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1、(10)申请公布号 CN 102297959 A (43)申请公布日 2011.12.28 CN 102297959 A *CN102297959A* (21)申请号 201010210552.7 (22)申请日 2010.06.23 G01N 33/52(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/33(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) (71)申请人 苏州艾杰生物科技有限公司 地址 215006 江苏省苏州市工业园区宏业路 128 路 B2 栋 (72)发明人 王尔中 (54) 发明名称 氨 ( 氨离子 ) 的测定方法与氨 ( 氨离子 )。
2、 诊 断 / 测定试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及利用酶比色法及酶联法技术的氨 ( 氨离子 ) 含量的测定方法、 试剂的组成及成分， 其测定的技术原理是依据铁氧还蛋白亚硝酸还原 酶、 硝酸还原酶的系列催化反应完成， 本发明还涉 及一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。本发明 的测定方法灵敏度高、 误差小， 因此本发明的测定 方法与试剂盒可以广泛地应用于临床医学 / 食品 / 环境检验。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 9 页 CN 102297968 A1/3 页 2 1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的。
3、氨 ( 氨离子 ) 浓度测定方法， 其测定的技术原理 是根据下述铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶的系列催化反应完成 ： 氨 +2 水 +6 氧化型铁氧还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 亚硝酸 +6 还原型铁氧还蛋白 亚硝酸 + 水 + 辅酶硝酸还原酶硝酸 + 还原型辅酶 2. 一种氨 ( 氨离子 ) 的测定方法， 其特征在于该方法的步骤如下 ： 2.1 样品准备 ： 2.1.1 标准样品的制备 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将其浓度调整到 100 微摩尔 / 升 ； 2.1.2 待测样品的制备 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样 溶于水或缓冲。
4、液中 ； 2.1.3 空白样品 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 ) 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 2.2 试剂溶液的制备 ： 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧 化型铁氧还蛋白， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得到所述的试剂溶液， 它们的浓度分 别是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-5mmol/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L 与 1-100mmol/L ； 2.3待测样品与在步骤2.2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合， 在温 度 15-45。
5、下反应 5-60 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm( 如果受仪器限制， 可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 2.4 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定步骤 2.1.1) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 2.5 在与步骤 2.3) 同样的条件下测定在步骤 2.1.3) 使用的水或缓冲液作为空白溶液 的吸光度随时间的变化 ； 2.6 数据处理 由步骤2.3-2.5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 氨的含量 ： 式中 ： A( 样品 ) 表示步骤 2.3) 得到的待测样品的吸光度变化 ； A( 空白 ) 表示步骤。
6、 2.5) 得到的空白溶液的吸光度变化 ； A( 标准 ) 表示步骤 2.4) 标准样品的吸光度变化。 3. 根据权利要求 1、 2 所述的测定方法， 其特征在于使用全自动生化分析仪测定时， 待 测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样， 然后在下述条 件下进行测定 ： 测定方法为终点法， 温度 37， 反应时间 10 分钟， 测试主波长 340nm， 测试 权 利 要 求 书 CN 102297959 A CN 102297968 A2/3 页 3 副波长 405nm， 被测氨样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为正反应， 延迟时间 1/0 分钟。
7、， 检测时间 4/5 分钟。 4.根据权利要求1、 2或3所述的测定方法， 其特征在于， 所述的稳定剂是一种或多种选 自氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠、 叠氮钠等防腐剂的稳定剂 ； 所述的缓冲液是一 种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷 酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸 缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液 ； 所述的辅酶是一种 或多种选自 NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 5. 根据。
