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1、10申请公布号CN104130986A43申请公布日20141105CN104130986A21申请号201410309468922申请日20140630C12N9/04200601C12N15/53200601C12N1/21200601C12P7/46200601C12R1/1920060171申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市下城区潮王路18号申请人杭州中美华东制药有限公司72发明人柳志强郑裕国林善薛亚平吴晖李邦良许静许峰袁水金王鸿艳74专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司33201代理人黄美娟李世玉54发明名称冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶B、编码基因及其应用57摘要本发。
2、明涉及两个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶B，编码这个酶的基因及其应用。所述苹果酸脱氢酶B的氨基酸序列与SEQIDNO1所示的蛋白具有90以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQIDNO2所示序列具有90以上同源性。本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化苹果酸制备相应的草酰乙酸的酶对应编码基因的表达，赋予宿主苹果酸脱氢酶B的高表达性，为扩大苹果酸脱氢酶B的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表3页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表3页附图4页10申请公布号CN104130986ACN104130986A1/1页21一种冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶B，其特征在于所述脱氢酶B的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。2如权利要求1所述的苹果酸脱氢酶B在生物催化苹果酸制备草酰乙酸中的应用。3如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为以含苹果酸脱氢酶B基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用PH80磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎，离心，取上清液为催化剂，以01M苹果酸水溶液为底物，以375MM的NADH水溶液为辅酶，于PH值为70的磷酸缓冲液中，37下反应，反应结束后，将反应液离心，。
4、取上清液获得含草酰乙酸的混合液。4如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的用量以苹果酸质量计，所述苹果酸的初始浓度为005M，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为41G/L，所述NADH的用量为375MOL/L。5如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备将含苹果酸脱氢酶B的重组工程菌接种于含终浓度50G/ML的KAN抗性的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养过夜，取培养物，以体积浓度2的接种量转接于含有50G/MLKAN抗性的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养至菌体浓度OD600为0608，向培养物中加入终浓度005MMOL/L的IPTG诱导培养。
5、8H，收集湿菌体，将湿菌体在功率40、破1S停1S条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。6一种编码权利要求1所述苹果酸脱氢酶B的基因。7如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。8如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化苹果酸制备草酰乙酸的基因工程菌中的应用。9如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为构建含有所述苹果酸脱氢酶B基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有苹果酸脱氢酶B基因的菌体细胞。权利要求书CN104130986A1/12页3冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶。
6、B、编码基因及其应用一技术领域0001本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶BMALICDEHYDROGENASE，编码这个酶的基因及其应用。二背景技术0002冬虫夏草CORDYCEPSSINENSISBERKSACC是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目LEPIDOPTERA蝙蝠蛾科昆虫HEPIALUSARMORICANUSOBERTHUR幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体包括子座和虫体。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界。
