用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410346892.0	申请日：	2014.07.21
公开号：	CN104131091A	公开日：	2014.11.05
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20140721\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/68; C12N15/11	主分类号：	C12Q1/68
申请人：	思博奥科生物信息科技（北京）有限公司
发明人：	不公告发明人
地址：	北京市丰台区丰台科学城航丰路8号1幢楼1808室
优先权：
专利代理机构：		代理人：
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明属于生物技术领域，特别是基因突变的检测。更具体而言，本发明公开了检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的9组引物及使用其进行检测的方法。

权利要求书

1.  用于检测人类EGFR基因突变的引物，包括下列9组引物：
(1) G719S_OUT_FP: SEQ ID NO.1、
    G719S_OUT_RP: SEQ ID NO.2、
    G719S_IN_FP: SEQ ID NO.3、
    G719S_IN_RP: SEQ ID NO.4；
(2) G719C_OUT_FP: SEQ ID NO.1、
    G719C_OUT_RP: SEQ ID NO.2、
    G719C_IN_FP: SEQ ID NO.5、
    G719C_IN_RP: SEQ ID NO.6；
(3) G719A_OUT_FP: SEQ ID NO.7、
    G719A_OUT_RP: SEQ ID NO.8、
    G719A_IN_FP: SEQ ID NO.9、
    G719A_IN_RP: SEQ ID NO.10；
(4) Ex19-del_OUT_FP: SEQ ID NO.11、
    Ex19-del_OUT_RP: SEQ ID NO.12；
(5) S768I_OUT_FP: SEQ ID NO.13、
    S768I_OUT_RP: SEQ ID NO.14、
    S768I_IN_FP: SEQ ID NO.15、
    S768I_IN_RP: SEQ ID NO.16；
(6) T790M_OUT_FP: SEQ ID NO.17、
    T790M_OUT_RP: SEQ ID NO.18、
    T790M_IN_FP: SEQ ID NO.19、
    T790M_IN_RP: SEQ ID NO.20；
(7) Ex20-ins_OUT_FP: SEQ ID NO.21、
    Ex20-ins_OUT_RP: SEQ ID NO.22；
(8) L858R_OUT_FP: SEQ ID NO.23、
    L858R_OUT_RP: SEQ ID NO.24、
    L858R_IN_FP: SEQ ID NO.25、
    L858R_IN_RP: SEQ ID NO.26；
(9) L861Q_OUT_FP: SEQ ID NO.27、
    L861Q_OUT_RP: SEQ ID NO.28、
    L861Q_IN_FP: SEQ ID NO.29、
L861Q_IN_RP: SEQ ID NO.30。

2.   一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
用权利要求1所述的9组引物扩增来自待测样品的模板；
使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。

3.  权利要求2的方法，还包括步骤：进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。

4.   如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。

5.   如权利要求2-4任一项所述的方法，其中扩增用包括如下的PCR反应体系进行：
PCR缓冲液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl₂、外引物和甲酰胺。

6.   如权利要求5所述的方法，其中用于扩增的PCR反应体系包括：
PCR缓冲液
rTaq酶 2.5 μL
10×缓冲液 5 μL
dNTP-MIX 200 μmol/L
MgCl2 1.5-2.0 mmol/L
外引物各1 μL
甲酰胺 1 μL。

7.   一种试剂盒，包括：权利要求1所述的9组引物。

8.  如权利要求7所述的试剂盒，还包括PCR反应缓冲液。

9.  如权利要求8所述的试剂盒，还包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl₂、外引物和甲酰胺。

说明书

用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法

技术领域
本发明涉及基因突变的检测，特别涉及检测表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其方法。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于HER或ErbB受体家族的一员，该家族包括EGFR (ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR也常被称作HER1或ErbB1。EGFR及其家族成员能够调控细胞分化、凋亡、细胞运动、新血管生成、浸润和转移等多项生理过程，同时在大部分的人类肿瘤中都有表达，因此EGFR已经被证明在众多肿瘤的发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。
EGFR是典型的具有酪氨酸激酶(Tyrosine Kinase, TK)活性的受体，TK在EGFR的活性中发挥了关键作用。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFR-TKI治疗的患者，进行EGFR基因突变检测。需要指出，检测EGFR基因突变并不能作为患者是否患癌的依据。在我国《NCCN:非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）》中只是明确提出了临床实践中EGFR-TKI治疗前需要针对EGFR编码区第18、19、20和21外显子的突变位点开展检测。确定患者是否携带有EGFR突变在一定程度上避免无效用药和社会经济资源的浪费。近年来，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitor, EGFR-TKI)类药物（包括吉非替尼和厄洛替尼等）已经在非小细胞肺癌等肿瘤的特定患者的临床治疗中被证明效果显著(Paez JG, et al. Science. 2004; 304:1497-1500)。EGFR-TKI能够有效延长患者的生存期，但研究表明患者个体EGFR的第18、19、20和21号外显子的突变状态（尤其是19号外显子的插入缺失以及21号外显子L858R点突变最为常见）和疗效密切相关，占到突变总数的90%以上(Chan SK et al. Eur J Cancer 42,1, 2006, 17-23)。因此，在引物设计时包含核心突变区的高频突变点和尽可能多的突变点，检测时将会最大程度上降低EGFR突变检测的假阴性。
目前，使用最多的临床基因突变检测方法是PCR测序法，PCR测序法是目前默认的“金标准”。其它常用的方法还包括PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、Real time PCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR测序法敏感度较低，对低质量或含量较低的样本检测会产生较大的假阳性和假阴性。ARMS法能将突变检测的选择性提高到1%，但是对于质量低或含量低的DNA样品，这样的选择性依然偏低。另外，ARMS法依靠常规凝胶电泳或探针杂交来检测PCR产物，对于因样品含量较低导致扩增效率较低的突变产物，在电泳条带上可能不能显示。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量或半定量分析。本领域需要可高灵敏度和高选择性地进行突变检测的PCR技术。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明使用了一种加荧光并结合毛细管电泳的阻滞PCR技术方法(AMP-MDS)。
具体而言，本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步骤：
1)       对于EGFR基因的41种突变（位于18、19、20和21号的外显子），对每一个点突变设计包括一对外引物和两个内引物的组合；对每一个缺失突变或者插入突变，设计一对外引物，其中所述两个内引物方向相向，3’端位于突变位置处，一个内引物的3’端和正常碱基互补，另一个内引物的3’端与突变位置的突变碱基互补；所述两个外引物分别和一个内引物可以配对进行PCR扩增，它们自身也可以进行配对扩增；所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的两个产物的长度差均须在5 bp以上；在所述内引物3’端倒数5个碱基的区域引入错配，按照热力学稳定性高低相间的模式引入(低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对)；将荧光加在外引物的5’端，且使用不同颜色的荧光染料对两个内引物进行标记；
2)       用步骤1）中的各组引物分别扩增来自待测样品的模板序列，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物1以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物2和产物3；对于插入突变或者缺失突变，得到长度有差异的两条产物；
3)       将上述产物通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，在产物1、产物2和产物3均有峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。
在一个实施方案中，所述PCR方法还包括定量步骤：
4)       进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
共41种突变
在本发明中，肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变具体详见表1。
表1 肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变

