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1、(10)申请公布号 CN 102236020 A (43)申请公布日 2011.11.09 CN 102236020 A *CN102236020A* (21)申请号 201010152498.5 (22)申请日 2010.04.20 G01N 33/576(2006.01) G01N 33/533(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (71)申请人 上海新波生物技术有限公司 地址 201201 上海市浦东新区瑞庆路 590 号 5 号甲幢 (72)发明人 张小寒 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 31113 代理人 张劲风 (54) 发明名称 。
2、丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法 及试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了丙型肝炎病毒抗体诊断时间分 辨免疫荧光分析法及试剂盒， 其选用多片段融合 HCV 重组抗原作为包被抗原， 用碳酸钠缓冲溶液 稀释至 1-10ug/mL 作为包被液 ； 配对 HCV 重组抗 原用生物素标记作为标记抗原 ； 链亲和素用镧系 元素标记 ； 实验时用反应缓冲液按 1 21 稀释使 用 ； 在包被抗原的反应板上， 每孔依次加入 25uL 的 HCV 阴阳性对照或待测样品、 以及稀释的生物 素标记抗原， 孵育洗板后在加入稀释好的链亲和 素铕标记， 孵育后进行荧光检测。 本发明还提供相 应的试剂盒。 本发明具有较。
3、高的灵敏度、 特异性及 稳定性 ； 且分析系统高度自动化， 可提高临床检 验结果的速度， 可大幅度降低人为误差和增加检 出结果的可靠性。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 102236024 A1/1 页 2 1. 丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 其特征是包括下列步骤 ： 固相抗体制备 ： 将HCV重组抗原用碳酸盐缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液， 包 被反应板， 形成固相抗体， 并用封闭液封闭 ； 生物素标记抗原的制备 ： 用生物素对配对抗原进行标记 ； 镧系元素离子。
4、标记抗体制备 ： 链亲和素用常规方法进行镧系元素离子标记 ； 在步骤制得的具有固相抗体的反应板上， 每孔加入 HCV 阴阳性对照或待测样品， 以及用反应缓冲液稀释的标记抗原进行孵育， 洗板后加入稀释好的铕标记链亲和素再次进 行孵育， 最后进行荧光测定。 2. 根据权利要求 1 所述丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 其特征是步骤 中配对抗原和步骤链亲和素用反应缓冲液以体积比为 1 21 稀释。 3. 根据权利要求 1 所述丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 其特征是步骤 中的镧系元素离子为 Eu3+。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 其。
5、特征是所 述的反应缓冲液为 pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl， 内含 0.9 NaCl， 1 BSA， 0.5酪蛋白， 0.08吐温 20 和 0.1 NaN3。 5. 根据权利要求 1 所述丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 其特征是步骤 在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。 6. 丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒， 其特征是试剂盒包括 ： 包被抗原的缓冲液、 封闭液、 反应缓冲液、 工作洗涤液、 荧光增强液， 作为包被 HCV 重组抗原， 生物素标记抗原和镧系元 素离子标记的链亲和素。 7. 根据权利要求 6 所述的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒， 其特征是 ： 包被抗原。
6、的缓冲液 ： 碳酸盐缓冲液， 封闭液 ： 磷酸盐缓冲液及 2的 BSA， 反应缓冲液 ： pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl， 内含 0.9 NaCl， 1 BSA， 0.5酪蛋白， 0.08吐温 20 和 0.1 NaN3， 工作洗涤液 ： 磷酸盐缓冲液， 荧光增强液 ： 二酮体。 权 利 要 求 书 CN 102236020 A CN 102236024 A1/3 页 3 丙型肝炎病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒 技术领域 ： 0001 本发明涉及丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒， 属于时间分辨免疫荧光分析法检测领 域。 背景技术 ： 0002 丙型肝炎病毒 (Hepat。