7、范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。0003冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段无性型和子囊孢子阶段有性型。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证。
8、明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。0004但是，对冬虫夏草中国被毛孢中苹果酸脱氢酶的研究几乎为空白，尤其在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶的研究上。0005苹果酸脱氢酶EC11137是催化L苹果酸脱氢变成草酰乙酸的酶。它以NAD作为电子受体。广义上也包括以NAD或NADP作为受体而生成丙酮酸和碳酸的苹果酸酶EC1113840。与NADP也有弱反应，也可将其它羟酸脱氢。广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上，为三羧酸循环中的一种酶。由于酶的来源不同，其某些性质也不一样。苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下脱氢生成草酰乙酸，脱下的氢由NAD接受生成NADHH。再生的草。
9、酰乙酸可再次进入三羧酸循环用于柠檬酸的合成。0006苹果酸脱氢酶普遍存在于动物，植物，细菌各种生物体中，具有高度的保守性。苹果酸脱氢酶不仅参与众多生理活动，包括C4循环，呼吸作用，脂肪酸的氧化，TCA循环等，而且在种子萌发，植物生长，花粉发育，果实发育，植物抗逆等方面发挥重要作用。00071993年，FCENDRIN等人从极端嗜盐古细菌HALOARCULAMARISMORTUI中分离和测序了一个编码的酶苹果酸脱氢酶MDH的基因。该酶是由303个氨基酸组成，其分子量为32638道尔顿。00082008年，朱文漓等人以实验室构建的草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLUS肠道CDNA文库苹。
10、果酸脱氢酶CMDHEST序列为基础，采用末端快速扩增法RACE，从健康雌性草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLUS肠道细胞RNA中获得1391BP的草鱼肠道CMDH的CDNA说明书CN104130986A2/12页4序列NCBI登录号EU569765。结果显示该序列包含62BP的5非编码区5UTR，330BP的3非编码区3UTR，典犁加尾信号AATAA位于POLYA起点上游16BP。开放阅读框ORF长999BP，共编码333个氨基酸，预测蛋白等电点为667，大小为36KDA。00092008年，姚玉欣等人从苹果果实中分离了CYMDH的全长CDNA序列，该序列含有一个996BP的开放阅。
11、读框ORF。序列同源性分析表明MALCYMDH与其他物种CYMDH有较高的同源性。原核表达得到一个37KD左右的融合蛋白，酶活测定表明该酶主要催化合成苹果酸。00102011年，李倩等人以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到苹果酸脱氢酶MDH编码基因MDH，构建了重组菌PET28AMDH/BL21并成功表达了苹果酸脱氢酶，大小约36000。选用NI柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶，纯化后比酶活达到1125U/MG，纯化倍数达262倍，回收率为59。00112011年，GNAVA等人从猪带绦虫胞浆中克隆到了一个苹果酸脱氢酶的完整编码序列。这个苹果酸脱氢酶的CDNA序列从猪带绦虫基因组项目数。
12、据库发现，编码332个氨基酸残基的蛋白质，分子量大约为365KDA。00122012年，李文爽等人利用电子克隆技术获得大豆中的苹果酸脱氢酶基因CDNA序列，并对基因及其编码蛋白进行生物信息学分析和预测，为进一步克隆该基因、解决植物磷高效基因数量缺乏等问题提供依据。结果表明，大豆中的苹果酸脱氢酶基因GMMDH1CDNA序列长度为1574BP，开放阅读框1230BP，编码409个氨基酸残基。00132013年，YYCHANG等人从THERMUSTHERMOPHILUS的基因组中扩增到了一个苹果酸脱氢酶基因，并且克隆岛PET21B载体上进行了表达。该蛋白在大肠杆菌菌株BL21DE3中以可溶形式存在。。
13、0014但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中苹果酸脱氢酶的基因相关信息。三发明内容0015本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的一种苹果酸脱氢酶B、以及编码的基因及其应用。0016本发明采用的技术方案是0017一种中国被毛孢参与三羧酸循环的柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶BMALICDEHYDROGENASE，所述酶的氨基酸序列与SEQIDNO1所示序列具有90以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含。
14、有SEQIDNO1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。0018优选的，所述苹果酸脱氢酶B氨基酸序列如SEQIDNO1所示记为MDHB蛋白；说明书CN104130986A3/12页5该酶可催化苹果酸制备相应的草酰乙酸。0019本发明述苹果酸脱氢酶B来自“百令”生产。