*Cosmic (Forbes SA et al. Nucleic Acids Res. 2011 Jan;39:D945-50)数据库网址: http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/。
   本领域技术人员可以理解，41种突变的检测有辅助用药和其他许多生物学意义，例如用于对进化、遗传和人口迁移的研究。还例如，对未知来源的血液或其他生物样品进行检测，以排除不需要的样品。
引物
41种突变按其突变类型可以分为三类，包括：点突变，插入突变和缺失突变。本申请中对于点突变包含一对外引物和一对内引物，对于缺失突变或者插入突变仅包含一对外引物。41种突变分9个试管进行，各管检测的突变及其引物见表2。
表2  特异性引物

因此，本发明提供了上述9组引物，这些9组引物用于检测人类EGFR基因突变。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
1)   用上述的9组引物扩增来自待测样品的模板序列；
2)   使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。
在一个实施方案中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤：
3)   进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
在一个实施方案中，本发明还提供了上述9组引物任一组或它们的任意组合，包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。所述引物组或组合用于进行相应突变的检测。所述检测例如下：
在一个实施方案中，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤：
1)   用上述9组引物任一组或它们的任意组合扩增来自待测样品的模板序列，所述引物或组合包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组；
2)   使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。
在一个实施方案中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤：
3)   进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。
在一个具体实施方案中，所述检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰引物的定量PCR方法包括待测样品处理和模板提取步骤。本方法还适用于甲醛固定石蜡包埋的样品、血浆或新鲜组织样品。因此，在一个实施方案中，本方法适用于的样品可以是手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液，或者是它们的任意组合。
反应体系
在本发明的一个实施方案中，本发明的方法中的扩增用包括如下的PCR反应体系进行：PCR缓冲液、rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl₂、外引物和甲酰胺。
在一个更具体的实施方案中，反应体系如下：

反应条件：
PCR反应条件为：
95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
在另外一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的9组引物。或者，所述试剂盒可以包括本发明的9组引物的任一组或它们的任意组合，所述引物或组合包括但不限于第1-9组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液。在一个更具体实施方案中，所述试剂盒还包括rTaq酶、dNTP-MIX、MgCl₂、外引物和甲酰胺。
本发明的有益效果是：本发明基于人工修饰引物的定量突变检测系统，建立了使用人工突变碱基引物的PCR反应体系，可以同时检测41种表皮生长因子受体EGFR的基因突变，此方法：
1)   可同时检测EGFR基因的41种突变，包括点突变、插入突变和缺失突变，包含了EGFR绝大部分的高频突变；
2)   选择性强，可检测至10^-4极低含量的缺失突变DNA；
3)   灵敏度高，可检测低至10拷贝的突变；
4)   特异性高，有内外两对引物，且内引物添加有人工突变碱基，共同保证体系的高特异性；
5)   可进行定量分析；
6)   检测速度快，整个检测过程需要一个小时。
附图说明
图1：毛细管电泳检测L858的阳性和阴性结果对照示例图。
图2：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因L858R点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。
图3：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失/未缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果示例。
图4：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。
图5：利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0%、0.02%、0.2%、2%、10%、20%、50%和100%的人肺癌组织EGFR基因T790M点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。

具体实施方式
本发明以人类肺癌患者表皮生长因子(EGFR)基因的41种突变为主要检测对象，通过人工修饰引物的定量PCR检测方法，从而实现快速、准确且选择性高的突变检测。
本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其使用方法，主要包括四个主要步骤：
1)   根据Cosmic数据库公布的人类EGFR基因的41种突变数据，为每一个点突变设计内、外两对引物；为每一个插入突变或缺失突变，设计一对外引物。
2)   待测样品处理和模板提取。
3)   PCR扩增。
4)   PCR结果检测。
步骤1）中，针对Cosmic数据公布的人类EGFR基因的41种突变数据（见表1），设计了9组引物，用于进行突变的检测，详细的引物序列见表2。其中，为了降低结果的假阳性率，我们在内引物3’端最后五个碱基的区域人为引入了突变，有限度地降低了内引物3’端与模板结合的能力，引入突变的原则是最后5个碱基的区域的结合能力均匀降低，采取结合能力高低相间的方式进行。详细原则如下：
如果3’端错配具有一定的稳定性，那么在倒数第三位和第五位可以引入相应的错配；
如果3’端错配对稳定性具有较低的破坏性，那么则需要根据倒数第二个碱基对的稳定性进一步判断是否应该引入错配，引入错配的标准是尽量保证碱基对的稳定性高低错开，避免局部稳定性过强。其中，CG碱基对是高稳定性，AT碱基对以及所有错配均为低稳定性；
如果3’端错配对于稳定性具有较强的破坏性，那么不在倒数第三位引入错配，但当倒数第二位是具有较强稳定性的碱基对时例外；
例如，AGCGA/TCGCT，这一组引物，其热力学稳定性为：_---_（“_”代表低热力学稳定性，“-”代表高热力学稳定性），因此可以在倒数第三位引入错配，其热力学稳定性改为：_-_-_，同时将倒数第四位也引入错配作为备选引物，其热力学稳定性为：___-_。
步骤2），样品处理及模板提取。来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入甲苯充分浸泡2个小时，用75%酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5 ml EP管中盖好盖。加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200 μL AL缓冲液充分混匀，再加入200 μL 100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAamp MinElute column中，8000 rpm离心2 min，然后分别用500 μl Buffer AW1和500 μl Buffer AW2分别6000×g (8000 rpm)离心1 min洗脱，最后20000×g; 14000 rpm离心3 min甩干，加入100 μL ATE20000×g; 14000 rpm离心1 min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
步骤3），以步骤1）的引物进行PCR反应，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物；对于插入或缺失，将得到长度不同的两个产物。PCR反应的反应体系和反应条件如下：
反应体系

反应体系反应条件rTaq酶2.5 μL10×缓冲液5 μLdNTP-MIX200 μmol/LMgCl₂1.5-2.0 mmol/L外引物各1μL甲酰胺1 μL内引物（点突变）各1μL水补足体系DMSO1 μL模板1 μL总体系50 μL

反应条件：
PCR反应条件为：
95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
步骤4)      PCR产物检测
将上述产物通过荧光毛细管电泳进行定量分析。所述定量分析具体为STR检测，即短串联重复序列(Short Tandem Repeat, STR)分析平台，用于测定样品间遗传物质差异（短串联重复序列差异）的一种技术手段。短串联重复序列(STR)检测短串联重复序列又称微卫星DNA (micro-satellite DNA)。
具体步骤如下：
1)   用ABI GS500LIZ与甲酰胺按1:13130的比例混合。
2)   将混合液体取出9 μL后，加入待测样品0.5 μL。
3)   在ABI3730测序仪上进行毛细管电泳检测，得到对应胶图及峰图。

下面结合本发明实施例及附图对本发明进行进一步的说明。
实施例一
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor)的21号外显子第858突变位点的基因突变。
实验材料如下：
试剂厂商rTaq酶TAKARA(宝生物)公司10×缓冲液TAKARA(宝生物)公司dNTP-MIXTAKARA(宝生物)公司MgCl₂TAKARA(宝生物)公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司蛋白酶KQIAGEN公司QIAamp MinElute柱QIAGEN公司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司

