微流控通道胚胎和/或卵母细胞处理，分析和生物评价 【技术领域】
本发明总的来说涉及胚胎的处理。本发明还涉及卵母细胞(未受精胚胎)，和卵的处理。这里所用的胚胎包含卵母细胞，卵以及受精胚胎。本发明特别涉及胚胎的微流控处理，以用来培养、操作和分析。
背景技术
辅助繁殖技术的工艺的重要性和使用频率不断增加，该技术中对来自哺乳动物生物源单独处理。这些技术对通过独立的有性繁殖无法生孩子地人而言具有最直接的好处。农业也日益依赖这种辅助繁殖技术。胚胎操作用于家畜繁殖中，以便控制这样的事情，即使牛更快地遗传进化，并允许一个个体优异的母牛或公牛的遗传特征传给大量的后代，其后代数量超过通过独立有性繁殖所得的后代数量。
由于基因操作手术，无性繁殖系化和体外受精(IVF)技术的发展，家畜胚胎操作变得越来越常规化。家畜胚胎操作的总目标是增加生产效率，特别是涉及繁殖、产奶量或特殊的奶成分的生产效率，降低脂肪含量，瘦肉组织生长并降低对特定病的易感性。胚胎转移还用来引入或拯救有价值的种质(germplasm)，繁殖稀少的饲养动物，例如濒于灭绝的外来物种。
由于成本和较低的成功率，给人以及家畜使用这些辅助繁殖技术带来明显的负担。对人的繁殖来说，这种成本和失败增加了感情和经济负担。另外，预防失败的安全措施常导致不希望的或很难处理的多胎，以及需要保养额外保存的胚胎，并且在以后的一些时间点作出的额外的困难决定。家畜繁殖则主要关心费用问题。
繁殖和测试技术以及其它胚胎处理技术的失败率主要归因于在执行这些技术时对胚胎而言效果显著的处理和操作。最近几年，动物繁殖技术得以提高，但在动物繁殖中采用的工艺并没有显著变化。精密镗孔的玻璃移液管仍是胚胎学家使用的其中一个基本的工具。利用标准的皮氏培养皿，例如卵的体外成熟(IVM)，体外受精和胚胎培养(EC)的程序中需要为每个程序若干次挑选和放置单独的卵和胚胎。
从一个皮氏培养皿至另一个皮氏培养皿的这种处理和移动明显存在潜在的损坏或污损。尽管如此，更重要的可能是在皮氏培养皿中稳定的胚胎无法模拟相应的自然界生物繁殖条件。人们付出了一些努力，以便使皮氏培养皿中的胚胎借助皮氏培养皿的搅动而移动，但这是随意的方法。在此，由于手动皮氏培养皿进行传统的胚胎处理的方法需要相对大量的生物培养基，这也会因此产生费用问题。牛胚胎用移液管和大的贵重的操纵器独立处理。包括用于人胚胎培养的生长因子的大量生物培养基的使用使相应的体外程序花费更高。家畜生长刺激素例如每50微克花费超过200美元。
当胚胎生长时，这种静态培养系统也不允许改变培养基内的环境。具有流动的培养基的现有培养系统具有小至0.2至0.5毫升的培养室。然而，培养容积大于所需，且培养基补充太快。促进生长的内生生长因子被稀释和冲走。当使用贵重的生长因子例如IGF-II(每50微克200美元)时，所需要的大体积的培养基大大地增加了成本。另外，现有的系统不能跟踪单独的胚胎。
传统的处理技术在评价胚胎方面还能力有限。能够对预植入胚胎包括胚胎、精子或卵子的单倍体核受精卵和卵母细胞进行评价将提供更佳的植入成功率。当前，我们对大多数胚胎在其转移到容器中之前对其形态学进行评价。形态学检查将挑选出具有严重缺陷的胚胎，但它不是生存能力的高度可靠的指示器。目前采用的是在一段时间内进行化学监测，但需要在一段时间内进行大量的测量。结果是生存能力的更佳的预测器，大约80％数量级，但许多胚胎在监测程序中没有生存下来。这样需要使用补充的胚胎。从而导致多胎和其它并发症，并伴有额外的劳动力成本。
传统的技术还提供去除透明带的苛刻的方法，这是制造嵌合体(chimeric)胚胎中关键的步骤。传统上，采用移液管口将一个胚胎从包含培养基的一个组织培养皿吸取至一个包含酸性培养基的培养皿中。胚胎留在培养基中一段时间(几十秒)，然后用移液管口吸取至包含新鲜的培养基的培养皿中。接下来，胚胎在移液管内进出冲刷几次，以便迅速冲散所有酸性培养基，并使之对细胞膜的损害最小。移液管口的开口与胚胎大小几乎相同，因此，冲刷在胚胎上产生剪切应力。因此，移液管口操作的不精确将使胚胎受损的几率大大增加。
这样，需要一种改进的胚胎处理装置和方法，它以公知的胚胎处理技术解决上述问题。一种改进的胚胎处理装置和方法应提供一种改进的方法来模拟自然条件。还应提供一种构件模块，例如胚胎培育系统，胚胎分析系统，胚胎存储系统和类似的系统。较大和/或大功率和精确的仪器可基于该构件模块。另外还需要改进对胚胎生存能力的评价。
【发明内容】
这些需要符合或超出现有的微流控胚胎处理装置和方法。本发明模拟胚胎的生物旋转。一个胚胎流动通道通过流体使嵌入其中的胚胎移动，并且其尺寸确定为与待处理的特定类型的一个或多个胚胎为相同数量级。所确定的尺寸和流体连通产生了胚胎的模拟的生物旋转。另外，在一个或多个胚胎周围流动的流体避免了其停滞，降低了一个或多个胚胎产生“褥疮”的可能性。