15、菌冬虫夏草中国被毛孢。0020由苹果酸经过苹果酸脱氢酶B的催化获得对应草酰乙酸的路径如下所示00210022本发明还涉及所述的苹果酸脱氢酶B在生物催化苹果酸制备相应的草酰乙酸中的应用，所述应用为以本发明苹果酸脱氢酶B催化苹果酸制备相应的草酰乙酸。具体的，所述的应用为以含苹果酸脱氢酶B基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用磷酸盐缓冲液50MM、PH80悬浮，超声细胞破碎后，离心，取上清液为催化剂，以01M苹果酸水溶液为底物，以375MM的NADH水溶液为辅酶，于PH值为70的磷酸缓冲液中，37下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液，获得含草酰乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得草酰乙酸。
16、，所述分离纯化的方法为本领域公知，通常采用亲和层析方法。0023所述底物的用量以苹果酸质量计，所述苹果酸的初始浓度为005M终浓度，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为415G/L终浓度优选41G/L，所述NADH的用量为375MOL/L终浓度。0024所述催化剂按如下方法制备将含苹果酸脱氢酶B基因的重组工程菌接种于含终浓度50G/ML的KAN抗性的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养过夜，取1ML培养物，将其转接接种量为体积浓度2于50ML含有终浓度50G/MLKAN抗性的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养至菌体浓度OD600为0608，向培养物中加入终浓度005M。
17、MOL/L的IPTG诱导培养8H，收集湿菌体，将湿菌体在功率40、破1S停1S条件下超声破碎3次，每次5MIN，离心，取上清液即为催化剂。0025本发明还涉及所述苹果酸脱氢酶B编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO2所示记为MDHB基因；MDHB基因编码MDHB蛋白。0026由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体。
18、是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。0027所述的苹果酸脱氢酶B基因可用于构建能够生物催化苹果酸制备相应的草酰乙酸的基因工程菌，以扩大苹果酸脱氢酶B的应用，具体为构建含有所述苹果酸脱氢酶B基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌优选ECOLIBL21DE3中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有苹果酸脱氢酶B基因的菌体细胞。0028本发明的要点在于提供了SEQIDNO1所示的氨基酸序列和SEQIDNO2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的说明书CN104。
19、130986A4/12页6获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。0029能够提供本发明所述冬虫夏草苹果酸脱氢酶B及其编码基因的菌株为中国被毛孢HIRSUTELLASINENSISL0106，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。0030本发明的有益效果主要体现在本发明从原理上对催化苹果酸制备相应的草酰乙酸进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶B及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来。
20、通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化苹果酸制备相应的草酰乙酸的酶对应编码基因的表达，赋予宿主苹果酸脱氢酶B的高表达性，为扩大苹果酸脱氢酶B的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。四附图说明0031图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；0032图2为中国被毛孢苹果酸脱氢酶参与三羧酸循环过程注释图；0033图3为苹果酸脱氢酶B基因PCR扩增产物凝胶电泳图；0034图4为克隆载体PMD18TVECTOR与表达载体PET28A物理图谱；0035图5为重组克隆质粒PMD18T/MDHB物理图谱；0036图6为重组表达质粒PET28A/MDHB构建过程。
21、示意图；0037图7为重组表达质粒PET28A/MDHB物理图谱；0038图8为苹果酸脱氢酶B蛋白的SDSPAGE图。五具体实施方式0039下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0040实施例1“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养0041菌株来源首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢HIRSUTELLASINENSIS，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。0042将该菌种接种于斜面，培养基配方此为固。