样品和对照标准品制备过程如下：
1.  检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5 ml EP管中盖好盖。加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200 μL AL缓冲液充分混匀，再加入200 μL 100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAamp MinElute column中，8000 rpm离心2 min，然后分别用500 μl Buffer AW1和500 μl Buffer AW2分别6000×g (8000 rpm)离心1 min洗脱，最后20000×g; 14000 rpm离心3 min甩干，加入100 μL ATE20000×g; 14000 rpm离心1 min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.  对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因21号外显子第858突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQ ID NO.31：
5-GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCTttccattctttggatcagtagtcactaacgttcgccagccataagtcctcgacgtggagaggctcagagcctGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCKGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGA ATA CCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCT-3，其中K为T（野生型）或G（突变）
3.  引物设计
CGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTT（SEQ ID NO.25 L858R_IN_FP）
CTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCTC（SEQ ID NO.26 L858R_IN_RP）
GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCT（SEQ ID NO.23 L858R_OUT_FP）
AGCCACCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCA（SEQ ID NO.24；L858R_OUT_RP）
4.  PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系反应条件rTaq酶2.5 μL10×缓冲液5 μLdNTP-MIX200 μmol/LMgCl₂1.5-2.0 mmol/L外引物各1μL甲酰胺1 μL内引物各1 μL水补足体系DMSO1 μL模板1 μL总体系50 μL

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5. 检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图1为检测结果示例。
6. 灵敏度和选择性实验
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000（即以下所示的1:X）的量比进行混合，且使混合后总体积为100 μL。根据浓度计算所需体积，过程如下：
C₁V₁:C₂V₂=1:X；
V₁+V₂=100；
综合以上二方程得出V₁=200C₂/(XC₁+C₂)，V₂=100-V₁。
已测得各样品浓度为C₁=33 ng/μL，C₂=41.95 ng/μL。
用Excel软件自动计算出各X对应下的V₁和V₂。得到1至7号新样品。
混比XV₁V₂送测编号1原样100012原样0100250.00%155.9744.03320.00%424.1275.8841.96%502.479497.52150.20%5000.253699.74660.02%50000.0254299.9757

荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图2）结果显示，本发明方法的灵敏度较高，检测选择性可达0.02%。
7.  重复性和准确率
1)  标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
2)  选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。
8. 检测优势比较
我们选取了10例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法、AMRS法以及AMP-MDS法进行EGFR基因的L858R突变检测并进行比较，比较结果参见表3。可见AMP-MDS法的准确率最高，达到100%，假阳性率大大优于ARMS法，假阴性率大大优于PCR测序法。
表3 10例肺癌患者EGFR的L858R突变检测结果比较
病理号PCR测序法ARMS法AMP-MDS法临床用药后病理进程74673阳性阳性阳性PR74330阳性阳性阳性PR75674阳性阳性阳性PR111950阳性阳性阳性PR80404阳性阳性阳性PR72818阴性阳性阳性PR73090阴性阳性阳性PR71334阴性阳性阳性PR73729阴性阳性阴性PD74238阴性阳性阴性PD

注：CR：完全缓解，PR：部分缓解，SD：稳定，PD：进展。

实施例二
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的缺失进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor)的19号外显子E746 (2235 -2249 DEL15 )点的基因缺失。
实验材料如下：
试剂厂商rTaq酶TAKARA(宝生物)公司10×缓冲液TAKARA(宝生物)公司dNTP-MIXTAKARA(宝生物)公司MgCl₂TAKARA(宝生物)公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司蛋白酶KQIAGEN公司QIAamp MinElute柱QIAGEN公司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司

样品和对照标准品制备过程如下：
1.  检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5 ml EP管中盖好盖。加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200 μL AL缓冲液充分混匀，再加入200 μL 100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAamp MinElute column中，8000 rpm离心2 min，然后分别用500 μl Buffer AW1和500 μl Buffer AW2分别6000×g (8000 rpm)离心1 min洗脱，最后20000×g; 14000 rpm离心3 min甩干，加入100 μL ATE20000×g; 14000 rpm离心1 min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.  对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因19号外显子E746 (2235 -2249 DEL15 )位点基因野生型和缺失基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQ ID NO.32（野生型）：
5’-CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCT
CACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATG
SEQ ID NO.33（缺失型）：
5’-CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCT
CACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAACAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATG
3.  引物设计
TGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGT (SEQ ID NO.11: Ex19-del_OUT_FP)
GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGT (SEQ ID NO.12: Ex19-del_OUT_RP)
4.  PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系反应条件rTaq酶2.5 μL10×缓冲液5 μLdNTP-MIX200 μmol/LMgCl₂1.5-2.0 mmol/L外引物各1μL甲酰胺1 μL内引物各1 μLDMSO1 μL模板1 μL水补足体系总体系50 μL

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，65℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5. 检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图3为检测结果示例。
6. 选择性和灵敏度实验
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000（即以下所示的1:X）的量比进行混合，且使混合后总体积为100 μL。根据浓度计算所需体积，过程如下：
C₁V₁:C₂V₂=1:X；
V₁+V₂=100；
综合以上二方程得出V₁=200C₂/(XC₁+C₂)，V₂=100-V₁。
已测得各样品浓度为C₁=35.2 ng/μL，C₂=36.6 ng/μL。
用Excel软件自动计算出各X对应下的V₁和V₂。得到1至7号新样品。
混比XV₁V₂送测编号1原样100012原样0100250.00%150.9749.03320.00%420.5379.3741.96%502.037297.9650.20%5000.207599.7960.02%50000.0207999.987

荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图4）显示本发明的方法的选择性检测能力在0.02%以上，检出灵敏度非常高。
7.  重复性和准确率
1)  标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
2)  选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。
8. 检测优势比较
我们选取了100例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法以及我们的AMP-MDS法进行EGFR基因的19外显子缺失检测并进行比较，比较结果参见下表4。
表 4 100例肺癌患者EGFR的19外显子缺失检测结果比较
检测方法阳性检出例数检出率本发明的方法55%PCR测序法22%

实施例三
对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor)的20号外显子T790M突变位点的基因突变。
实验材料如下：
试剂厂商rTaq酶TAKARA(宝生物)公司10×缓冲液TAKARA(宝生物)公司dNTP-MIXTAKARA(宝生物)公司MgCl₂TAKARA(宝生物)公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司蛋白酶KQIAGEN公司QIAamp MinElute柱QIAGEN公司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司