本发明还允许生物培养基流体逐渐改变，与手工重复地将一个胚胎从在移液管或皮氏培养皿中的一种培养基转移到另一种培养基中相比较，这具有显著的优点。培养基的逐渐改变避免了在局部环境种突然改变所带来的冲击。本发明的微流控系统还允许一个胚胎与其它胚胎共同培养，一个或多个胚胎与胚胎上游的细胞共同培养，并保持对与对象胚胎分享共同的生物培养基的胚胎进行独立控制培养，从而确保试验胚胎具有与对象胚胎相同的环境条件。
本发明的其它方面涉及微流控胚胎经处理以便进行操作、评价和定位胚胎的广义原理上的特殊使用。一方面涉及使用一系列的逐渐收缩部来去除胚胎周围的材料。这一点从从卵母细胞去掉周围的堆积物(cumulus)得到证明。最初的几个收缩部切除堆积物，然后在最终的小的收缩部该堆积物从卵母细胞上吸出，该收缩部的尺寸为可防止卵母细胞通过。
根据本发明的基本原理，胚胎评价也可实现。在一个优选的评价中，对胚胎的表面性能和柔顺性(变形)进行评价。微流控通道提供对压力进行微调控制的机会，以便在略低于公知的发生胚胎损害的力时进行不同的评价。在一个相同压力梯度微流控通道中对胚胎滚动的距离和/或速度进行测量可提供的信息是，健康的胚胎表现为与通道壁具有更大的静摩擦，因而它们移动较慢或移动较短的距离。当定位一在收缩部时，健康的胚胎液还表现为其变形小于不健康的胚胎，该不健康的胚胎更容易牵拉到收缩部内。另外，健康的胚胎表现为能够更好地恢复其形状。
微流控通道中的流体在不改变胚胎环境的条件下很容易在下游收集，从而提供比传统的人工处理和取样技术更好的机会来进行流体化学分析。另外，从微流控通道收集的全部流体已经过胚胎。这提供比围绕皮氏培养皿中的胚胎的流体停滞更好的评价信息。
通过本发明，培养基可连续或周期性的经过胚胎，并在下游收集，这消除了在皮氏培养皿技术中所需要的额外处理。本发明提供更一致的流体样品，因为流体可以相同的方式重复收集，反之，从皮氏培养皿中采集的样品可基于吸入培养基的移液管的放置而改变，即它与一个胚胎有多远或多近。
使用透明的通道区域允许进行许多种类的光学分析。在透明区域处，可添加污点或颜料，以便目视检查透明区域。该透明区域还提供使用图象分析装置的机会，因为微流控通道可构造成将一个胚胎精确地定位在一个位置，以便通过成像设备分析。
采用本发明的通道和收缩部来给胚胎精确地定位和/或流动操作还能够进一步提供一种去除哺乳动物胚胎的透明带的改进的方法。胚胎通过流体移动到一个精确的位置，在此，细胞溶解剂可冲洗胚胎，以去掉透明带。
【附图说明】
参考附图，并通过下面的详细描述，对本领域的普通技术人员来说，本发明的其它目的，特征和优点将变得更清楚，附图中：
图1表示根据本发明构造的一种优选的微流控胚胎处理装置的横截面；
图2(a)是表示用于胚胎定位的一种优选的窄的微流控通道收缩部的顶视图；
图2(b)是表示用于胚胎定位的另一种优选的浅的微流控通道收缩部的横截面视图；
图2(c)和2(d)是一种替代的优选的流体动力学收缩部的示意图；
图2(e)是又一种替代的优选的流体动力学收缩部的示意图；
图2(f)是一种替代的优选的机械收缩部几何外形；
图2(g)表示例如用于带处理的图2(e)流体动力学收缩部中特定的流动模型。
图3(a)是根据本发明构造的一种优选的重力流驱动的微流控培养和测试装置的透视图；
图3(b)是用于本发明的去除透明带过程的微流控通道的示意横截面；
图4是根据本发明构造的胚胎分析装置的框图；
图5(a)-5(c)表示根据本发明的优选的胚胎微流控通道嵌入和去除结构；
图6(a)-6(b)表示根据本发明构造的优选的培养装置；
图7(a)和7(b)示意性表示用于从卵母细胞国去除堆积物的狭窄的通道外形；
图8(a)和8(b)表示用于去除堆积物的完整的原型装置；
图8(c)至(f)表示在图8(a)和8(b)的原型试验中使用的步骤，以便从卵母细胞中去除堆积物；和
图9(a)-9(d)表示用作胚胎生存能力的指示器的胚胎的变形评价。
【具体实施方式】
本发明提供一种微流控胚胎处理装置，该装置减少了在胚胎的天然生物宿主外处理该胚胎时施加在其上的应力。该装置和方法在促进胚胎滑动和旋转的通道中，通过流体辅助移动，再现了模拟胚胎生物旋转。这里涉及的旋转可包含完全旋转或部分旋转。部分旋转也可称为摇动。
现在参考图1，图中所示是微流控胚胎处理装置10的横截面图，该装置包括一个胚胎传输网络12，该胚胎传输网络至少部分由基本上为胚胎级别的通道14形成。通道14内的胚胎16与通道14中的流体流一起移动，同时通道的紧密尺寸导致胚胎14以模拟的生物旋转运动移动。十倍于胚胎大小的通道已用来形成滚动和滑动。在生物宿主中，发育的胚胎在其初始发育阶段向着子宫移动，它们通过旋转和滑动附着在子宫上。微流控通道14产生这种模拟运动。
通道的尺寸对产生生物旋转很重要。高度是严格的尺度，并且业已发现约三倍于胚胎直径的高度可促使旋转。由于流体的流动也起作用，确定的该比率在某种程度上可改变，但已发现三比一的最大比率可产生旋转。可以理解，通道宽度不那么重要。宽度可任意选择。这样，如果胚胎保持在一个数量级时，那么宽度可小于胚胎直径的两倍。如果希望有多个胚胎，可使用更大宽度的通道。