22、化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面为葡萄糖20W/V，1表示100ML培养基中含有1G，下同、玉米粉10、土豆汁05、糊精05、酵母粉05、麸皮10、蚕蛹粉20、蛋白胨10、硫酸镁005、磷酸二氢钾005、琼脂粉10，余量为水；在1216培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖10、糖蜜10、蚕蛹粉05、黄豆饼粉10、酵母膏05、硫酸镁001、磷酸二氢钾002，余量为水；置于摇床上，温度1216培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。0043实施例2“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取0044用TRIZOL试剂提取。
23、总RNA，步骤具体为说明书CN104130986A5/12页700451液氮研磨取1G新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的15ML离心管中，加入1MLTRIZOL试剂，混匀，冰上静置5MIN，使核酸蛋白复合物完全分离。00462RNA分离加入02ML氯仿，用力震荡混匀15S，冰上静置23MIN，4、12000RPM离心15MIN，分层，取上层水相，约600L。00473RNA沉淀加入500L异丙醇，在冰上静置10MIN，4、12000RPM离心10MIN，弃上清。00484RNA洗涤加入1ML75V/V乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10MIN，4、7500RPM离心15M。
24、IN；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。00495溶解RNA将离心管置于冰上敞开干燥510MIN，加适量DEPC水溶解。0050实施例3“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序0051提取样品总RNA后，用带有OLIGODT的磁珠富集MRNA。加入FRAGMENTATIONBUFFER将MRNA打断成短片段200700BP，以MRNA为模板，用六碱基随机引物RANDOMHEXAMERS合成第一条CDNA链，然后合成第二条CDNA链，再经过QIAQUICKPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加POLYA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的。
25、测序文库用ILLUMINAGAIIX进行测序。测序得到的原始图像数据经BASECALLING转化为序列数据，即RAWDATA或RAWREADS。除去原始测序READS中只含ADAPTOR序列的READS，备以后续分析。0052实施例4“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装0053使用短READS组装软件SOAPDENOVOLI,ZHUETALDENOVOASSEMBLYOFHUMANGENOMESWITHMASSIVELYPARALLELSHORTREADSEQUENCINGJGENOMERES,2010,20265272做转录组从头组装。SOAPDENOVO首先将具有一定长度OV。
26、ERLAP的READS连成更长的不含N的CONTIG片段。然后将READS比对回CONTIG，通过PAIREDENDREADS确定来自同一转录本的不同CONTIG以及这些CONTIG之间的距离，SOAPDENOVO将这些CONTIG连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到SCAFFOLD。进一步利用PAIREDENDREADS对SCAFFOLD做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的UNIGENE序列。最后，将UNIGENE序列与蛋白数据库NR、SWISSPROT、KEGG和COG做BLASTX比对EVALUE000001，取比对结果最好的蛋白确定UNIGENE的序列方向。如果不同库之。
27、间的比对结果有矛盾，则按NR、SWISSPROT、KEGG和COG的优先级确定UNIGENE的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的UNIGENE用软件ESTSCANISELI,JONGENEELETALESTSCANAPROGRAMFORDETECTING,EVALUATING,ANDRECONSTRUCTINGPOTENTIALCODINGREGIONSINESTSEQUENCESJINPROCEEDINGSOF9THINTERNATIONALCONFERENCEONINTELLIGENTSYSTEMSFORMOLECULARBIOLOGYAAAIPRESS,MENLOPARK,CA,PP19。
28、99,138148预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的UNIGENE给出其从5到3方向的序列，对于无法确定序列方向的UNIGENE给出组装软件得到的序列。0054实施例5“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢UNIGENE功能注释0055功能注释信息给出UNIGENE的蛋白功能注释、PATHWAY注释、COG功能注释和GENEONTOLOGYGO功能注释。首先，通过BLASTX将UNIGENE序列比对到蛋白数据库NR、SWISSPROT、KEGG和COGEVALUE000001，得到跟给定UNIGENE具有最高序列相似性的蛋说明书CN104130986A6/12页8白，从而得到该UNI。