样品和对照标准品制备过程如下：
1.  检测样本
来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用75%酒精漂洗2次，加入100%乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入1.5 ml EP管中盖好盖。加入180 μL ATL缓冲液和20 μL蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56℃消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90℃消化60分钟。加入200 μL AL缓冲液充分混匀，再加入200 μL 100%乙醇混匀，将混合样品放入QIAamp MinElute column中，8000 rpm离心2 min，然后分别用500 μl Buffer AW1和500 μl Buffer AW2分别6000×g (8000 rpm)离心1 min洗脱，最后20000×g; 14000 rpm离心3 min甩干，加入100 μL ATE20000×g; 14000 rpm离心1 min洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。
2.  对照标准品的制备
根据Cosmic数据库公布的EGFR基因20号外显子第T790M突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQ ID NO.34：
5-aGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCAKGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGgtaatcagggaagggagatacggggaggggagatAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGC-3，其中K为C（野生型）或A（突变）
3.  引物设计
AGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAAC (SEQ ID NO.17；T790M_OUT_FP)
GCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATC (SEQ ID NO.18；T790M_OUT_RP)
CTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATAAC (SEQ ID NO.19；T790M_IN_FP)
CAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTTCA (SEQ ID NO.20；T790M_IN_RP)
4.  PCR扩增
PCR反应体系如下：
反应体系反应条件rTaq酶2.5 μL10×缓冲液5 μLdNTP-MIX200 μmol/LMgCl₂1.5-2.0 mmol/L外引物各1μL甲酰胺1 μL内引物各1 μLDMSO1 μL模板1 μL水补足体系总体系50 μL

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；
95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，10个循环；
95℃变性15秒，69℃退火15秒，72℃延伸15秒，25个循环；
最后延伸7分钟。
5. 检测
利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。
6. 灵敏度与选择性实验。
样品阳性和阴性分别按照1:0、0:1、1:1、1:4、1:50、1:500和1:5000的量比进行混合，得到1至8号新样品。
序号模板M_AC_CV_TC_AV_c1未突变片断790-C-C0.0000342035.802突变片断790-C-A1.000034035.820350%突变片断0.50003410.2578835.89.7421203420%突变片断0.2000345.9271523.5814.072848510%突变片断0.1000349.7311993.5810.26880162%突变片断0.0200346.8068760.35813.19312470.2%突变片断0.0020346.8888370.035813.11116380.02%突变片断0.0002346.8969770.0035813.103023

M_A：混合液体中突变片断的含量
C_C：合成的未突变片断溶液浓度%；
V_T：加入混合待测样本溶液的合成未突变片断溶液体积μL；
C_A：合成的突变片断溶液浓度%；
V_c：加入混合待测样本溶液的合成突变片断溶液体积μL.
本发明检测结果（图5）显示，其选择性检测能力在0.02%以上，检出灵敏度非常高。
7.  重复性和准确率
标准品进行10次实验，重复性和准确率达100%。
8. 检测优势
1)   本方法通过基于PCR的技术检测突变，具有很高的灵敏度，低至5-10个拷贝即可准确检测。
2)   本方法通过在引物3’端5个碱基的区域引入一个或者一个以上的人工突变，一方面保证了DNA聚合酶结合的稳定性，另外一个方面又极大的提高了选择性。
3)   通过在引物5’端加荧光以及通过荧光毛细管电泳来检测PCR产物，来进一步提高选择性，总体选择性在10^-4-10^-5之间。
4)   本方法设计的外引物位于内含子区域，通过在引物5’端添加荧光染料、避免引入额外的探针，进一步增加了特异性，降低了假阳性率。
5)   本方法结合荧光毛细管电泳技术，可实现对样品突变的定量分析。
6)    本方法过程简单，仅包含两步，即PCR过程和毛细管电泳，因此检测速度快，整个过程仅需不到1小时。
序列表
SEQUENCE LISTING

<110>  思博奥科生物信息科技(北京)有限公司

<120>  用于检测人类EGFR基因突变的引物及其用法

<130>  20140611

<160>  33

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  1
ttgtggagcc tcttacaccc agtggagaag                                        30

<210>  2
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  2
atatacagct tgcaaggact ctgggctccc                                        30

<210>  3
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  3
ggaaactgaa ttcaaaaaga tcaaagtgcg gg                                     32

<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  4
cttatacacc gtgccgaacg caccggacct                                        30

<210>  5
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  5
ggaaactgaa ttcaaaaaga tcaaagtgcc gg                                     32

<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  6
cttatacacc gtgccgaacg caccggaaca                                        30

<210>  7
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  7
atttgtcctt ccaaatgagc tggcaagtgc                                        30

<210>  8
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  8
aatatacagc ttgcaaggac tctgggctcc                                        30

<210>  9
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  9
aactgaattc aaaaagatca aagtgctagg                                        30

<210>  10
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  10
cttatacacc gtgccgaacg caccggggg                                         29

<210>  11
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  11
tgtggcacca tctcacaatt gccagt                                            26

<210>  12
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  12
ggatttcctt gttggctttc ggagatgt                                          28

<210>  13
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  13
gtcacttcac agccctgcgt aaacgtccct                                        30

<210>  14
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  14
gcgatctgca cacaccagtt gagcaggtac                                        30

<210>  15
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  15
ctccctccag gaagcctacg tgatggctag                                        30

<210>  16
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  16
gcacacgtgg gggttgtcca tga                                               23

<210>  17
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  17
aggaagccta cgtgatggcc agcgtggaca ac                                     32

<210>  18
<211>  33
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  18
gcagaccgca tgtgaggatc ctggctcctt atc                                    33

<210>  19
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  19
ctgcctcacc tccaccgtgc agctcataac                                        30

<210>  20
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  20
caggaggcag ccgaagggca tgagcttca                                         29

<210>  21
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  21
tgtcacttca cagccctgcg taaacg                                            26

<210>  22
<211>  26
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  22
gatctgcaca caccagttga gcaggt                                            26

<210>  23
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  23
gcagcgggtt acatcttctt tcatgcgcct                                        30

<210>  24
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  24
agccacctcc ttactttgcc tccttctgca                                        30

<210>  25
<211>  31
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  25
cgcagcatgt caagatcaca gattttgggt t                                      31

<210>  26
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  26
ctttctcttc cgcacccagc agtttggctc                                        30

<210>  27
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  27
ttggatcagt agtcactaac gttcgccagc                                        30

<210>  28
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  28
aaagccacct ccttactttg cctccttctg                                        30

<210>  29
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  29
caagatcaca gattttgggc tggccaagct                                        30

<210>  30
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列

<400>  30
catggtattc tttctcttcc gcacccaact                                        30

<210>  31
<211>  272
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<221>  misc_feature
<222>  (256)..(256)
<223>  K为T（野生型）或G（突变）

<400>  31
gcagcgggtt acatcttctt tcatgcgcct ttccattctt tggatcagta gtcactaacg       60

ttcgccagcc ataagtcctc gacgtggaga ggctcagagc ctggcatgaa ctacttggag      120

gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca gccaggaacg tactggtgaa aacaccgcag      180

catgtcaaga tcacagattt tgggckggcc aaactgctgg gtgcggaaga gaaagaatac      240

catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg ct                                    272

<210>  32
<211>  430
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<221>  misc_feature
<222>  (252)..(252)
<223>  K为GGAATTAAGAGAAG（野生型）或无（突变）