8、权利要求 1、 2 或 3 所述的测定方法， 其特征在于 ： 5.1 所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂 ： 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氧化型铁氧还蛋白、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与 硝酸还原酶组成的 ； 5.2 所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂 ： 试剂 1， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氧化型铁氧还蛋白组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成 的 ； 其中辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂 1 或试剂 2 中的位置是不限定的。 5.3 所述的试剂配制成如下三剂试剂 ： 试剂 1，。
9、 它是由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氧化型铁氧还蛋白组成的 ； 试剂 2， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂与硝酸还原酶组成的 ； 试剂 3， 它是由所述的缓冲液、 稳定剂与铁氧还蛋白亚硝酸还原酶组成的 ； 其中辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂 1、 试剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 6. 一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于 ： 6.1 它由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直 接使用的液体试剂 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmo。
10、l/L 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 1000-80000U/L 硝酸还原酶 1000-80000U/L 氧化型铁氧还蛋白 1-100mmol/L。 6.2 根据权利要求 6.1 所述的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成 如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmol/L 氧化型铁氧还蛋白 1-100mmol/L ； 权 利 要 求 书 CN 102297959 A CN 102297968 A3/3 页 4 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 。
11、铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 1000-80000U/L 硝酸还原酶 1000-80000U/L。 6.3 根据权利要求 6.1 所述的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒， 其特征在于它有 ： 组成 如下的试剂 1 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 辅酶 0.1-5mmol/L 氧化型铁氧还蛋白 1-100mmol/L ； 组成如下的试剂 2 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 硝酸还原酶 1000-80000U/L ； 组成如下的试剂 3 ： 缓冲液 20-500mmol/L 稳定剂 0.001-7mol/L 铁氧还蛋。
12、白亚硝酸还原酶 1000-80000U/L。 权 利 要 求 书 CN 102297959 A CN 102297968 A1/9 页 5 氨 ( 氨离子 ) 的测定方法与氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂 盒 【技术领域】 0001 本发明涉及医学 / 食品 / 环境检验测定技术领域， 更具体地， 本发明涉及氨 ( 氨离 子 ) 诊断 / 测定方法及其试剂盒。 【背景技术】 0002 氨测定的方法有微量扩散法、 离子交换法、 酶法和氨电极法等。 目前应用最多的方 法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。 0003 扩散法是标本碱化后， 释放出 NH3， 用酸滴定释放出的氨， 或用 。
13、Nessler 反应形成 棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化， 内源性的氨形成造成影响， 使其准确性 和精密度受到影响， 目前已很少应用 ； 离子交换法比扩散法更准确， CV 为 8 13 ； 离子 选择电极法是利用 NH3扩散到电极表面， 引起电极的 pH 发生变化进行测定， 该方法的 CV 为 3.5 4.8， 回收率高。结合具体实际， 应以酶法测定为实用。 0004 检索中国专利， 仅查出 87105593.7 专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发 现比较理想的血氨测定方法。 【发明内容】 0005 要解决的技术问题 0006 本发明的目的是提供一种氨 ( 氨离子 ) 的测。
14、定方法。 0007 本发明的另一个目的是提供一种氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。 0008 技术方案 0009 本发明是通过下述技术方案实现的。 0010 本发明的方法是一种采用酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method) 与酶 (偶)联法(Couple Reaction)的联用技术， 利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在 340nm 波长处的吸光度变化测定氨 ( 氨离子 ) 的方法。 0011 本发明氨 ( 氨离子 ) 测定方法的的技术原理是根据下述铁氧还蛋白亚硝酸还原 酶、 硝酸还原酶的系列催化反应完成 ： 0012 氨 +2 水 +6 氧化型铁氧。
