纤维蛋白原的亲和吸附剂.pdf

为分开、除去、分离、纯化、表征、鉴别或量化纤维蛋白原或作为纤维蛋白原类似物的蛋白，使用亲和吸附剂，其是式II的化合物，其中一个X是N，另一个是N、C-Cl或C-CN；Y是O、S或NR2；Z是O、S或NR3；R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苄基或β-苯乙基；n是0～6；A是载体基体，任选地通过间隔基连接到三嗪环；R7是在中性pH下带有正电荷的基团；W是任选的连接基；V是芳基；R8和R9各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰基氨基、CO2H、磺酸、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基磺酰基或卤素或环状结构比如吗啉基，或R8和R9连接以形成这种环状结构。

权利要求书
1.  亲和吸附剂用于分开、除去、分离、纯化、表征、鉴别或量化纤维蛋白原或作为纤维蛋白原类似物的蛋白的用途，其中所述亲和吸附剂是式II的化合物

其中一个X是N，另一个是N、C-Cl或C-CN；
Y是O、S或NR2；
Z是O、S或NR3；
R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苄基或β-苯乙基；
n是0～6；
A是载体基体，任选地通过间隔基连接到所述三嗪环；
R7是在中性pH下带有正电荷的基团；
W是任选的连接基；
V是芳基；和
R8和R9各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰基氧基、酰基氨基、CO2H、磺酸、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基磺酰基或卤素或环状结构比如吗啉基，或R8和R9连接以形成这种环状结构。

2.  权利要求1的用途，其中VR8R9是环状结构或含有环状结构。

3.  权利要求2的用途，其中所述环状结构是吗啉。

4.  权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式III。

5.  权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式IV。

6.  权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式V。

7.  权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式VI。

8.  权利要求1的用途，其中所述吸附剂具有式VII。

9.  前述权利要求任一项的用途，其中所述纤维蛋白原在血浆样品中。

10.  一种新型化合物，其具有权利要求2～8任一项中所定义的式II，其中R7不是氨基和/或R8是环状结构。

11.  一种化合物，其是根据权利要求10的化合物的前体，其中A被官能团代替，直接地或间接地连接到所述三嗪环，这允许所述前体固定在固体载体上。

说明书纤维蛋白原的亲和吸附剂
发明领域
本发明涉及化合物和它们用作亲和配体的用途。
背景技术
纤维蛋白原是二聚的蛋白，每一半由称为Aα、Bβ和γ的二硫键合的多肽链组成。在肝中，Aα-和Bβ-链的基因分别地将610和461氨基酸残基的单一产物编码。相比之下，γ-链基因的转录的替代剪接产生长度稍有不同的γ-链变体(411和427残基)，其中较短的构成最终产品的～90％。纤维蛋白原的主要形式以～340kDa的分子量分泌到循环中。在其从肝中分泌之后，所述蛋白不但存在于血浆中，而且存在于淋巴和组织间隙液中。在健康的个体中，纤维蛋白原在血浆中的浓度为4～10μM。重要地，在生理应激反应期间，其浓度可以增加至多400％。
通过凝血酶(胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶)将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶水解纤维蛋白原内至少两个特定的Arg-Gly键。该过程初始引起纤维蛋白原纤丝的形成，其可以横向地结合，形成更厚的纤维，所述纤维又可以结合以形成甚至更厚的并支化的纤维蛋白束。通过在位于相邻纤维蛋白分子的α链内的Lys和GIn残基之间形成交联，进一步稳定这种束，以形成能防止或限制血流的三维网络。该交联过程由酶因子XIIIa催化。
存在两种纤维蛋白原的先天性异常：无纤维蛋白原血症和异常纤维蛋白原血症。无纤维蛋白原血症是量上的缺乏，导致出血素质。术语低纤维蛋白原血症指较不严重的纤维蛋白原缺乏症。异常纤维蛋白原血症的标志是纤维蛋白原的功能异常，其会导致出血或者血栓形成。患者可以用纤维蛋白原浓缩物或冷沉淀物进行处理。纤维蛋白原也一般在外科手术期间使用，作为纤维蛋白密封剂形式的止血辅助。这些通常是在适当的药物组合物中的双组分体系，所述双组分体系包含纤维蛋白原(例如以纤维蛋白原浓缩物的形式)和凝血酶。
这些部分净化形式的纤维蛋白原的施用中的问题是存在蛋白污染。因此分离纤维蛋白原的基于亲和性的纯化方法会是有用的。如果能从未贫化血浆中，以特殊的方式，分离纤维蛋白原，使得所有的其它的蛋白组分完整用于进一步操作，那么纯化方法将是特别有用的。
WO97/10887公开了用作亲和吸附剂的式I的基于三嗪的化合物：