7、itis C Virus， HCV) 是引起输血后非甲非乙型肝炎 (Post-transfusion non-A non-B Hepatitis， PT-NANBH) 的主要病原因子。HCV 感染者急 性期的症状不如 HAV 或 HBV 感染后的症状明显， 黄疸比例较低， 但 HCV 感染者比 HBV 感染更 易慢性化， 约有 50的 HCV 感染者发展成慢性肝炎， 其中的 20的患者最终变成肝硬化和 肝癌。全世界目前约有 1.7 亿以上的 HCV 感染者 ； 我国将近 4000 万， 为 HCV 的高流行区， 感 染率在 0.9 5.1之间， 平均为 3.1。 0003 HCV 传播最主要的。
8、途径是输血和输入血液制品， 此外， 目前认为可能的传播方式还 包括 ： 共用针头及注射器 ( 如通过静脉注射吸毒者 )、 性接触及家庭成员的密切接触、 母婴 垂直传播、 医源性传播等 ； 我国 HCV 感染的主要途径是通过输血及血液制品传播。 0004 丙型肝炎病毒 (HCV) 自从 1989 年被发现以来， 科学家们已进行了大量研究， 建立 了各种检测方法。我国的抗 HCV 试剂自 1994 年问世以来， 已逐步完善并被普遍用于血源筛 查和临床诊断。当前 HCV 抗体诊断试剂为第三代试剂， 在灵敏度和特异性方面均比前代试 剂有很大提高， 但是在早期诊断和低危人群的诊断方面仍有一些不足。 00。
9、05 时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoroimmunoassay， TRFIA)利用具有独 特荧光特性的镧系元素， 代替酶、 同位素等， 做为发光免疫分析中的一种重要方法， 具有灵 敏度高、 示踪物稳定、 不受样品自然荧光干扰、 无放射性污染等许多优点。 发明内容 ： 0006 本发明的目的是提供一种用于丙型肝炎病毒 (HCV) 抗体检测的时间分辨免疫荧 光分析法及试剂盒， 主要解决现有技术存在的灵敏度低、 稳定性差、 操作烦琐及污染环境等 技术问题。本发明采用铕标记技术， 提供铕标记试剂盒， 以提高方法的灵敏度及稳定性。 0007 本发明的技术方案是 ： 丙型肝炎病。
10、毒抗体时间分辨免疫荧光分析法， 包括下列步 骤 ： 0008 固相抗体制备 ： 将 HCV 重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释至 1-10ug/mL 作为包被 液， 包被反应板， 形成固相抗体， 并用封闭液 ( 磷酸盐缓冲液及 2 (W/V) 的牛血清白蛋白 (BSA) 封闭 ； 0009 生物素标记抗原的制备 ： 用生物素对配对抗原进行标记 ； 0010 镧系元素离子标记抗体制备 ： 链亲和素用常规方法进行镧系元素离子标记 ； 0011 在步骤制得的具有固相抗体的反应板上， 每孔加入 HCV 阴阳性对照或待测样 品， 以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育， 经荧光增强液解离后， 最后进行荧光测 定。
11、。 说 明 书 CN 102236020 A CN 102236024 A2/3 页 4 0012 步骤中包被液中 HCV 重组抗原的浓度为 1-10ug/mL， 步骤中配对抗原和步骤 链亲和素需用反应缓冲液(pH 7.8的50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)， 内 含 0.9 NaCl， 1 BSA， 0.5酪蛋白， 0.08吐温 (Tween)20 和 0.1 NaN3( 反应缓冲液组 分指的是 W/V) 以体积比 1 21 稀释。步骤中的镧系元素离子优选为 Eu3+。步骤 中的反应缓冲液同步骤， 步骤在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成， 荧光增强液 为 二酮体。 。
12、0013 丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒， 其特征是试剂盒包括 ： 包被抗原的缓冲液 ( 碳酸 盐缓冲液 )、 封闭液 ( 磷酸盐缓冲液及 2 (W/V) 的 BSA)、 反应缓冲液 (pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl， 内含 0.9 NaCl， 1 BSA， 0.5酪蛋白， 0.08 Tween20 和 0.1 NaN3)、 工作洗 涤液(磷酸盐缓冲液)、 荧光增强液， 作为包被HCV重组抗原， 生物素标记抗原和镧系元素离 子标记的链亲和素。 0014 本发明使用双抗体夹心法， 反应步骤包括 ： 试剂准备、 加样反应、 洗涤拍干、 加增强 液、 测荧光值。 0015 本发明的。
13、有益效果是 ： 分析灵敏度高 ( 符合或者超过 HCV 国家参比品的要求 )， 检 测时间短 (60min)， 特异性好， 与干扰物质的交叉反应小。 附图说明 ： 0016 图 1 为本发明的反应原理图 0017 本发明采用双抗原夹心法。HCV 重组抗原包被于 96 孔荧免板， 阴阳性对照或样品 中的 HCV 抗体与包被抗原和生物素标记抗原于微孔内表面发生免疫反应 ； 洗涤后， 加入铕 离子 (Eu3+) 标记的链亲和素， 免疫反应后， 微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记链亲和 素通过洗涤分离。 微孔表面免疫复合物中的Eu3+被荧光增强液解离后形成稳定的荧光配合 物， 荧光强度与阴阳性对照或样。