29、GENE的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到UNIGENE的PATHWAY注释。将UNIGENE和COG数据库进行比对，预测UNIGENE可能的功能并对其做功能分类统计。根据NR注释信息，使用BLAST2GO软件CONESA,GOTZETALBLAST2GOAUNIVERSALTOOLFORANNOTATION,VISUALIZATIONANDANALYSISINFUNCTIONALGENOMICSRESEARCHJBIOINFORMATICS,2005,211836743676得到UNIGENE的GO注释信息。得到每个UNIGENE的GO注释后，用WEGO软件YE,FANGE。
30、TALWEGOAWEBTOOLFORPLOTTINGGOANNOTATIONSJNUCLEICACIDSRESEARCH,2006,34293297对所有UNIGENE做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。0056实施例6“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶催化的循环过程的分析0057图2是中国被毛孢苹果酸脱氢酶参与三羧酸循环的过程图。三羧酸循环是用于将乙酰COA中的乙酰基氧化成二氧化碳和还原当量的酶促反应的循环系统，该循环的第一步是由乙酰COA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。反应物乙酰辅酶A是糖类、脂类、氨基酸代谢的共同的中间产物，进入循环后会被分解最终生成产物二氧化碳。
31、并产生H，H将传递给辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD，使之成为NADHH和FADH2。NADHH和FADH2携带H进入呼吸链，呼吸链将电子传递给O2产生水，同时偶联氧化磷酸化产生ATP，提供能量。从中国被毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了苹果酸脱氢酶B的UNIGENE。通过NCBI中的ORFFINDER软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框SEQIDNO2并得到了相应的蛋白质序列SEQIDNO1。0058实施例7“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢苹果酸脱氢酶B基因引物设计0059运用GENERUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用。
32、于克隆“百令”生产菌中国被毛孢降解在参与三羧酸循环用于柠檬酸合成中的苹果酸脱氢酶B基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列0060MDHB基因正向引物5AGAGAATTCATGGACGAGTTCATGGAGGC30061反向引物5ATAGCGGCCGCTCACAGACGGCCCTTGGC30062MDHB基因长度为1137BP。0063实施例8“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢CDNA第一链的制备0064先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢CDNA。
33、第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。0065采用PRIMESCRIPT1STSTRANDCDNASYNTHESISKIT试剂盒TAKARA从TOTALRNA中反转录合成CDNA第一链，实验步骤如下00661在MICROTUBE管中配制下列混合液。0067说明书CN104130986A7/12页900682变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下006965，5MIN00703退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于MICROTUBE管底部。00714在上述MICROTUBE管中配。
34、制下列反转录反应液。007200735在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。0074421530MIN00757015MIN0076一般情况，在真核生物MRNA3末端都有一个POLYA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用OLIGODT引物，在反转录酶的作用下，以MRNA为模板合成CDNA第一链，本发明采用由TAKARA独自开发的DT区域的序列PRIMESCRIPT1STSTRANDCDNASYNTHESISKIT中提供为引物，如果获得的MRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的CDNA第一链。0077实施例9“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢苹果。