其中R1是H、烷基、羟烷基、环己基、NH2、苯基、萘基、1-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并唑或苯并咪唑，任意的所述芳基可以被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、CO2H、磺酰基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基磺酰基和卤素中的一个或多个取代；
一个X是N，另一个是N、C-Cl或C-CN；
Y是O、S或NR2；
Z是O、S或NR3；
R2和R3各自是H、烷基、羟烷基、苄基或β-苯乙基；
Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并唑、1-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；
R4、R5和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰氨基、CO2H、磺酸、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷基磺酰基或卤素；
n是0～6；
p是0～20；和
A是载体基体，任选地通过间隔基连接到三嗪环。
式I的化合物公开为对于蛋白比如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素具有亲和性。
相关结构的化合物公开在WO00/67900和WO03/097112中。它们对于内毒素具有亲和性。
发明内容
意外地，已经发现某些化合物可用于纤维蛋白原基于亲和性的分离，这些化合物中有许多是新的。这些化合物具有式II。

其中X、Y、Z、n和A如上式I所定义；
R7是在中性pH下带有正电荷的基团；
W是任选的连接基；
V是如上对于Q所述的，但是作为替代方案可以为节结构；以及
R8和R9如对于R4、R5和R6所定义，但另外包括环结构，或R8和R9连接以形成这种环结构。
另外，本发明的化合物包括相应的配体，其中A被官能团代替，直接地或间接地连接到三嗪环，其可以固定在载体基体上。下文中，术语″配体″和″吸附剂″可互换地使用。
具体实施方式
WO97/10887、WO00/67900和WO03/097112的说明书公开了如何可以在固体载体上建立配体的组合库。它们的公开内容，包括实施方案的实施例和与本发明相同的步骤，通过参考引入本发明中。在用作为原料的人血浆池筛选这些组合库组期间，许多配体确定为能够选择性地结合和洗脱人纤维蛋白原。
可以通过本领域技术人员已知的方法制备用于本发明的式II的化合物。这种方法记载于上述3个PCT公开中；它们可以容易地适用于新化合物的制备。
WO97/10887给出了A的实例，包括间隔基或连接基L，通过其三嗪环可连接到固体载体M。如WO97/10887所述，这种载体包括琼脂糖，二氧化硅，纤维素，右旋糖酐，淀粉，藻酸盐，角叉菜聚糖，合成聚合物，玻璃和金属氧化物。在反应以形成本发明的吸附剂以前可以活化这种材料。
L例如可以为-T-(-V1-V2)m-，其中
T是O、S或-NR7-；
m是0或1；
V1是任选地取代的2～20个C原子的烃基；和
V2是O、S、-COO-、-CONH-、-NHCO-、-PO3H-、-NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2-或-NR8-；和
R7和R8各自独立地为H或C1-6烷基。
在本发明的化合物中，R7是在中性pH下带有正电荷的基团。这种基团的例子是胍基、脒基等或源于氨基酸比如丙氨酸或苯丙氨酸。
W(如果存在的话)是任选的连接基，其可为烷基、环烷基、氧基烷基或芳环结构，任选地取代(例如，如在精氨酸中被羧酸取代等)。
V如上文对于Q所述的，但是作为替代方案可以为节结构。这种结构的例子包括简单的叔胺或次甲基官能团，以允许形成例如吗啉基团。
R8和R9如对于R4、R5和R6所定义的，但另外包含环结构，或R8和R9连接以形成这种环结构。这种环状结构的例子包括碳环和杂环，饱和、不饱和的或芳香族的环状结构，通常含有4～8个环原子，其中1、2或3个环原子分别地选自N(或NH)、O或S；一个例子是吗啉。
在本发明的一个优选实施方案中，结合纤维蛋白原的配体或吸附剂具有式III(其在生理pH下会质子化)。