通道14的网络提供培养胚胎的手段，并且提供可将胚胎移动和放置在期望位置的手段。在发育的最初阶段，多数哺乳动物胚胎的大小在受精后头几天中通常保持恒定。这样，通道14的大小不会对其中培养的胚胎造成障碍。有利的是，胚胎16可保持移动和/或可具有围绕它的连续或脉冲式流体流，以避免对胚胎16的潜在的有害生物作用。
包括通道的装置10的优选示例结构也在图1中显示。通过对合适材料，例如硅片18采用任何合适的显微机械加工技术可形成微流控通道14。所选材料必须能消毒并且不应对胚胎造成生物威胁。装置的通道14整个被覆层20密封。形成玻璃或其它透明材料的覆层有利于方便地视觉监控通道14中的胚胎。粘合剂22将覆层20粘到硅片18上。另外，覆层的材料可设计成能屏蔽掉对通道14内的胚胎有害的射线。
不象其它细胞倾向于浮在流体培养基中，相对大而重的胚胎沉在微流控通道14的底部。所关心的典型的哺乳动物植入前胚胎是90至180μm直径的球体。每个胚胎中，细胞膜围绕每个细胞(卵裂球)，透明带、糖蛋白膜或壳围绕整个细胞团块。细胞在受精后头几天分裂几次，胚胎的体积保持恒定，在本发明的原理基础上构造的同一装置中，卵可受精和发育成胚泡。胚泡是胚胎植入子宫前的最后阶段。
对制造这种装置和类似装置来说，同样重要的是其能够处理单个的胚胎或少量胚胎。将胚胎定位到给定位置，移动到替代位置，并且围绕胚胎保持恒定或改变的生物状态都是根据本发明的基本原理提供的能力，并且本发明的受精、发育、试验结构和其它装置均依赖于部分或全部这些性能。为了使胚胎能在发育期间连续移动，可产生长通道或形成一个圈。可供选择的是，在例如图6(a)和6(b)所示的发育站可发生胚胎的停置。通过改变流体流，有限大小的隔室或通道也可用来使胚胎在其中前后翻转，如后面将进一步根据图6(a)和6(b)来对此进行讨论的那样。
本发明利用收缩部提供独立胚胎的精确定位，其优选实施例如图2(a)和2(b)所示。图2(a)是在微流控通道14中形成的狭窄的收缩部24的截面顶视图。许多原因导致需要例如在胚胎处理装置10中精确定位。在装置中设置的分析仪器需要胚胎在电极、光电检测器、显微镜的焦点或其它类似传感器处精确定位。将胚胎传输到收缩部24允许这种所需的定位而不需借助反馈系统。通过使生物流体培养基30反向流动，胚胎16即可简单地不受收缩部24约束。即使在保持在收缩部时，胚胎16也承受着围绕它的生物流体培养基的流动，因为流体30流经它并经过收缩部24。这是有利的，因为滞流于流体中的胚胎具有更多的潜在可能产生“褥疮”，这是在胚胎处理技术中对低成功率的令人疑虑但还未证明的解释。
微流控通道14的侧壁部分28a，28b在期望的位置收缩，以防止胚胎16通过那里。收缩部24没有完全关闭微流控通道14，这样流体生物培养基30可经过定位在收缩部24处的胚胎16。图2(b)显示出了替代的浅收缩部26的侧截面图，其中当胚胎16位于收缩部时，流体生物培养基30同样能经过。收缩部也可以为其它形状。总的来说，能够防止胚胎通过，同时允许流体流经收缩部的任何，例如对称形状以及梳状都是可以接受的，以便在根据本发明的装置10中定位胚胎。最好收缩部的尺寸设定成使胚胎定位并防止该胚胎通过，同时不必增加在装置10中使用的流体压力来移动胚胎。收缩部长度还应保持足够小，以避免流体控制出现问题，因为微流控通道的收缩部将具有比微流控通道14的无约束部分更高的单位长度流体阻力。
在微流控通道14内的流体动力还可以用于定位胚胎。尽管图2(a)和2(b)所示的收缩部是物理收缩部，但在图2(c)和2(d)中，可实现有效的流体动态收缩，而不必采用物理障碍来阻止胚胎的通过。在图2(c)和2(d)中，一个深度增加的微流控通道阱部分14a限定了一个位置，在该位置，胚胎16可利用流体动力学控制，即溢出和流过阱部分14a从而有意识地得到保持。在图(c)中，高层流或非层流导致胚胎16留在阱部分内，因为在阱部分14a的前缘发生了分流。在(低)流速期间，流体流线符合包括阱部分14a的微流控通道14的轮廓，以便将胚胎冲出阱部分外。对于特定的阱几何外形和尺寸，可分别计算保持胚胎和冲出胚胎的预定流速，或者可通过试验确定。图2(e)表示定位胚胎16的一个替代的策略。在图2(e)中，在微流控通道14的交叉处形成T形汇合处14b。在平衡的流体流条件下，如图2(e)所示，在胚胎位置没有流动，允许它保持就位。尽管没有图示，但具有锯齿形或其它小的物理形状可能增加图2(e)中胚胎16的稳定性。图2(f)中示出了另一种几何外形构造。
对于图2(a)-2(f)所示的几何外形和流动而言，有可能将胚胎定位在微流控通道的网络内的一个精确位置。通过成像或其它装置以及对胚胎的处理来提供目测检查、胚胎去除、胚胎测试、分析胚胎的机会。因此，采用本发明可实现对胚胎的许多机械操作，并且通过对胚胎的移动进行这种精确的定位有助于进行任何处理、分析或操作，同时本发明还能够操作和控制流体环境。