35、酸脱氢酶B基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测00781、苹果酸脱氢酶B基因的PCR扩增0079以实施例8中得到的CDNA第一链为模板，用实施例7中合成的苹果酸脱氢酶B基因引物5AGAGAATTCATGGACGAGTTCATGGAGGC3和5ATAGCGGCCGCTCACAGACGGCCCTTGGC3进行PFUDNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下0080PFUPCR扩增反应体系0081说明书CN104130986A8/12页100082PFUDNAPLOYMERASEPCR扩增条件008300842、苹果酸脱氢酶B基因PCR产物凝胶电泳检测0085具体检测方法为00861将配制好的09的琼脂。
36、糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；00872取15ML琼脂糖凝胶，待琼脂糖凝胶冷却至50左右时，加入1L染色液GOLDVIEW，混合均匀后倒入电泳琼脂糖凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；00883琼脂糖凝胶板上凝胶凝固后，小心取出点样梳，将琼脂糖凝胶板放入电泳槽中点样孔一端靠近电泳槽的负极，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；00894取5L样品然后加入6LOADINGBUFFER15L和DDH2O4L混合后用移液枪上样，上样量为10L；00905连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；00916开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/CM；00927当样品跑过琼脂糖凝胶板的2/3时可。
37、终止电泳；00938切断电源后，将琼脂糖凝胶板上凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。0094转录组测序预测苹果酸脱氢酶B基因的大小为1137BP，琼脂糖凝胶电泳结果表明已成功扩增出了苹果酸脱氢酶B基因，大小约为1100BP。图3为“百令”生产菌中国被毛孢苹果酸脱氢酶B功能基因PCR产物凝胶电泳图。说明书CN104130986A109/12页1100953、苹果酸脱氢酶B基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化0096由于PFUDNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下00970098PCR仪中72加A碱基20MIN，最。
38、后用AXYPREPPCR清洁试剂盒纯化。00994、苹果酸脱氢酶B基因与克隆载体的连接0100克隆载体PMD18TVECTOR购自TAKARA公司TAKARACODED101A，其物理图谱见图4，将步骤3纯化后的苹果酸脱氢酶B基因与克隆载体连接构建重组质粒PMD18T/MDHB，物理图谱见图5，连接体系和连接条件如下。0101连接体系01020103连接条件16，16H；灭活65，15MIN。01045、苹果酸脱氢酶B重组质粒PMD18T/MDHB的转化0105将重组质粒PMD18T/MDHB转入大肠杆菌ECOLIJM109中，构建携带苹果酸脱氢酶B基因的重组菌ECOLIJM109/PMD18。
39、T/MDHB，具体步骤为1将10L反应体系即步骤4的连接产物转至感受态细胞ECOLIJM109中，冰浴30MIN；2热击42，90S；3冰浴23MIN；4加入800L液体LB，37，250RPM，1H；5涂布平板含AMP抗性，终浓度50G/ML；637培养箱培养过夜。01066、苹果酸脱氢酶BECOLIJM109/PMD18T/MDHB阳性重组菌的筛选0107菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，以验证。
40、是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50L无菌水的15ML离心管中，沸水浴说明书CN104130986A1110/12页1230MIN，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，PCR程序设定为TAQ酶扩增一般程序。最后采用09的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。01087、苹果酸脱氢酶B重组质粒PMD18T/MDHB的测序0109对菌落PCR检测出的阳性重组菌接种至液体LB培养基，37、150RPM培养过夜后，取4ML菌液提取质粒，方法按AXYPREP质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQIDNO2已重组至PMD18T/MDHB。
41、中。01108、苹果酸脱氢酶B重组表达质粒PET28A/MDHB的构建0111实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体PET28A和苹果酸脱氢酶B基因酶切位点比对情况，确定了MDHB用ECOR/NOT双酶切位点，并对重组大肠杆菌ECOLIJM109/PMD18T/MDHB进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。0112苹果酸脱氢酶B基因的重组质粒PMD18T/MDHB及表达载体PET28A分别用ECOR/NOT限制性内切酶在37分别酶切处理6H，酶切体系如下所示0113ECOR/NOT双酶切体系01140115酶切结束后，65灭活15MIN，然后分别用AXYGENDNA凝胶回收试剂。