<400>  32
cccagcaata tcagccttag gtgcggctcc acagccccag tgtccctcac cttcggggtg       60

catcgctggt aacatccacc cagatcactg ggcagcatgt ggcaccatct cacaattgcc      120

agttaacgtc ttccttctct ctctgtcata gggactctgg atcccagaag gtgagaaagt      180

taaaattccc gtcgctatca akcaacatct ccgaaagcca acaaggaaat cctcgatgtg      240

agtttctgct ttgctgtgtg ggggtccatg gctctgaacc tcaggcccac cttttctcat      300

gtctggcagc tgctctgctc tagaccctgc tcatctccac atcctaaatg ttcactttct      360

atgtctttcc ctttctagct ctagtgggta taactccctc cccttagaga cagcactggc      420

ctctcccatg                                                             430

<210>  33
<211>  251
<212>  DNA
<213>  人工序列

<220>
<221>  misc_feature
<222>  (105)..(105)
<223>  K为C（野生型）或A（突变）

<400>  33
agaagcctac gtgatggcca gcgtggacaa cccccacgtg tgccgcctgc tgggcatctg       60

cctcacctcc accgtgcagc tcatcakgca gctcatgccc ttcggctgcc tcctggacta      120

tgtccgggaa cacaaagaca atattggctc ccagtacctg ctcaactggt gtgtgcagat      180

cgcaaaggta atcagggaag ggagatacgg ggaggggaga taaggagcca ggatcctcac      240

atgcggtctg c                                                           251

资源描述

《用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法.pdf（33页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104131091A43申请公布日20141105CN104131091A21申请号201410346892022申请日20140721C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人思博奥科生物信息科技（北京）有限公司地址北京市丰台区丰台科学城航丰路8号1幢楼1808室72发明人不公告发明人54发明名称用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法57摘要本发明属于生物技术领域，特别是基因突变的检测。更具体而言，本发明公开了检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的9组引物及使用其进行检测的方法。51INTCL权利要求书2页说明书15页序列表10页附图5页1。

2、9中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书15页序列表10页附图5页10申请公布号CN104131091ACN104131091A1/2页21用于检测人类EGFR基因突变的引物，包括下列9组引物1G719S_OUT_FPSEQIDNO1、G719S_OUT_RPSEQIDNO2、G719S_IN_FPSEQIDNO3、G719S_IN_RPSEQIDNO4；2G719C_OUT_FPSEQIDNO1、G719C_OUT_RPSEQIDNO2、G719C_IN_FPSEQIDNO5、G719C_IN_RPSEQIDNO6；3G719A_OUT_FPSEQIDNO7、G71。

3、9A_OUT_RPSEQIDNO8、G719A_IN_FPSEQIDNO9、G719A_IN_RPSEQIDNO10；4EX19DEL_OUT_FPSEQIDNO11、EX19DEL_OUT_RPSEQIDNO12；5S768I_OUT_FPSEQIDNO13、S768I_OUT_RPSEQIDNO14、S768I_IN_FPSEQIDNO15、S768I_IN_RPSEQIDNO16；6T790M_OUT_FPSEQIDNO17、T790M_OUT_RPSEQIDNO18、T790M_IN_FPSEQIDNO19、T790M_IN_RPSEQIDNO20；7EX20INS_OUT_FPSEQ。

4、IDNO21、EX20INS_OUT_RPSEQIDNO22；8L858R_OUT_FPSEQIDNO23、L858R_OUT_RPSEQIDNO24、L858R_IN_FPSEQIDNO25、L858R_IN_RPSEQIDNO26；9L861Q_OUT_FPSEQIDNO27、L861Q_OUT_RPSEQIDNO28、L861Q_IN_FPSEQIDNO29、L861Q_IN_RPSEQIDNO30。2一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤用权利要求1所述的9组引物扩增来自待测样品的模板；使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；。

5、对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。3权利要求2的方法，还包括步骤进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得权利要求书CN104131091A2/2页3到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。4如权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤2所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。5如权利要求24任一项所述的方法，其中扩增用包括如下的PCR反应体系进行PCR缓冲液、RTAQ酶、DNTPMIX、MGCL2、外引物和甲酰胺。6如权利要求5所述的方法，其中用于扩增的PCR反应体系包括PCR缓冲液RTA。

6、Q酶25L10缓冲液5LDNTPMIX200MOL/LMGCL21520MMOL/L外引物各1L甲酰胺1L。7一种试剂盒，包括权利要求1所述的9组引物。8如权利要求7所述的试剂盒，还包括PCR反应缓冲液。9如权利要求8所述的试剂盒，还包括RTAQ酶、DNTPMIX、MGCL2、外引物和甲酰胺。权利要求书CN104131091A1/15页4用于检测人类EGFR基因突变的引物及方法0001技术领域0002本发明涉及基因突变的检测，特别涉及检测表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其方法。背景技术0003表皮生长因子受体EPIDERMALGROWTHFACTORRECEPTOR,EGFR是上皮生长因子。

7、（EGF）细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于HER或ERBB受体家族的一员，该家族包括EGFRERBB1、HER2/CNEUERBB2、HER3ERBB3和HER4ERBB4。EGFR也常被称作HER1或ERBB1。EGFR及其家族成员能够调控细胞分化、凋亡、细胞运动、新血管生成、浸润和转移等多项生理过程，同时在大部分的人类肿瘤中都有表达，因此EGFR已经被证明在众多肿瘤的发生、发展及预后过程中发挥了重要调控作用。0004EGFR是典型的具有酪氨酸激酶TYROSINEKINASE,TK活性的受体，TK在EGFR的活性中发挥了关键作用。美国FDA批准对拟采用易瑞沙、特罗凯等EGFRTKI治疗。

8、的患者，进行EGFR基因突变检测。需要指出，检测EGFR基因突变并不能作为患者是否患癌的依据。在我国NCCN非小细胞肺癌临床实践指南（中国版）中只是明确提出了临床实践中EGFRTKI治疗前需要针对EGFR编码区第18、19、20和21外显子的突变位点开展检测。确定患者是否携带有EGFR突变在一定程度上避免无效用药和社会经济资源的浪费。近年来，EGFR酪氨酸激酶抑制剂EPIDERMALGROWTHFACTORRECEPTORTYROSINEKINASEINHIBITOR,EGFRTKI类药物（包括吉非替尼和厄洛替尼等）已经在非小细胞肺癌等肿瘤的特定患者的临床治疗中被证明效果显著PAEZJG,ET。

9、ALSCIENCE200430414971500。EGFRTKI能够有效延长患者的生存期，但研究表明患者个体EGFR的第18、19、20和21号外显子的突变状态（尤其是19号外显子的插入缺失以及21号外显子L858R点突变最为常见）和疗效密切相关，占到突变总数的90以上CHANSKETALEURJCANCER42,1,2006,1723。因此，在引物设计时包含核心突变区的高频突变点和尽可能多的突变点，检测时将会最大程度上降低EGFR突变检测的假阴性。0005目前，使用最多的临床基因突变检测方法是PCR测序法，PCR测序法是目前默认的“金标准”。其它常用的方法还包括PCRRFLP法、PCRSSC。

10、P法、REALTIMEPCR法、DHPLC和ARMS法等。PCR测序法敏感度较低，对低质量或含量较低的样本检测会产生较大的假阳性和假阴性。ARMS法能将突变检测的选择性提高到1，但是对于质量低或含量低的DNA样品，这样的选择性依然偏低。另外，ARMS法依靠常规凝胶电泳或探针杂交来检测PCR产物，对于因样品含量较低导致扩增效率较低的突变产物，在电泳条带上可能不能显示。同时，该方法不能对样品所含突变进行定量或半定量分析。本领域需要可高灵敏度和高选择性地进行突变检测的PCR技术。说明书CN104131091A2/15页5发明内容0006为了解决现有技术中存在的问题，本发明使用了一种加荧光并结合毛细管。