15、还蛋白铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 0013 亚硝酸 +6 还原型铁氧还蛋白 0014 亚硝酸 + 水 + 辅酶硝酸还原酶硝酸 + 还原型辅酶 0015 本发明的方法利用铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 (ferredoxin-nitrite reductase ； EC1.7.7.1) 酶 ( 偶 ) 联硝酸还原酶 (nitrate reductase ； EC 1.7.1.1 ； EC 1.7.1.2 ； EC 1.7.99.4) 酶促反应终点法。铁氧还蛋白亚硝酸还原酶酶解氨反应产生亚硝酸， 再通过 (偶)联合硝酸还原酶的作用， 最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶 ( 在 340nm。
16、 处有吸收峰 )， 从而得以测定还原型辅酶在 340nm 处吸光度上升的程度， 这样可 以通过测量 340nm 处吸光度上升的程度， 可以测算氨 ( 氨离子 ) 的浓度大小。 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A2/9 页 6 0016 本发明是通过下述技术方案实现的。 0017 本发明涉及一种氨 ( 氨离子 ) 的测定方法。该氨 ( 氨离子 ) 测定方法的步骤如 下 ： 0018 A、 样品准备 ： 0019 A.1 标准样品的制备 0020 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将氨浓度调整到100微摩尔/升， 得到的溶 液作为标准样品 ； 0021 A.2。
17、 待测样品的制备 0022 待测液体样品直接测试， 无须预处理 ； 将一定量的待测固体样品像制备标准样品 一样溶于水或缓冲液中 ； 0023 A.3 空白样品 0024 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 ) 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0025 B、 试剂溶液的制备 ： 0026 分别移取或称取缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白， 然后将它们混合均匀， 用水溶解得到所述的试剂溶液， 它们的浓度 分 别 是 20-500mmol/L、 0.001-7mol/L、 0.1-5mmol/L、 1000-80000U/L、 1000。
18、-80000U/L 与 1-100mmol/L ； 0027 C、 待测样品与在步骤 B) 得到的试剂溶液按照体积比 1/10 至 1/500 进行混合， 在 温度15-45下反应5-60分钟， 在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设 副波长 ) 下进行测定， 测定其吸光度随时间的变化 ； 0028 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 ； 0029 E、 在与步骤 C) 同样的条件下测定在步骤 A) 空白样品的吸光度随时间的变化 ； 0030 F、 数据处理 0031 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化。
19、， 根据下式计算得到 氨的含量 ： 0032 0033 式中 ： 0034 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0035 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0036 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0037 根据本发明， 在所述的氨(氨离子)测定方法中， 所述的缓冲液应该理解是能够使 其测定介质的 pH 基本保持稳定 ( 一般是 6.0-9.0) 的溶液。如果该 pH 高于 9.0 或 pH 低 于 6.0， 则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果， 因此需要添加更多的介质与 酶， 才有可能达到预期的活性。
20、效果。 0038 在本发明中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲 液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A3/9 页 7 氨酸 - 氢氧化钠缓冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲液。 0039 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0040 更优选地， 所述的缓冲液例如选自。
21、三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0041 根据本发明， 在所述的氨(氨离子)测定方法中， 所述的稳定剂应该理解是一种能 保护试剂中的介质(底物)与酶， 使其不会随着时间推移而改变其性质， 进而失去活性的物 质， 它会使得试剂具备很长的活性寿命， 通常长达数月， 甚至一、 二年。 如果没有所述的稳定 剂， 则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时， 顶多数天， 就会逐渐失去活性而不再具备检 测性能。在本发明中， 所述的稳定剂使用量是 0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不 够， 则试剂活性的寿命就会缩短 ； 如果所述的稳定剂使用量过高。
22、， 则会增加成本。 0042 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种选自氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0043 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、 丙二醇、 甘油或双乙酸钠或 叠氮钠的稳定剂。 0044 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 0045 在本发明中， 所述的辅酶是一种或多种选自 NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 0046 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明使用全自动生化分析仪测定氨 ( 氨离 子 ) 时， 待测样品、 所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下 。