42、盒进行回收、纯化。0116苹果酸脱氢酶B基因及表达载体PET28A经双酶切、纯化后，再用T4连接酶16连接过夜，构建重组表达质粒PET28A/MDHB，其构建过程见图6，构建得到的重组表达质粒PET28A/MDHB图谱见图7。连接体系组成如下0117连接体系011801199、苹果酸脱氢酶B重组表达质粒的转化以及阳性单克隆的筛选0120将构建好的表达质粒热激转化至ECOLIBL21DE3宿主菌中，然后涂布到含有卡说明书CN104130986A1211/12页13那霉素KAN抗性终浓度50G/ML的LB琼脂平板上，37培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以步骤7中合成的苹果酸脱氢酶B基因引物进行P。
43、CR扩增，挑选阳性克隆。012110、苹果酸脱氢酶B重组菌的诱导表达0122将鉴定为阳性的单克隆接种于5ML含有KAN抗性终浓度50G/ML的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养过夜。取1ML培养物，将其转接于50ML含有KAN抗性终浓度50G/ML的LB液体培养基中，37、250R/MIN培养至菌体浓度OD600约为0608左右。向培养物中分别加入一定浓度的IPTG终浓度005MMOL/L诱导培养8H。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。012311、苹果酸脱氢酶B重组菌表达产物SDSPAGE分析0124以转入空载体的ECOLIBL21DE3菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。鉴定。
44、为阳性的重组菌经IPTG诱导培养7H后，取05ML诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50L蒸馏水中，加入50L上样缓冲液，混匀后煮沸10MIN，进行SDSPAGE电泳分析，图8中的“A”泳道为大肠杆菌BL21DE3空细胞的SDSPAGE图，“B”泳道为重组菌ECOLIBL21DE3/PET28A加IPTG诱导后的SDSPAGE图，“C”泳道为重组菌ECOLIBL21DE3/PET28A/MDHB未加IPTG的对照SDSPAGE图，“D”泳道即为重组菌ECOLIBL21DE3/PET28A/MDHB诱导表达的SDSPAGE图。表明重组菌ECOLIBL21DE3/PET28A/MDHB含苹果酸脱氢酶。
45、B经测序验证其氨基酸序列如SEQIDNO1所示。012512、苹果酸脱氢酶B重组菌的蛋白活力检测012602M的磷酸缓冲液称取3561G的磷酸氢二钠和3121G的磷酸二氢钠于100ML的容量瓶中，并加水至刻度线处，保存于棕色瓶备用，用洁净的橡皮塞将瓶口盖严。0127375MMNADH溶液称取286G的NADH用水溶于100ML的容量瓶中，并加水至刻度线处，保存于棕色瓶备用，用洁净的橡皮塞将瓶口盖严。01281MM草酰乙酸的标准溶液称取132MG的草酰乙酸用水溶于100ML的容量瓶中，并加水至刻度线处，保存于棕色瓶备用，用洁净的橡皮塞将瓶口盖严。按表1制作草酰乙酸的标准曲线，方程为Y25488X。
46、00334，R209963，其中Y为340NM下的吸光值，X为标准品的浓度。0129表1草酰乙酸的标准曲线01300131说明书CN104130986A1312/12页140132酶液制备称取步骤10收集的重组菌ECOLIBL21DE3/PET28A/MDHB湿菌体2G，用磷酸盐缓冲液50MM、PH80100ML悬浮，高压破碎仪型号FS600，上海生析超声仪器有限公司在功率40、破1S停1S条件下破碎3次35KPA，过滤除去菌体，得到粗酶液813ML。0133苹果酸脱氢酶B转化体系在50ML转化瓶中加入1ML的ECOLIBL21DE3/PET28A/MDHB高压破碎后收集的粗酶液、02M的磷酸。
47、缓冲液1ML、375MM的NADH水溶液1ML和01M的苹果酸水溶液3ML。37水浴反应10MIN后，12000R/MIN离心5MIN，终止反应，取上清液测酶活。0134定上清液中草酰乙酸的量，苹果酸脱氢酶B分解苹果酸生成草酰乙酸，随着草酰乙酸的增加，A340NM也逐渐变大，从草酰乙酸浓度一吸光度值曲线上可以得到任一吸光度值对应的草酰乙酸浓度。0135一个苹果酸脱氢酶B酶活单位U定义为苹果酸脱氢酶B每分钟分解苹果酸产生1MOL草酰乙酸的酶量。0136检测苹果酸脱氢酶B酶活的空白对照为煮沸20MIN后失活的粗酶液替代酶液。另外，同样条件下也检测了ECOLIBL21DE3和ECOLIBL21DE3。
48、/PET28A诱导后的粗酶液的活力，均未检测到苹果酸脱氢酶B酶活。0137利用考马斯亮蓝法测得苹果酸脱氢酶B粗酶液中的蛋白含量为0198MG/ML，通过BANDSCAN软件，对SDSPAGE中的粗酶液条带含量进行分析，苹果酸脱氢酶B占总蛋白的185，故参与催化反应的苹果酸脱氢酶B为0198MG/ML1ML018500366MG。根据酶活定义，苹果酸脱氢酶B的最大比酶活为502MOL/00366MG10MIN1372MOL/MG/MIN1372U/MG。因此，苹果酸脱氢酶B重组菌所表达的苹果酸脱氢酶B的最大比酶活为584U/MG，上述反应的转化率为167。比酶活计算公式为比酶活酶活/酶的蛋白总量。转化率计算公式为转化率初始浓度平衡浓度/初始浓度。说明书CN104130986A141/3页150001序列表CN104130986A152/3页1600020003序列表CN104130986A163/3页17序列表CN104130986A171/4页18图1图2图3说明书附图CN104130986A182/4页19图4图5说明书附图CN104130986A193/4页20图6图7说明书附图CN104130986A204/4页21图8说明书附图CN104130986A21。