利用收缩部和微流控通道流体来将胚胎定位在图2(a)-2(e)所示类似的装置中的特定的典型的处理技术是从胚胎中去除透明带。透明带是包围胚细胞的糖蛋白基质。嵌合体，即具有两个DNA组的单体动物是通过去除透明带并将分离的胚细胞聚在一起来实现的。对于基因转录程序、试管受精(IVF)和细胞活体检查来说，变薄或去除带也很重要。为去除透明带限定存放位置，例如如图2(f)所示。在图2(f)中收缩部顶面处为0.01数量级的低高宽比可能需要支撑，以避免塌陷。在一种原型装置中，这利用围绕收缩区的聚二甲基硅氧烷(PDMS)柱实现。一个或多个胚胎靠在其上的收缩区可以成形为使胚胎聚在一起，在嵌合体成形时这是必要的。V形放置表面以如下方式将胚胎聚在一起。在如图2(f)所示的收缩部上游，微流控通道构造成使得酸性溶液的控制冲洗可导致该溶液流过停留的一个或多个胚胎。例如，酸性入口可t形汇合到主流内，以便导入图2(f)的停留区域。在收缩部附近和上游，在短期内例如由细胞溶解栓提供进入主通道的酸性溶液，以实现去除透明带。对于微流控通道而言，在所需的时间段内可实现流动的精确控制。在原型装置中，与包括收缩部和“T”交叉通道在内的主微流控通道相连的注射器用来控制胚胎定位和使流体流过定位的胚胎。注射器提供对流体的精确控制，计算机控制的微型注射器进一步对流量控制和计时进行精确控制。
去除透明带的一种替代的机械方法涉及对透明带的机械破坏。这是例如使带通过本发明的微流控通道来实现的，该微流控通道包括一种机械结构，以便在透明带上刻划或切割。本发明的精确的流量控制还有可能形成一种层流方法，以便对带“刻划”。在图2(e)的“T”形汇合处，两种不同溶液的两个分离流束在“T”形处汇合流入一个如图2(g)所示的单一通道，这里的虚线指流束分离。这些流束可以在单一通道内因层流而保持分离。一个流束(左边)包含例如使透明带稀薄的酸。驱动压力控制在两种溶液之间的交界面的横向位置，这样，胚胎16的透明带由酸“刻划”。
包括如图2(a)所示的收缩部，用于定位胚胎的培养和试验装置31在图3(a)中示出。装置31具有在微流控通道14的网络32中的流体流，该流体的流动基于在若干流体容器34内的流体30的液面，由重力驱动。用于驱动流体30的任何适当的装置均被认为与本发明的基本原理相符合，例如泵送，但图3(a)中所示的重力法对于简单和效率而言最优。流动的方向由容器34中流体的液面简单控制。这样，例如保持在收缩部24以便通过适当的仪器培养或检查的胚胎16通过首先调节液面得到定位，从而使其从入口36移动到收缩部24，并且当流体流反向经过收缩部24时使胚胎释放。通过流体流使胚胎移动到出口38来实现胚胎16的去除。
在移动经过网络32的微流控通道14期间，如上所述，一个或多个胚胎滚动和滑动，以模拟胚胎朝向哺乳动物宿主的体内子宫的自然移动。这种期望的移动方式可借助于适当的表面活性剂例如BSA(牛的血清白蛋白)。该表面活性剂有助于促进胚胎滚动时的某种程度上的滑动。
图3(a)还示出了本发明提供有平行附加微流控处理和培养装置31a而具有的附加优点。附加装置31a具有与装置31相似的结构，但可具有更少甚至单个微流控通道。理想化地讲，它们的结构是相同的。装置31a的重要特征是它与主装置的入口36和出口38共享共同的流体源。装置31a中处理的胚胎与主装置31中的胚胎生物隔离，但它们通过共享相同的流体源、压力和/或相同的生物培养基条件而具有相同的生物学条件。在示例的使用中，附加装置31a因此可能形成重要的控制培养，其中通过试验胚胎的发育或发育缺乏可确认主装置31中建立的条件是合适或是不合适。
图4是胚胎分析装置的方框图。在图4的装置中，微流控通道14的网络32将胚胎移到一个或多个分析站40a，40b或40c。胚胎经过如上所述那样的收缩部定位于给定分析站。分析站可包括能获得关于胚胎的信息的任何仪器，同时通过形成收缩部使胚胎定位于对于分析站中特定仪器来说合适的检测点。胚胎经过一个或多个出口38a，38b移出装置，这样可替代地将胚胎引导至采取停靠区形式的培养站、微流控通道14的附加长度段或为了使胚胎在培养期间连续移动而形成的环状微流控通道中。
用于本发明装置中的入口和出口可包括用于胚胎嵌入或移去的任何传统方式或结构。但是，嵌入和移去的附加优选结构如图5(a)-5(c)中所示。在图5(a)中，使用与微流控通道14流体连通的阱42。阱42中的流体最好还包括重力供送，它有助于驱动通道14中的微流控流体。胚胎16置于阱42内，并且与生物培养基一起移动到通道14中，或者在未建立流体条件下简单地独立沉在通道14中。可采用第二类似的阱42，使用移液管44或相似装置移去胚胎。移液管也可用来嵌入胚胎。在图5(b)中，在通道14末端处的悬挂滴46用来嵌入和移去胚胎。通过表面张力保持悬挂滴46。在胚胎嵌入之后，在该点可添加流体，或通过装置中的流体流动吸入胚胎。可供选择的是，装置可倾斜，以促使胚胎离开悬挂滴46。在图5(c)中，与通道14直接连通的漏斗形孔48用来嵌入和移去胚胎。漏斗形帮助移液管44或相似装置定位。小直径孔48处的表面张力将防止流体漏出，但通道14中的压力必须不超过征服表面张力并导致流体漏出这一点。嵌入的胚胎将沉入通道14中，同时当胚胎接近孔时将流体从孔中抽出即可移去胚胎。当然，图5所示的技术均可相互结合或与传统技术相结合，以便将胚胎嵌入给定处理装置和从其中移去。另外，可用移动盖或翼片作为抗污染和/或蒸发的保护装置覆盖阱42或孔48。