14、品中的 HCV 抗体浓度呈正比例， 通过 Cutoff 值计算公式判 断阴阳性结果。 0018 图 2 为本发明操作流程图 0019 第一步 ： 复融生物素标记抗原， 第二步 ： 稀释生物素标记物， 第三步 ： 加入阴阳性 对照和待测样品， 第四步 ： 加入稀释后的生物素标记抗原， 第五步 ： 孵育， 第六步 ： 洗板， 第 七步 ： 加入稀释后铕标记物， 第八步 ： 孵育， 第九步 ： 洗板， 第十步 ： 加入增强液， 第十一步 ： 检测。 具体实施方式 ： 0020 下面参照图 1、 2 通过实施例对本发明作进一步说明。 0021 在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完成下列准备工作 ： 。
15、0022 首先制备包被板， 所用的包被板为重组抗原包被的板， HCV 包被板条的制备包括以 下步骤 ： 0023 (1) 将纯化的 HCV 重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释， 然后加入包被板条各孔内， 经吸 附、 洗涤、 封闭、 干燥后获得 HCV 重组抗原包被板条 ； 0024 (2) 将 HCV 重组抗原包被板条装入专用的铝箔包装袋， 封口并冷藏备用。 0025 其次是 HCV 生物素标记抗原的制备， 包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 102236020 A CN 102236024 A3/3 页 5 0026 (1) 取待标记抗原加入透析袋中， 放入配制好的 pH 9.5 碳酸盐缓冲液的中，。
16、 室温 透析过夜 (pH 9.5 碳酸盐缓冲液 ) ； 0027 (2)次日， 取出抗原， 将透析过的抗原用pH 9.5碳酸盐缓冲液稀释至0.2-5mg/mL， 按质量比为 2 1 的比例 ( 生物素 ： 抗原 ) 边振荡边加入生物素， 室温下在振板机上慢速振 荡 1 小时， 然后去除后在 pH7.5 的磷酸盐缓冲液 (pH7.5 的磷酸盐缓冲液 ) 中透析过夜 ； 0028 (5) 用孔径 0.2um 的过滤器过滤 ； 0029 (6) 加入 0.3 (W/V) 优级纯 BSA， 2-8保存。 0030 实施例 ： 丙型肝炎病毒抗体检测 0031 1、 生物素标记抗原 0032 用碳酸盐缓冲。
17、液将 HCV 重组抗原透析过夜， 之后加入生物素反应 1 小时， 取出在 pH7.5 的磷酸盐缓冲液中透析过夜。分装， 于 +2 +8保存。 0033 2、 操作步骤 0034 1.) 试剂盒准备 ： 包被抗原的缓冲液 ( 碳酸盐缓冲液 )、 封闭液 ( 磷酸盐缓冲液及 2 (W/V) 的 BSA)、 反应缓冲液 (pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl， 内含 0.9 NaCl， 1 BSA， 0.5酪蛋白， 0.08 Tween20 和 0.1 NaN3)、 工作洗涤液 ( 磷酸盐缓冲液 )、 荧光增强液 ( 二酮体 )， 作为包被 HCV 重组抗原， 生物素标记抗原和镧系元。
18、素离子标记的链亲和素。 0035 A ： 工作洗涤液 ： 将40mL磷酸盐缓冲液(25倍浓缩液)用蒸馏水或去离子水稀释至 1,000mL 备用。 0036 B ： 生物素标记抗原工作液 ： 每瓶生物素标记 HCV 抗原的冻干粉加 1,000L 纯水， 静置 30 分钟， 待其充分溶解。对每一条 12 孔板， 取 75L 复溶好的生物素标记 HCV 抗原 (21 倍浓缩液 )， 加 1.5mL 反应缓冲液， 充分混匀 (1 21 稀释 )。实验前 1 小时内配制。 0037 2) 编号 ： 将样品对应微孔按序编号， 每板应设抗 -HCV 阴、 阳性对照各 2 孔。 0038 3) 加样 ： 分别。
19、在相应孔中加入抗 -HCV 阴性对照、 阳性对照及待测样品 25L。 0039 4) 加生物素标记抗原 ： 每孔加入稀释好的生物素标记抗原工作液 100L。 0040 5) 第一步孵育 ： 室温 (20 25 ) 慢速振荡温育 45 分钟。 0041 6. 配 Eu 标记链亲和素工作液 ： 对每一条 12 孔板， 取 75L Eu 标记链亲和素 (21 倍浓缩液)， 加1.5mL反应缓冲液， 充分混匀(121稀释)。 第二步孵育前45分钟内配制。 0042 7) 洗涤 ： 用工作洗涤液充分洗板 5 遍， 扣干。 0043 8) 加 Eu 标记链亲和素 ： 每孔加入 Eu 标记链亲和素工作液 100L。 0044 9) 第二步孵育 ： 室温 (20 25 ) 慢速振荡温育 15 分钟。 0045 10) 洗涤 ： 用工作洗涤液充分洗板 5 遍， 扣干。 0046 11) 加荧光增强液 ： 每孔加入荧光增强液 100L， 室温 (+20 +25 ) 慢速振荡 5 分钟后测定荧光计数值。 0047 12) 测量荧光计数值 ： 用时间分辨荧光检测仪测定荧光计数值。 说 明 书 CN 102236020 A CN 102236024 A1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102236020 A 。