23、( 参数 ) 自动取 样， 然后在下述条件下进行测定 ： 测定方法为二点终点法 / 终点法， 温度 37， 反应时间 10 分钟， 测试主波长 340nm， 测试副波长 405nm， 被测氨 ( 氨离子 ) 样品与试剂的体积比例为 1/10-1/500， 反应方向为正反应， 延迟时间 1/0 分钟， 检测时间 4/5 分钟。 0047 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂溶液配制成如下双剂试 剂 ： 0048 由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氧化型铁氧还蛋白组成的试剂 1 ； 0049 由所述的缓冲液、 稳定剂、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶与硝酸还原酶组成的试剂 2 ； 0050。
24、 其中辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂 1 或 试剂 2 中的位置是不限定的。 0051 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明使用的试剂配制成如下三剂试剂 ： 0052 由所述的缓冲液、 稳定剂、 辅酶、 氧化型铁氧还蛋白组成的试剂 1 ； 0053 由所述的缓冲液、 稳定剂与硝酸还原酶组成的试剂 2 ； 0054 由所述的缓冲液、 稳定剂与铁氧还蛋白亚硝酸还原酶组成的试剂 3 ； 0055 其中辅酶、 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、 硝酸还原酶、 氧化型铁氧还蛋白在试剂 1、 试 剂 2 或试剂 3 中的位置是不限定的。 0056 在本发明氨 ( 氨离子 。
25、) 测定方法中使用的测定仪器可以是紫外 / 可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有 限公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司 的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A4/9 页 8 林帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以 商品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自。
26、动生化分析仪。 0057 本发明还涉及氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒。该氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂 盒由下述粉状试剂组成， 在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的 液体试剂 ： 0058 缓冲液 20-500mmol/L 0059 稳定剂 0.001-7mol/L 0060 辅酶 0.1-5mmol/L 0061 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 1000-80000U/L 0062 硝酸还原酶 1000-80000U/L 0063 氧化型铁氧还蛋白 1-100mmol/L。 0064 根据一种本发明的优选实施方式， 本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂。
27、盒有 ： 0065 试剂 1 ： 0066 缓冲液 100mmol/L 0067 稳定剂 500mmol/L 0068 辅酶 1.25mmol/L 0069 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L ； 0070 组成如下的试剂 2 ： 0071 缓冲液 100mmol/L 0072 稳定剂 500mmol/L 0073 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 16000U/L 0074 硝酸还原酶 12000U/L。 0075 根据另一种本发明的优选实施方式， 本发明的氨(氨离子)诊断/测定试剂盒有 ： 0076 试剂 1 ： 0077 缓冲液 100mmol/L 0078 稳定剂 500mmol/L 0079 辅。
28、酶 1.25mmol/L 0080 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L ； 0081 组成如下的试剂 2 ： 0082 缓冲液 100mmol/L 0083 稳定剂 500mmol/L 0084 硝酸还原酶 120000U/L ； 0085 组成如下的试剂 3 ： 0086 缓冲液 100mmol/L 0087 稳定剂 500mmol/L 0088 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 16000U/L。 0089 根据另一种本发明的优选实施方式， 在本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒 中， 所述的缓冲液是一种或多种选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液、 磷酸盐缓冲液、 咪唑 - 盐。
29、酸缓冲液、 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、 硼砂 - 盐酸缓冲液、 甘氨酸 - 氢氧化钠缓 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A5/9 页 9 冲液、 巴比妥钠 - 盐酸缓冲液、 硼酸 - 硼砂缓冲液、 二乙醇胺缓冲液或 “PBS” 缓冲液的缓冲 液。 0090 优选地， 所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、 磷酸盐缓冲液或 “PBS” 缓冲液。 0091 更优选地， 所述的缓冲液例如选自三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸 (Tris-HCl) 缓冲 液或磷酸盐缓冲液。 0092 在本发明中， 所述的稳定剂是一种或多种。