现在参考图6(a)和6(b)，图中示出了根据本发明的胚胎培养装置50。培养装置50中的流体培养基流在培养基入口52和培养基出口54之间的任一方向流动。装置包括若干陷阱或隔室56。如图6(b)最佳所见，陷阱56包括被浅区58分隔的深区。入口52和出口54之间的流体流过浅区，并且经过深区，以便在深区隔室56中前后移动胚胎。胚胎经过通道孔60嵌入和移去，其中通道孔60可通过图5(a)至5(c)中的任何优选方法形成。在装置50中，本领域的普通技术人员会这样想到，胚胎可在隔室56中前后移动，以便模拟生物学旋转，可与培养基中的其它胚胎享有相同的培养基条件，并且可容易地移去和嵌入。虽然图6(a)和6(b)示出的是顶部装载实施例，以便将胚胎放置在间隔中，但装置也可在底部装载的情况下工作，基本上与图6(a)和6(b)中所示相反。在这种底部装载布置中，胚胎仍保持在深部分但不经过浅部分。替代实施例可包括代替浅收缩部的缺口，在此胚胎不能经过缺口，但流体流可在其间产生，并且缺口的深度可与胚胎保持隔室的深度相同。
如图3(a)所示的样机装置已生产出并经过了试验。出于完整性的原因，这里描述了典型的样机。本领域的技术人员可以理解，通过任何其它传统的微制造技术，可完成制造样机的方式。本领域的技术人员还估计，生产装置的制造可显著不同，并且样机装置的具体数字尺寸和条件不对本发明的保护范围起限制作用。
在典型的样机通道中，1Pa/mm的压力梯度导致培养基以约10- 10m3/s(100nl/s)数量级的流量流动，平均速度是1至2mm/s。在这些流动条件下；胚胎沿着通道底部滚动；流体将在通道的相同区域中以1/3至1/2范围的速度运动。通过向连接到通道末端的阱处施加压力，胚胎可输送到(和保留在)包括培养隔室和恢复阱的特定位置。胚胎填充在通道的重要位置，因此大大改变培养基的流动。培养基经过通道的流动为层流。
样机微流控通道的网络已在如图3(a)所示的装置中制出：在3英寸<100>的硅片中蚀刻沟槽，然后粘合玻璃覆层以形成通道。通过在弹性体中采用微模制技术已制造出包括微流控通道的装置。其它塑料和技术也可能合适，包括例如热塑材料的注模。典型的通道网络包括几个分支微流控通道，该通道在靠近装置的中心处交叉。长度范围从1.5至2.5cm的分支在顶部为160至200μm深，250至350μm宽。生产样机装置的第一步包括使用传统的照相平版印刷技术在氮化硅(SiN)覆层上做图案。用氢氧化钾(KOH)溶液各向异性蚀刻微流控通道。或以传统方式采用碳化物补强钻头，或采用超声波在玻璃覆层中钻孔。使用UV可固化环氧树脂(NOA 61，Norland Products，Inc.New Brunswick，NJ)将玻璃覆层粘到晶片上，或在450℃环境中使用500V将Pyrex(派莱克斯耐热玻璃)7740覆层阳极化粘合到晶片上。在阳极化粘合前，利用缓冲氧化物浸蚀剂(BOE)可去掉氮化物涂层。在通道网络的每个分支的端部，或者利用环氧树脂(快粘5分钟环氧树脂，或5小时固化环氧树脂胶；均由GC Electronics，Rockford，IL制造)，或者利用硅有机粘合剂(由纽约Waterford的通用电气公司制造的RTV 108和RTV 118，或DowCornign Corp.，Midland，MI生产的Sylgard牌184)，将玻璃阱粘合到玻璃覆层上。
在样机装置中，象图2(a)(“窄”)和2(b)(“浅”)的那些收缩部已制出并已经过试验。利用单一掩膜和蚀刻操作可构造如图2(a)所示的“窄”收缩部的通道。如图2(b)所示，具有“浅”收缩部的通道需要两个掩膜和两个蚀刻操作。
对样机装置中除5分钟环氧树脂外的所有元件材料作试验，以便测量胚胎的生物相容性。在使用本发明时，本领域的技术人员可以理解，可从备选材料中选择那些用于样机装置的材料，但生物相容性必须总是建立在已有的数据和/或测试上。虽然许多材料已知与某些细胞相容或有毒，但在调查微制造技术中所用的材料与胚胎的相容性方面几乎没有做什么工作。所选材料也可根据哺乳动物的类型而改变，其中被处理的特定胚胎来自该哺乳动物。
在样机试验中，双细胞老鼠的胚胎(B6SJL/F2)随机分配，并且在基质上培养，在培养基M16(Sigma，St.Louis，MO)中具有牛血清白蛋白(BSA；4mg/ml；Sigma)，覆盖有矿物油(Sigma)。所有胚胎均在37℃下5％CO2空气环境中培养96小时。每24小时测试胚胎的发育率。针对每种材料将胚胎中达到胚泡阶段的百分比与对比组的百分比相比。达到胚泡阶段的老鼠胚胎在胚胎转移前的最后可能阶段可能没有发育的障碍。不能保证没有副作用，除非胚胎也转移给受者老鼠，并且一直监控到后代出生，出于实用和经济原因在胚泡阶段共同总结试验。多数被测材料证明与老鼠胚胎相容，包括硅片，SiN涂层，NOA 61和RTV 118。一些材料，例如5分钟环氧树脂尚未被测试，因为它仅用于理论装置中，以证明本发明的机械和流体原理，不可能用于产品装置中。
