸序列在NCBI网站HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV，进行“PROTEINBLAST”分析，结果表明所得香樟CBFLIKE基因与杨树CBF序列最为相似，蛋白质结构中含有AP2结构域，属于AP2超家族中的DREB1/CBF家族。0083说明书CN104130320A129/12页130084说明书CN104130320A1310/12页140085说明书CN104130320A1411/12页150086说明书CN104130320A1512/12页16说明书CN104130320A16。