11、电泳的阻滞PCR技术方法AMPMDS。0007具体而言，本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰的引物及PCR方法。其中，所述PCR方法包括如下步骤1对于EGFR基因的41种突变（位于18、19、20和21号的外显子），对每一个点突变设计包括一对外引物和两个内引物的组合；对每一个缺失突变或者插入突变，设计一对外引物，其中所述两个内引物方向相向，3端位于突变位置处，一个内引物的3端和正常碱基互补，另一个内引物的3端与突变位置的突变碱基互补；所述两个外引物分别和一个内引物可以配对进行PCR扩增，它们自身也可以进行配对扩增；所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引。

12、物分别和所述两个内引物所配对产生的两个产物的长度差均须在5BP以上；在所述内引物3端倒数5个碱基的区域引入错配，按照热力学稳定性高低相间的模式引入低热力学稳定性是指引物与模板结合能力弱，不稳固，例如含有两个氢键的AT配对，或者AC，AG等错配；高热力学稳定性是指引物与模板结合能力强，比较稳固，如含有三个氢键的CG配对；将荧光加在外引物的5端，且使用不同颜色的荧光染料对两个内引物进行标记；2用步骤1）中的各组引物分别扩增来自待测样品的模板序列，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物1以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物2和产物3；对于插入突变或者缺失突变，得到长度有差异的。

13、两条产物；3将上述产物通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，在产物1、产物2和产物3均有峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入突变或缺失突变，如果有两个峰值时，表示有插入突变或缺失突变。0008在一个实施方案中，所述PCR方法还包括定量步骤4进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。0009共41种突变在本发明中，肺癌患者表皮生长因子EGFR基因的41种突变具体详见表1。0010表1肺癌患者表皮生长因子EGFR基因的41种突变说明书CN104131091A3/15页6COSMICFORBESSAETALNUCLEICACIDSRES2011J。

14、AN39D94550数据库网址HTTP/CANCERSANGERACUK/CANCERGENOME/PROJECTS/COSMIC/。0011本领域技术人员可以理解，41种突变的检测有辅助用药和其他许多生物学意义，例如用于对进化、遗传和人口迁移的研究。还例如，对未知来源的血液或其他生物样品进行检测，以排除不需要的样品。0012引物41种突变按其突变类型可以分为三类，包括点突变，插入突变和缺失突变。本申请中对于点突变包含一对外引物和一对内引物，对于缺失突变或者插入突变仅包含一对外引物。41种突变分9个试管进行，各管检测的突变及其引物见表2。说明书CN104131091A4/15页70013表2特。

15、异性引物因此，本发明提供了上述9组引物，这些9组引物用于检测人类EGFR基因突变。0014在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤1用上述的9组引物扩增来自待测样品的模板序列；2使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。0015在一个实施方案中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤3进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。说明书CN104131091A5/15页80016在一个实施方案中，。

16、本发明还提供了上述9组引物任一组或它们的任意组合，包括但不限于第19组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。所述引物组或组合用于进行相应突变的检测。所述检测例如下在一个实施方案中，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种检测人类EGFR基因突变的方法，包括以下步骤1用上述9组引物任一组或它们的任意组合扩增来自待测样品的模板序列，所述引物或组合包括但不限于第19组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组；2使用通过荧光毛细管电泳进行分析，对于点突变，如果出现三个峰值时，表示在突变位置有突变碱基；对于插入或缺失，如果有两个的峰值时，表示有插入或缺失突变。0017在一个实施方案。

17、中，所述检测人类EGFR基因突变的方法还包括定量步骤3进一步计算每一个峰值与标准品的峰值的比值，得到突变碱基的含量和正常碱基的含量的定量比值。0018在一个具体实施方案中，所述检测人类表皮生长因子EGFR基因41种突变的基于人工修饰引物的定量PCR方法包括待测样品处理和模板提取步骤。本方法还适用于甲醛固定石蜡包埋的样品、血浆或新鲜组织样品。因此，在一个实施方案中，本方法适用于的样品可以是手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液，或者是它们的任意组合。0019反应体系在本发明的一个实施方案中，本发明的方法中的扩增用包括如下的PCR反应体系进行PCR缓。

18、冲液、RTAQ酶、DNTPMIX、MGCL2、外引物和甲酰胺。0020在一个更具体的实施方案中，反应体系如下反应条件PCR反应条件为95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸30秒，10个循环；95变性15秒，69退火15秒，72延伸15秒，25个循环；最后延伸7分钟。说明书CN104131091A6/15页90021在另外一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的9组引物。或者，所述试剂盒可以包括本发明的9组引物的任一组或它们的任意组合，所述引物或组合包括但不限于第19组任一组；第1和2组；第1、2和3组；第6，7和8组。在一个具体实施方案中，所述试剂盒还包括P。

19、CR反应缓冲液。在一个更具体实施方案中，所述试剂盒还包括RTAQ酶、DNTPMIX、MGCL2、外引物和甲酰胺。0022本发明的有益效果是本发明基于人工修饰引物的定量突变检测系统，建立了使用人工突变碱基引物的PCR反应体系，可以同时检测41种表皮生长因子受体EGFR的基因突变，此方法1可同时检测EGFR基因的41种突变，包括点突变、插入突变和缺失突变，包含了EGFR绝大部分的高频突变；2选择性强，可检测至104极低含量的缺失突变DNA；3灵敏度高，可检测低至10拷贝的突变；4特异性高，有内外两对引物，且内引物添加有人工突变碱基，共同保证体系的高特异性；5可进行定量分析；6检测速度快，整个检测过。

20、程需要一个小时。附图说明0023图1毛细管电泳检测L858的阳性和阴性结果对照示例图。0024图2利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0、002、02、2、10、20、50和100的人肺癌组织EGFR基因L858R点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。0025图3利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失/未缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果示例。0026图4利用基于人工修饰引物的定量突变检测方法分别检测0、002、02、2、10、20、50和100的人肺癌组织EGFR基因19外显子缺失标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。0027图5利用基于人工修。

21、饰引物的定量突变检测方法分别检测0、002、02、2、10、20、50和100的人肺癌组织EGFR基因T790M点突变标准品的毛细管电泳荧光峰图结果。0028具体实施方式0029本发明以人类肺癌患者表皮生长因子EGFR基因的41种突变为主要检测对象，通过人工修饰引物的定量PCR检测方法，从而实现快速、准确且选择性高的突变检测。0030本发明提供了一种检测人类表皮生长因子EGFR基因突变的引物及其使用方法，主要包括四个主要步骤1根据COSMIC数据库公布的人类EGFR基因的41种突变数据，为每一个点突变设计内、外两对引物；为每一个插入突变或缺失突变，设计一对外引物。00312待测样品处理和模板提。