我们进行试验，以测试样机装置的几个方面。不同试验需要带不同通道结构的装置。在所有试验中，卤素灯泡经光纤照亮通道，这可以在立体显微镜下观察到。量筒和秒表用来确定流率。因为流体不可压缩，通道任何部分中的平均流体速度正是流率除以横截面面积。
给定流率的胚胎运动速度的测量发生在简单的直线通道中，该通道29mm长，162μm深和160-380(底-顶)μm宽。压力梯度变化，并且在每个设定下测量胚胎速度。通道填满磷酸盐缓冲剂盐(PBS)，有和没有BSA。培养基的长颈瓶连接通道。通过调整长颈瓶的高度，使用微米头转化阶段，压力差最终调节到0.05Pa内。通过在试验之间接管使压头至零，从而使长颈瓶相互连接。微制样机装置在过氧化氢/氢氧化铵/去离子水溶液中清洁，并且在进行试验前新移液管尖粘有环氧树脂。在使用BSA之前进行所有使用PBS而无BSA的试验。一旦通道填满培养基，老鼠的胚胎就放置在通道入口处的入口阱中。
我们进行试验，以观察通道尺寸和形状对胚胎传输的影响。对这些试验来说，一个装置构造有一个长的连续通道，该通道具有11个部分，每个部分都具有如下四个深度之一：140，164，194和210μm。在每种深度下，通道具有2或3个不同宽度。在晶片的表面处测得的宽度其范围从275至480μm。在最窄部分，胚胎被几何收缩，以便V形-槽上运动，而在其它区域中则沿着具有平坦-底部的通道运动。观察运动速度和旋转特性，并且比较不同部分。
在收缩部处对胚胎的观察发生在几个装置中，该收缩部为窄和浅型收缩部。胚胎实际直接引导到特定收缩部处。通过添加或减少流体改变每个阱中培养基的高度，调整通道网络的每个分支中的压力梯度。压力头调整1至8mm(10至80Pa)。
正当胚胎放置在培养基中沉在容器底部时，置于微流控通道中的胚胎沉积在底部。在所有试验中，当培养基流动时，胚胎转动并且在流动方向上沿着通道底部滑动。通常它们还保持与通道的其中一个侧壁接触。在培养基(磷酸盐缓冲剂盐)中无任何表面活性剂的最初试验中，胚胎出现转动而不会沿着通道底部滑动。在培养基容纳有BSA(4mg/ml)的后来的试验中，胚胎滑动或转动，同时沿着底部滑动。
试验揭示，在通道中的胚胎的运动速率依赖于培养基速度。在围绕它们的流体的速度低于50μm/s时，有时它们粘在通道底部。对PBS和PBS/BSA这两种培养基来说，0.16Pa/mm的压力梯度驱动流体以大约380μm/s的平均速度经过通道。胚胎以187-250μm/s(380μm/s的49至66％)转动。当培养基更快流动时，胚胎更快转动，并在转动时滑动。已观察到此时胚胎运动的实际速度和从一个胚胎到下一个胚胎的粘性变化的趋势与在相同通道中同一时间、在几乎相同的路线中运动的胚胎会快25％。在所观察到的范围中，150至1000μm/s的速度与压力梯度呈线性关系。
试验结果表明，通道尺寸和形状的作用与由原因推出结果的预测匹配。对给定的流率来说，平均流体速度和胚胎速度在有较小横截面的通道中较大。相反，对给定的压力梯度来说，平均流体速度和胚胎速度在具有较大横截面面积的通道中较大。在这两种情况下，胚胎在V形-槽上比在具有平坦-底部的通道上运动得更慢。胚胎在V形-槽中比在平坦-底部通道上还更可能楔入并且粘附。
电渗流动下的流体还导致胚胎在通道中转动。由于存在压力驱动的滴流流动，胚胎沿着通道底部以近似10μm/s转动。接通电压导致老鼠胚胎沿着通道底部以快于20μm/s，至少30μm/s的速度向着有负极的阱转动。使电压极性反向，胚胎以近似10μm/s的速度在相反方向上转动。不使用例如BSA的表面活性剂，所以只有少量或根本无滑动。如果用来移动胚胎，必须在仔细控制的条件下施以电辅助，以避免对培养基进行不希望的加热。
采用Fluent/UNS 4.2(Fluent Inc.，Lebanon，新罕布什尔州)建立计算流体动态模型，并且采用Quickfield(Tera Analysis Inc.，Tarzana，加拿大)对具有恒定横截面面积的样机微流控通道进行2-维有限元分析，验证所观察的流率和流动模型。胚胎模型建立成为一个刚性球体。前面已说过在典型的条件下胚胎没有出现变形。为了分析层流，将通道的1或2mm部分啮合(mesh)成10000至30000个四角形元件。一旦验证，采用计算机模型来确定流动速度变化图，设计具有较低压降的收缩部，以观察收缩部处滞留的胚胎上的力，并且分析相似通道中的电驱动流动。但是，将胚胎与通道阱的粘接和胚胎的变形结合分析将明显变得更复杂，并且我们并不期望那样做。
如上所述，在胚胎速度的直通道试验中，在0.16Pa/mm的压力梯度下，培养基具有380μm/s的平均速度。有限元分析确定在这些条件下中心线速度是815μm/s。当在通道中运动时，胚胎正切于底部和一个壁。考虑100μm直径的圆正切通道的底和一个壁。流体经过该圆运动的平均速度在胚胎不存在时是480μm/s。但是，胚胎仅以187-250μm/s转动，在PBS和PBS/BSA培养基中都会快39-52％。速度变化图促进胚胎向前和沿着壁滚动，这证实了目测观察。总而言之，胚胎转动速度为流体在相同区域的横截面中流动的速度的1/3至1/2。