30、选自氯化钠、 乙二醇、 丙二醇、 甘油或双 乙酸钠或叠氮钠防腐剂的稳定剂。 0093 优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自氯化钠、 丙二醇、 甘油、 双乙 酸钠或 叠氮钠的稳定剂。 0094 更优选地， 所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油或双乙酸钠的稳定剂。 0095 在本发明中， 无论是单剂试剂、 双剂试剂或三剂试剂， 在本发明测定氨 ( 氨离子 ) 的方法中， 所述的辅酶可以是一种或多种选自 NADP+、 NAD+或 thio-NAD+的辅酶。 0096 使用本发明的氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂盒时， 可以使用紫外 / 可见光分析仪， 例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫。
31、外可见分光光度计、 天津喀纳斯光学分析仪器有 限公司销售的 723 可见分光光度计 ； 半自动生化分析仪， 例如上海伟思医用设备有限公司 的 BTS-330 半自动生化分析仪 ； 全自动生化分析仪， 例如 ： 由迈瑞公司以商品名 BS-300、 奥 林帕斯公司以商品名 AU400、 东芝公司以商品名 120、 日立公司以商品名 7600、 雅培公司以 商品名 CB8000 或贝克曼公司以商品名 CX20 销售的全自动生化分析仪。 0097 在采用本发明方法测定氨(氨离子)时， 根据实验要求进行多次试验， 然后将得到 的这些试验结果按照下式计算出精密度 (CV) ： 0098 0099 式中 ：。
32、 0100 - 试验结果平均值 ； 0101 Xi- 各次试验结果 ； 0102 n- 试验次数 .N 10 0103 0104 将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差 ： 0105 0106 第一批各次试验结果平均值 0107 第二批各次试验结果平均值 0108 第三批各次试验结果平均值 0109 为 X， Y， Z 中的最大值 0110 为 X， Y， Z 中的最小值 0111 每批试样数取 n 3 0112 经过大量试验确定， 对于氨 ( 氨离子 ) 含量为 0-1000mol/L 的样品， 其分析误差 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A6/9 页。
33、 10 可以达到 5。 0113 本发明方法的灵敏度可以达到 1mol/L。 0114 通过大量试验确定， 本发明方法测定氨 ( 氨离子 ) 含量范围是 0-1000mol/L， 本 发明方法适合于医学临床 / 食品 / 环境诊断 / 检测。 【具体实施方式】 0115 下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。 0116 实施例 1 ： 血浆中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0117 1) 标准样品的制备 0118 将一定量的氨盐溶于水或缓冲液中， 再将氨浓度调整到 100 微摩尔 / 升 ； 0119 2) 待测样品预处理 0120 血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0121 3。
34、) 空白样品 0122 所述的水或缓冲液作为空白样品， 其氨浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0123 B、 试剂溶液的制备 ： 0124 本实施例的氨诊断 / 测定试剂为单剂试剂， 它含有 ： 0125 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0126 甘油 1mol/L 0127 NADP+ 0.75mmol/L 0128 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 16000U/L 0129 硝酸还原酶 12000U/L 0130 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L。 0131 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0132 C、 待测血浆样品， 与在步骤B)得到的试。
35、剂溶液按照体积比1/20进行混合， 在温度 37下反应 5 分钟， 在主波长 340nm 与副波长 405nm 下进行测定， 测定其 吸光度随时间的 变化 A( 样品 ) 为 0.0277 ； 0133 D、 在与步骤 C) 同样的条件下测定步骤 A) 标准样品的吸光度随时间的变化 A( 标准 ) 为 0.0523 ； 0134 E、 在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时 间的变化 A( 空白 ) 为 0.0106 ； 0135 F、 数据处理 0136 由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化， 根据下式计算得到 氨 ( 氨离子 ) 的含。
36、量 ： 0137 0138 式中 ： 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A7/9 页 11 0139 A( 样品 ) 表示步骤 C) 得到的待测样品的吸光度变化 ； 0140 A( 空白 ) 表示步骤 E) 得到的空白样品的吸光度变化 ； 0141 A( 标准 ) 表示步骤 D) 标准样品的吸光度变化。 0142 通过上式计算得到该血浆样品的氨 ( 氨离子 ) 含量为 82mol/L， 其误差是 2mol/L。 0143 实施例 2 ： 血浆中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0144 1) 标准样品的制备 0145 将一定量的氨盐溶于水中， 再将氨 ( 氨离子。