22、取。说明书CN104131091A7/15页1000323PCR扩增。00334PCR结果检测。0034步骤1）中，针对COSMIC数据公布的人类EGFR基因的41种突变数据（见表1），设计了9组引物，用于进行突变的检测，详细的引物序列见表2。其中，为了降低结果的假阳性率，我们在内引物3端最后五个碱基的区域人为引入了突变，有限度地降低了内引物3端与模板结合的能力，引入突变的原则是最后5个碱基的区域的结合能力均匀降低，采取结合能力高低相间的方式进行。详细原则如下如果3端错配具有一定的稳定性，那么在倒数第三位和第五位可以引入相应的错配；如果3端错配对稳定性具有较低的破坏性，那么则需要根据倒数第二个。

23、碱基对的稳定性进一步判断是否应该引入错配，引入错配的标准是尽量保证碱基对的稳定性高低错开，避免局部稳定性过强。其中，CG碱基对是高稳定性，AT碱基对以及所有错配均为低稳定性；如果3端错配对于稳定性具有较强的破坏性，那么不在倒数第三位引入错配，但当倒数第二位是具有较强稳定性的碱基对时例外；例如，AGCGA/TCGCT，这一组引物，其热力学稳定性为_（“_”代表低热力学稳定性，“”代表高热力学稳定性），因此可以在倒数第三位引入错配，其热力学稳定性改为_，同时将倒数第四位也引入错配作为备选引物，其热力学稳定性为_。0035步骤2），样品处理及模板提取。来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织。

24、切片放到染片缸中，加入甲苯充分浸泡2个小时，用75酒精漂洗2次，加入100乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入15MLEP管中盖好盖。加入180LATL缓冲液和20L蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90消化60分钟。加入200LAL缓冲液充分混匀，再加入200L100乙醇混匀，将混合样品放入QIAAMPMINELUTECOLUMN中，8000RPM离心2MIN，然后分别用500LBUFFERAW1和500LBUFFERAW2分别6000G8000RPM离心。

25、1MIN洗脱，最后20000G14000RPM离心3MIN甩干，加入100LATE20000G14000RPM离心1MIN洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。0036步骤3），以步骤1）的引物进行PCR反应，对于点突变，得到所述两个外引物配对扩增的产物以及所述两个外引物分别和所述两个内引物所配对产生的产物；对于插入或缺失，将得到长度不同的两个产物。PCR反应的反应体系和反应条件如下反应体系反应体系反应条件RTAQ酶25L10缓冲液5LDNTPMIX200MOL/LMGCL21520MMOL/L外引物各1L甲酰胺1L内引物（点突变）各1L水补足体系DMSO1L模板1L总体系50L说明书CN10。

26、4131091A108/15页11反应条件PCR反应条件为95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸30秒，10个循环；95变性15秒，69退火15秒，72延伸15秒，25个循环；最后延伸7分钟。0037步骤4PCR产物检测将上述产物通过荧光毛细管电泳进行定量分析。所述定量分析具体为STR检测，即短串联重复序列SHORTTANDEMREPEAT,STR分析平台，用于测定样品间遗传物质差异（短串联重复序列差异）的一种技术手段。短串联重复序列STR检测短串联重复序列又称微卫星DNAMICROSATELLITEDNA。0038具体步骤如下1用ABIGS500LIZ与甲酰胺按11313。

27、0的比例混合。00392将混合液体取出9L后，加入待测样品05L。00403在ABI3730测序仪上进行毛细管电泳检测，得到对应胶图及峰图。0041下面结合本发明实施例及附图对本发明进行进一步的说明。0042实施例一对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体EPIDERMALGROWTHFACTORRECEPTOR的21号外显子第858突变位点的基因突变。0043实验材料如下试剂厂商RTAQ酶TAKARA宝生物公司10缓冲液TAKARA宝生物公司DNTPMIXTAKARA宝生物公。

28、司MGCL2TAKARA宝生物公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司蛋白酶KQIAGEN公司QIAAMPMINELUTE柱QIAGEN公司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司样品和对照标准品制备过程如下1检测样本来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用酒精漂洗2次，加入100乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入15MLEP管中盖好盖。加入180LATL缓冲液和20L蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水。

29、浴锅中56消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90消化60分钟。加入200LAL缓冲液充分混匀，再加入200L100乙醇混匀，将混合样品放入QIAAMPMINELUTECOLUMN中，8000RPM离心2MIN，然后分别用500LBUFFERAW1和500LBUFFERAW2分别6000G8000RPM离心1MIN洗脱，最后20000G14000RPM离说明书CN104131091A119/15页12心3MIN甩干，加入100LATE20000G14000RPM离心1MIN洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。00442对照标准品的制备根据COSMIC数据库公布的EGFR基因21号外显子。

30、第858突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO315GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCTTTCCATTCTTTGGATCAGTAGTCACTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCKGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAG。

31、GCAAAGTAAGGAGGTGGCT3，其中K为T（野生型）或G（突变）3引物设计CGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGTT（SEQIDNO25L858R_IN_FP）CTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCTC（SEQIDNO26L858R_IN_RP）GCAGCGGGTTACATCTTCTTTCATGCGCCT（SEQIDNO23L858R_OUT_FP）AGCCACCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCA（SEQIDNO24；L858R_OUT_RP）4PCR扩增PCR反应体系如下反应体系反应条件RTAQ酶25L10缓冲液5LDNTPMIX2。

32、00MOL/LMGCL21520MMOL/L外引物各1L甲酰胺1L内引物各1L水补足体系DMSO1L模板1L总体系50LPCR反应条件为95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸30秒，10个循环；95变性15秒，69退火15秒，72延伸15秒，25个循环；最后延伸7分钟。00455检测利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图1为检测结果示例。00466灵敏度和选择性实验样品阳性和阴性分别按照10、01、11、14、150、1500和15000（即以下所示的1X）的量比进行混合，且使混合后总体积为10。

33、0L。根据浓度计算所需体积，过程如下C1V1C2V21X；V1V2100；综合以上二方程得出V1200C2/XC1C2，V2100V1。0047已测得各样品浓度为C133NG/L，C24195NG/L。说明书CN104131091A1210/15页130048用EXCEL软件自动计算出各X对应下的V1和V2。得到1至7号新样品。混比XV1V2送测编号1原样100012原样01002500015597440332000424127588419650247949752150205000253699746600250000025429997570049荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图2）结果显示。

34、，本发明方法的灵敏度较高，检测选择性可达002。00507重复性和准确率1标准品进行10次实验，重复性和准确率达100。00512选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。00528检测优势比较我们选取了10例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法、AMRS法以及AMPMDS法进行EGFR基因的L858R突变检测并进行比较，比较结果参见表3。可见AMPMDS法的准确率最高，达到100，假阳性率大大优于ARMS法，假阴性率大大优于PCR测序法。0053表310例肺癌患者EGFR的L858R突变检测。

35、结果比较病理号PCR测序法ARMS法AMPMDS法临床用药后病理进程74673阳性阳性阳性PR74330阳性阳性阳性PR75674阳性阳性阳性PR111950阳性阳性阳性PR80404阳性阳性阳性PR72818阴性阳性阳性PR73090阴性阳性阳性PR71334阴性阳性阳性PR73729阴性阳性阴性PD74238阴性阳性阴性PD注CR完全缓解，PR部分缓解，SD稳定，PD进展。0054实施例二对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的缺失进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体EPIDERMALGROWTHFACTORREC。