收缩部大大增加了通道中的流体阻力。标准分析公式可帮助估计阻力，但收缩部的截面形状随位置变化。在设计有掩膜并且蚀刻晶片之前分析收缩部的三维模型。从有限元分析获得的信息导出最佳尺寸的收缩部。采用可根据装置的几何形状确定各自的大小的浅收缩部折衷了对小的流体阻力和坚固的结构的需求。典型的收缩部具有20μm的最小深度。
对在陷阱处的胚胎布局的研究表明，约10-8至10-7N数量级的横向力迫使胚胎向侧面移动，并且在入口斜面处离开侧面而进入浅收缩部。
试验揭示了微流控传输的几个有趣的特性，例如胚胎之间的速度变化并且趋于沿着通道底部转动、经常正切侧壁等。但是，试验确实揭示了几个其他重要的论点。电渗流动对帮助胚胎移动是有用的，并且可帮助形成用于胚胎处理和受精的栓子。流体流动的电控制必须仔细管理，因为高压可以几种途径伤害胚胎。即使通道部分中胚胎离开了电场，施加的能量也会加热培养基(焦耳加热)使其超过生理温度，并且电解产物改变了PH值。注意胚胎需要约0.029渗摩(Osmol)，即相对高的传导性。而且，EOF在有表面活性剂的通道中降解，但胚胎在有例如BSA表面活性剂的培养基中更好。
通过如图3(a)所示的重力供送装置或通过泵产生流体压力的装置提供电辅助微流控自由传输具有重要的优点。培养基可容易地随时间改变，以便适合发育中的胚胎的改变需求。逐渐改变培养基的成分避免了经常伴随从具有不同培养基的一个皮氏培养皿到第二个皮氏培养皿传输而突然地改变环境而产生施加到胚胎上的应力。本发明的胚胎的微流控处理比用移液管传输物理更严格，并且明显比包括某些刺穿外膜的传统实际操作的许多技术损伤少。
可以预料，在如图3(a)所示的处理装置中对流体流动进行控制，进而控制胚胎的定位将通过大型自动装置中的程序控制仪器来处理。在本发明的胚胎处理装置内的传感条件基础上可采用结合报警和警告的装置。在相似方式中，本发明的处理装置采用传统监控胚胎的仪器。本领域普通技术人员将基本上认识到，微流控胚胎处理装置因此形成一基本构件模块，许多有用的装置都基于此，并且这些装置将结合到本发明的实质中。
一些特定装置已表明了胚胎和卵母细胞的操作、试验和处理。微流控通道的特定几何形状示意描述在图7(a)和7(b)中，并说明能从卵母细胞上去除堆积物。所述几何形状是微流控通道的一系列逐渐收缩部分，它们位于弯曲部分中。虽然图7(a)和7(b)具有弯曲的收缩部，但收缩部不是必须弯曲的。收缩部的内表面最好具有齿状或锯齿状的突起，以便在其经过时帮助切割堆积物。系列中的最后部分具有隔开一定距离的突起，以便避免损坏卵母细胞，前面部分具有间隔逐渐变小的突起，以便在流体压力下迫使卵母细胞经过收缩部时切割周围堆积物部分。在图7(a)中，多个收缩部(弯曲部分)的每一个都分别具有等距的突起，同时先前部分的下游部分采用更小间隔。也可以构造成单一一部分，其中该部分中的突起逐渐靠近在一起，以便达到相同的目的，即在多个位置处更深地切割堆积物而不损坏胚胎。图7(a)和7(b)所示的几何形状用于从牛的卵母细胞中移去堆积物。在样机装置中，微流控通道的直部分是500微米宽。所述装置使用了五个收缩部。第一并且是最大的部分包括一些突起，这些突起的间隔从300微米逐渐减少到第五收缩部的50微米宽。前四个收缩部在堆积物卵母细胞复合体经过时沿着流体流施力切割(已观察到“mohawk(溜冰之一种花式)”切割)堆积物。在第五收缩部处一半堆积物被吸走。流体反向流动几次，以便重新定位卵母细胞，直到另一半堆积物经过最后的收缩部被抽掉。这样，适当尺寸的收缩部和几何形状可用来定位和限制胚胎和周围的结构。
移去堆积物的完整样机装置在图8(a)和(b)中描述，而图8(c)-(f)说明了采用图8(a)和8(b)所示样机从卵母细胞去掉堆积物过程中使用的步骤。聚丙烯阱粘在装载端口，以提供图8(a)中所示的入口处的较大的流体储存池。丙烯酸注射器连接组件退出端口，这样标准的注射器或其他配件可连接到装置。注射器允许手工压力控制，或注射器泵可用作精确的流体控制器，普列克丝玻璃和PDMS原型允许用于胚胎贯穿通道网络的定位，并且在试验期间使卵母细胞在期望位置处停靠。另外，样机装置提供完整的视觉通路(对胚胎分析很重要)，能够快速形成模型，并容易与未来的分析传感器构成一体。通过使用漏斗形入口阱(图8(b)中的流入)简化了在装置中装载卵母细胞。漏形模制成在通道的入口处该漏斗半的尖部与通的头部相连。这种宽漏斗结构允许卵母细胞复合体容易嵌入。卵母细胞典型地沉入漏斗底部。倾斜阱引导复合体进入在漏斗底部的通道入口。该装载方法简化了处理过程，因为它不需要精确的横向定位。为了将堆积物细胞处理成允许完全去除堆积物的结构，合成物经过两个收缩区(图8(c))。这些变窄的区域迫使堆积物在卵母细胞的前后形成两个主块，如图8(d)中所示。两个收缩的堆积物制约区(图8(a))分别是200和150μm宽。堆积物受到损坏，并且在限制区中集拢，然后流到移去端口(见图8(d)-8(f)))，该端口包括在原型装置的微流控通道中的弯曲处彼此九十度放置的两个微小通道。端口允许堆积物进入(图8(e)和8(f))，但端口对于卵母细胞来说太小。使用流体流动控制，首先通过一个端口，然后通过另一个端口，从卵母细胞上吸走堆积物。