37、 ) 浓度调整到 100 微摩尔 / 升， 作为标 准样品 ； 0146 2) 待测样品的制备 0147 血浆样品作为待测样品， 无须预处理 ； 0148 3) 空白样品 0149 所述的水作为空白样品， 其氨 ( 氨离子 ) 浓度为 0 微摩尔 / 升 ； 0150 B、 试剂溶液的制备 ： 0151 氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 测定试剂为双剂试剂， 它含有 ： 0152 组成如下的试剂 1 ： 0153 磷酸盐缓冲液 100mmol/L 0154 NAD+ 2.25mmol/L 0155 氧化型铁氧还蛋白 5mmol/L ； 0156 组成如下的试剂 2 ： 0157 磷酸盐缓冲液 10。
38、0mmol/L 0158 乙二醇 5mol/L 0159 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 16000U/L 0160 硝酸还原酶 40000U/L。 0161 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0162 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0163 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0164 计量方法 ： 两点终点法 0165 测试计量时间点 ： 21， 31 0166 主波长 ： 340 0167 副波长 ： 405 0168 反应温度 ： 37 0169 样品体积 ： 20 0170 试剂 1(R1) 体积 ： 200 0171 试剂 2(R3) 体积 。
39、： 50 0172 反应方向 ： 正 0173 标准样品 1 ： 0 0174 标准样品 2 ： 100 0175 定标结果显示 K 值为 4011， 换算成灵敏度为 0.00025A/mol/L。 说 明 书 CN 102297959 A CN 102297968 A8/9 页 12 0176 测试结果显示该血浆中含有氨 ( 氨离子 ) 为 51mol/L。其误差是 1mol/L。 0177 实施例 3 ： 血浆样品中氨 ( 氨离子 ) 含量的测定 0178 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是本实施例 ： 0179 B、 试剂溶液的制备 ： 0180 氨 ( 氨离子 ) 诊断 / 。
40、测定试剂为三剂试剂， 它含有 ： 0181 组成如下的试剂 1 ： 0182 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0183 NAD+ 1.25mmol/L 0184 氧化型铁氧还蛋白 6mmol/L ； 0185 组成如下的试剂 2 ： 0186 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0187 氯化钠 2mol/L 0188 硝酸还原酶 50000U/L ； 0189 组成如下的试剂 3 ： 0190 三 ( 羧甲基 ) 氨基甲烷 - 盐酸缓冲液 100mmol/L 0191 氯化钠 2mol/L 0192 铁氧还蛋白亚硝酸还原酶 26。
41、000U/L。 0193 按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。 0194 C、 样品使用日立 7080 全自动生化分析仪测定 0195 该全自动生化分析仪主要操作参数如下 ： 0196 计量方法 ： 两点终点法 0197 测试计量时间点 ： 21， 31 0198 主波长 ： 340 0199 副波长 ： 405 0200 反应温度 ： 37 0201 样品体积 ： 20 0202 试剂 1(R1) 体积 ： 20 0203 试剂 2(R2) 体积 ： 180 0204 试剂 3(R3) 体积 ： 50 0205 反应方向 ： 正 0206 标准样品 1 ： 0 0207 标。
42、准样品 2 ： 100 0208 定标结果显示 K 值为 4005， 换算成灵敏度为 0.00025A/mol/L。 0209 测试结果显示该血浆中含有氨 ( 氨离子 ) 为 48mol/L。其误差是 2mol/L。 0210 实施例 4 ： 稳定性试验 0211 该实施例的操作方式与实施例 1 相同， 只是在实施例 1 实施后， 实施例 1 使用的试 剂在密闭试剂瓶中在 2-8下存放了半年与一年。 0212 使用同样的标准样品， 使用与实施例 2 同样的新试剂与上述存放半年与一年的试 剂分别进行了测定， 其它条件都与实施例 2 相同， 其测定结果如下 ： 说 明 书 CN 102297959。
43、 A CN 102297968 A9/9 页 13 0213 表 1 0214 氨 ( 氨离子 ) 含量 分析误差 新试剂 201mol/L 4mol/L 存放半年的试剂 202mol/L 4mol/L 存放一年的试剂 205mol/L 4mol/L 0215 表 1 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证获得稳定 的结果， 其稳定性至少一年以上。 0216 实施例 5 ： 线性试验 0217 该实施例的操作方式与实施例 2 相同， 只是配制新的标准样品浓度达到 1200mol/L， 将800mol/L的氨(氨离子)依倍比稀释， 然后进行测试， 其测定结果如下 ： 02。
44、18 表 2 0219 氨 ( 氨离子 ) 预期值 氨 ( 氨离子 ) 测试值 0 0 50 49 100 99 200 98 400 399 600 601 800 798 1000 1003 1200 1150 0220 表 2 结果表明， 使用本发明的试剂盒， 采用本发明的测定方法可以保证线性可以 达到 1000mol/L。 0221 申请人经过实验验证， 采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的， 鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。 0222 总之， 实验证明 ： 采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果空白试剂吸光度变化 (A) 0.01 ； 吸光度时间反应曲线应呈上升曲 线 ； 试剂可测有效(R0.99)线形范围可达1000mol/L ； 试剂测试的不准确度， 其相对偏 差不超过 5 ； 试剂测试的精密度 ( 重复性 ) 的变异系数 (CV) 5 ； 试剂的灵敏度可 达 0.0002。