36、EPTOR的19号外显子E74622352249DEL15点的基因缺失。0055实验材料如下试剂厂商RTAQ酶TAKARA宝生物公司10缓冲液TAKARA宝生物公司DNTPMIXTAKARA宝生物公司MGCL2TAKARA宝生物公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司说明书CN104131091A1311/15页14蛋白酶KQIAGEN公司QIAAMPMINELUTE柱QIAGEN公司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司样品和对照标准品制备过程如下1检测样本来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡。

37、2个小时，用酒精漂洗2次，加入100乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入15MLEP管中盖好盖。加入180LATL缓冲液和20L蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90消化60分钟。加入200LAL缓冲液充分混匀，再加入200L100乙醇混匀，将混合样品放入QIAAMPMINELUTECOLUMN中，8000RPM离心2MIN，然后分别用500LBUFFERAW1和500LBUFFERAW2分别6000G8000RPM离心1MIN洗脱，最后20000G1400。

38、0RPM离心3MIN甩干，加入100LATE20000G14000RPM离心1MIN洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。00562对照标准品的制备根据COSMIC数据库公布的EGFR基因19号外显子E74622352249DEL15位点基因野生型和缺失基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO32（野生型）5CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTC。

39、TCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCT。

40、CCCATGSEQIDNO33（缺失型）5CCCAGCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTCCACAGCCCCAGTGTCCCTCACCTTCGGGGTGCATCGCTGGTAACATCCACCCAGATCACTGGGCAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAACAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACC。

41、TCAGGCCCACCTTTTCTCATGTCTGGCAGCTGCTCTGCTCTAGACCCTGCTCATCTCCACATCCTAAATGTTCACTTTCTATGTCTTTCCCTTTCTAGCTCTAGTGGGTATAACTCCCTCCCCTTAGAGACAGCACTGGCCTCTCCCATG3引物设计TGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGTSEQIDNO11EX19DEL_OUT_FPGGATTTCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTSEQIDNO12EX19DEL_OUT_RP4PCR扩增PCR反应体系如下反应体系反应条件RTAQ酶25L10缓冲液5L说明书CN10。

42、4131091A1412/15页15DNTPMIX200MOL/LMGCL21520MMOL/L外引物各1L甲酰胺1L内引物各1LDMSO1L模板1L水补足体系总体系50LPCR反应条件为95预变性5分钟；95变性30秒，62退火30秒，72延伸30秒，10个循环；95变性15秒，65退火15秒，72延伸15秒，25个循环；最后延伸7分钟。00575检测利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。以合成的阳性、阴性DNA作为模板，图3为检测结果示例。00586选择性和灵敏度实验样品阳性和阴性分别按照10、01、11、14、150、1500和15000（即以。

43、下所示的1X）的量比进行混合，且使混合后总体积为100L。根据浓度计算所需体积，过程如下C1V1C2V21X；V1V2100；综合以上二方程得出V1200C2/XC1C2，V2100V1。0059已测得各样品浓度为C1352NG/L，C2366NG/L。0060用EXCEL软件自动计算出各X对应下的V1和V2。得到1至7号新样品。混比XV1V2送测编号1原样100012原样01002500015097490332000420537937419650203729796502050002075997960025000002079999870061荧光毛细管电泳检测灵敏度实验结果（图4）显示本发明的。

44、方法的选择性检测能力在002以上，检出灵敏度非常高。00627重复性和准确率1标准品进行10次实验，重复性和准确率达100。00632选取临床病理100例传统测序法和本发明方法进行比对，本实验方法检测灵敏度、准确率明显优于传统测序法，大大减低了传统测序法的假阴性率。00648检测优势比较我们选取了100例非小细胞肺癌患者的临床病例，分别利用PCR测序法以及我们的AMPMDS法进行EGFR基因的19外显子缺失检测并进行比较，比较结果参见下表4。0065表4100例肺癌患者EGFR的19外显子缺失检测结果比较说明书CN104131091A1513/15页16检测方法阳性检出例数检出率本发明的方法5。

45、5PCR测序法22实施例三对非小细胞肺癌的石蜡包埋的组织病理切片组织中的单突变进行检测。本实施例中以本发明的技术设计系列引物，并结合毛细管电泳检测样品中EGFR基因，即表皮生长因子受体EPIDERMALGROWTHFACTORRECEPTOR的20号外显子T790M突变位点的基因突变。0066实验材料如下试剂厂商RTAQ酶TAKARA宝生物公司10缓冲液TAKARA宝生物公司DNTPMIXTAKARA宝生物公司MGCL2TAKARA宝生物公司引物合成北京擎科新业生物技术有限公司甲酰胺美国SIGMA公司DMSO美国SIGMA公司蛋白酶KQIAGEN公司QIAAMPMINELUTE柱QIAGEN公。

46、司AW1、AW2、ATL等QIAGEN公司样品和对照标准品制备过程如下1检测样本来源自医院病理科的经过石蜡包埋的病理切片，将组织切片放到染片缸中，加入二甲苯充分浸泡2个小时，用75酒精漂洗2次，加入100乙醇浸泡10分钟，晾干。将晾干的组织切片平放实验台上固定，用平板刮刀小心的将组织片从玻片上剥离，迅速将组织样品放入15MLEP管中盖好盖。加入180LATL缓冲液和20L蛋白酶K，用震荡器充分混匀，将混合物放入水浴锅中56消化60分钟。将消化后的混合物放入水浴锅中90消化60分钟。加入200LAL缓冲液充分混匀，再加入200L100乙醇混匀，将混合样品放入QIAAMPMINELUTECOLUM。

47、N中，8000RPM离心2MIN，然后分别用500LBUFFERAW1和500LBUFFERAW2分别6000G8000RPM离心1MIN洗脱，最后20000G14000RPM离心3MIN甩干，加入100LATE20000G14000RPM离心1MIN洗脱后收集洗脱液体进行DNA质量鉴定。00672对照标准品的制备根据COSMIC数据库公布的EGFR基因20号外显子第T790M突变位点基因野生型和突变基因序列进行比较分析，直接人工合成标准序列SEQIDNO345AGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACC。

48、TCCACCGTGCAGCTCATCAKGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGCGGTCTGC3，其中K为C（野生型）或A（突变）3引物设计AGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACSEQIDNO17；T790M_OUT_FPGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCSEQIDN。

49、O18；T790M_OUT_RPCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATAACSEQIDNO19；T790M_IN_FP说明书CN104131091A1614/15页17CAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTTCASEQIDNO20；T790M_IN_RP4PCR扩增PCR反应体系如下反应体系反应条件RTAQ酶25L10缓冲液5LDNTPMIX200MOL/LMGCL21520MMOL/L外引物各1L甲酰胺1L内引物各1LDMSO1L模板1L水补足体系总体系50LPCR反应条件为95预变性5分钟；95变性30秒，60退火30秒，72延伸30秒，10个循环；95变性15秒，69退火15秒，72延伸15秒，25个循环；最后延伸7分钟。00685检测利用荧光毛细管电泳（ABI公司3730测序仪）检测PCR结果中带有荧光的目的基因。00696灵敏度与选择性实验。0070样品阳性和阴性分别按照10、01、11、14、150、1500和15000的量比进行混合，得到1至8号新样品。序号模板MA。

展开阅读全文