本发明的流控通道也用来通过分析胚胎的机械特性实现胚胎健康评价的新颖方法。特定的机械特性证明，区分健康胚胎包括病人胚胎的表面特性和变形特性。胚胎在变形到没有永久损坏的一点后趋于恢复其形状，这被认为是健康的指示器，因为胚胎主动地保持其形状。胚胎通过它们的薄膜有选择地运输离子，并且透明带的蛋白质恒定地重定位它们自己，以抵抗外力。离子和其他基质/代谢物运进和运出胚胎细胞是胚胎健康的功能。不健康的胚胎运输离子的能力降低，并且在变形到避免永久损坏的点后恢复其形状的相应能力降低。压力的控制和能够在收缩部处定位保证了胚胎能够在控制避免健康胚胎永久变形的情况下变形。已实施的变形试验保持压力梯度低于0.1Pa/m(1mm的水/cm)，并且流速等于或低于每秒几毫米。
图9(a)-9(d)示出了用作胚胎生存能力的指示器的胚胎变形评价。收缩部的尺寸确定为胚胎经过时由于流体压力而变形。健康的胚胎能在经过收缩部后较好地恢复图9(d)所示的形状。替代地，胚胎可在收缩部变形，该收缩部的尺寸防止其通过。在收缩部变形一段时间后，流体反向流动，反向和停止流动，或停止流动，使胚胎能恢复其形状。
通过对微流控通道提供的压力进行精确控制还能够估计胚胎与通道阱的静摩擦，因为健康的胚胎更有粘性。这样，当与不健康的胚胎比较时，健康的胚胎可定量测量到，它更缓慢地下降到通道。可供选择的是，可类似地比较运动的距离，在相同的流动和压力条件下健康胚胎运动更短的距离。
通过应用本发明的微流控通道的装置能更好地进行胚胎的流体分析。从本发明的微流控通道培养装置的下游通道收集流体。根据按照本发明形的装置，收集到的流体已流经胚胎，因为本发明的装置避免了出现停滞的条件，并且微流控通道的尺寸使得通道中的流体经过胚胎附近。当下游流体被收集时，可能会期望添加相同量的上游流体，以便保持压力和微流控装置中的流动，由此可收集流体样本。可编程的注射器泵可用来去掉流体样本，并且输入额外的上游流体。可供选择的是，可收集胚胎的所有下游流体，然后例如采用化学或光学分析来分析该流体。
本发明的系统可用于完整的卵母细胞成熟、受精和胚胎发育而无需严格的操作技术。由于能够控制流体和定位胚胎，因而提供了卵母细胞成熟，与精液接触，然后模拟生物学发育的机会，所有这些都在本发明的单一装置中完成。成熟(IVM)，受精(IVF)和发育(EC)需要不同的介质，精子获能成熟和冲洗过程。使用微流控通道的本发明的系统允许这些条件的快速改变和精确控制，允许在几小时或几天的时间中改变流体培养基的成分，以便模拟分泌物和成长因子在女性生殖道中的累积和胚胎移动到生殖道的不同部分。可以控制培养基，以便使其缓慢地流经每个胚胎(或卵母细胞)以提供新鲜供送的营养剂。例如每小时一次的周期性流动与连续流动相比，将能够有限度地建立有益的自动分泌和副分泌因子，同时不会使无用的产物积累。所有现有的IMF，IVF和EC技术可在本发明的简单装置中运用，这样不必在顺序进行的IMF，IVF和EC过程或各个过程的任何一个期间处理或转移给定的卵母细胞。
本发明的系统可减少多精入卵率，使用较少的精虫数量，并接合游动技术以选择最具活力的精子。在典型的人类IVF过程中，在0.5至1.0ml的培养基滴液中，卵被50,000至100,000个精子包围。该数量可减少，因为微流控通道提供使精子和卵母细胞结合到一起的流动控制。
在家畜的IVF中，多精入卵率较高，例如猪约为40-70％。根据本发明，微流控通道导致精子非常靠近卵母细胞经过，例如约30μm。另外，可通过控制培养基流动率来控制精子靠近卵母细胞的时间间隔。替代地，根据本发明定位的停靠卵母细胞可保持非常靠近比较小的精子流体包的嵌入点，在减少多精入卵的机会的同时提供了靠近卵母细胞的精子的高浓度。分离的栓子或弹丸可传递一至几个精子，以建立对输卵管中的状态的状况模拟，在那里任一时刻都有少量精子。该能力以及用于定位胚胎的具有T-交叉点或其他物理或有效的收缩通道允许将一至几个精子传递至卵细胞附近，以减少多精入卵。另外，胚胎数量级的通道的几何形状能够增加卵细胞和精子之间的接触。精子和侧壁的“弹起”增加了精子和卵细胞之间的有效接触。
低温贮藏是另一项技术，该技术有利于根据本发明对胚胎的定位和精确控制围绕胚胎的流体环境。可以向在本发明的装置中定位或移动的胚胎传递低温，之后可反向应用低温贮藏工序。然后，如上所述，流体的改变可用来促成成熟，受精和发育。
以上已展示和描述本发明的各种实施例，但应理解，其他的修改、替代和替换显然是本领域的普通技术之一。这些修改、替代和替换可以在不背离由权利要求限定的本发明的实质和范围的情况下可做出。
本发明的各种特征在权利要求中提出。