在本发明的另一个优选实施方案中，结合纤维蛋白原的配体或吸附剂具有式IV。

在本发明的又一个优选实施方案中，通过如下所示的结构V表示结合纤维蛋白原的配体或吸附剂。

在本发明的更优选的实施方案中，通过如下所示的结构VI表示结合纤维蛋白原的配体或吸附剂。

在本发明的最优选实施方案中，通过如下所示的结构VII表示结合纤维蛋白原的配体或吸附剂。

本发明中记载的结合纤维蛋白原的配体和吸附剂用于从复杂混合物纯化纤维蛋白原，所述复杂混合物包括但不限于人血浆和重组发酵上清液。该应用在下文实施例7中说明，其使用人血浆池通过色谱实验进行。
术语″纤维蛋白原″在本发明中是指纤维蛋白原本身以及具有纤维蛋白原功能特点的类似物，例如，就对于本发明中记载的给定化合物的亲和性而言。因此，所述分析物可以是作为纤维蛋白原功能片段的蛋白，或具有所有相同结合位点中的一个、多个的结构类似物，或融合蛋白。
以下实施例说明本发明。
实施例1  4-(4-吗啉基)苯胺基二氯三嗪的合成
在冰/盐浴中，将氰尿酰氯(16.1g)溶于四氢呋喃(130mL)中，并冷却到0℃。以使得温度不超过0℃的速度将在THF(400mL)中的4-(4-吗啉基)苯胺(29.61g)加入到氰尿酰氯的溶液中。加入完成之后，在0℃搅拌该混合物另外30分钟，然后将溶液加入到冰(700g)和水(1.5L)的混合物中。滤出得到的固体，用水洗(1L)，然后在真空烘箱中在45℃干燥至恒重(28.54g)。
实施例2  吸附剂III的合成
用RO水(667mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(90mL)和表氯醇(127mL)将6％的交联Purabead琼脂糖凝胶(1000g沉降在反渗透(RO)水中)制成浆。搅拌所述浆2小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。环氧基的分析表明每g沉降的凝胶衍生了19.2μmol环氧基。
在加入RO水(400mL)和0.88比重的氨水溶液(100mL)以前，将凝胶中的水排出。搅拌该混合物并加热到40℃，然后在该温度搅拌16小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×500mL)洗。胺基的TNBS分析表明每g沉降的凝胶衍生了28.0μmol胺基。
将沉降的氨化的凝胶(500g)悬浮在pH7.0的1M磷酸钾(500mL)中，然后排水。然后向该凝胶中加入1M pH7.0的磷酸钾(125mL)和RO水(125mL)。剧烈搅拌浆同时加入丙酮(250mL)。在冰/盐浴中冷却30分钟之后，一次性加入在冷丙酮(125mL)中的氰尿酰氯(12.5g)。在0℃搅拌该混合物1小时，然后用50％含水丙酮(5×500mL)、RO水(5×500mL)、50％含水丙酮(5×500mL)和RO水(10×500mL)洗。在取出样品用于分析以前，使得凝胶在重力下沉降。氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶衍生了26.1μmol的取代二氯三嗪。
用RO水(138mL)在冰/盐冷却下浆化来自上述阶段的沉降凝胶(238)，之后加入在冷(8℃)的RO水(95mL)中的2-(4-吗啉基)乙胺(4.39g)，使得反应温度不超过8℃。然后在8℃搅拌混合物1小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(10×250mL)洗。氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶衍生了23.8μmol的取代单氯三嗪。
向238g(沉降的)凝胶中加入溶于RO水中的胍基丁胺硫酸盐(15.42g)(200mL pH调节至pH10，然后用RO水加到238mL的最终体积)。在60℃下搅拌该混合物过夜，同时保持pH在10。取出用于分析的上清液样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(15×250mL)洗。氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶衍生了17.0μmol胍基丁胺。
在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH/25％v/v含水乙醇中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×250mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(250mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH/25％乙醇(5×250mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×250mL)洗。在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH(5×250mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH(250mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH(5×250mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×250mL)洗。在冷室中在4℃下在20％v/v含水乙醇中存储以前，所述凝胶用pH7.0的0.1M PBS(3×250mL)洗，然后再次用RO水(10×250mL)洗。
实施例3  吸附剂IV的合成
用RO水(438mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(59mL)和表氯醇(83mL)将6％的交联Purabead琼脂糖凝胶(650g沉降在RO水中)制成浆。搅拌所述浆2小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用12×1L的RO水洗。环氧基的分析表明每g沉降的凝胶衍生了16.5μmol的环氧基。
在加入RO水(520mL)和0.88比重的氨水溶液(130mL)以前，将凝胶中的水排出。搅拌该混合物并加热到40℃，然后在该温度搅拌16小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。胺基的TNBS分析表明每g沉降的凝胶衍生了22.9μmol的胺基。
用DMF(500mL)浆化500g的一部分沉降的氨化的凝胶，然后排水。然后用DMF(250mL)浆化该凝胶，并在搅拌下加入二异丙基乙胺(DIPEA)(11.0mL)。搅拌该混合物10分钟，然后一次性加入在DMF(250mL)中的4-(4-吗啉基)苯胺基二氯三嗪(20.6g)。在室温下搅拌该混合物3小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用70％v/v含水DMF(4×150mL)、50％DMF(2×150mL)和RO水(10×150mL)洗。氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶衍生了20.2μmol的取代单氯三嗪。衍生之后用TNBS试验不能检测到残余的胺。
在1M硼酸钠缓冲液(150mL)中浆化150g(沉降的)的部分凝胶，并用10M氢氧化钠将pH调节到10。一次性加入精氨酸(5.50g)。在60℃下搅拌该混合物过夜，同时保持pH在10。取出用于分析的上清液样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×250mL)洗。氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶已经衍生了22.4μmol的精氨酸。
在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH/25％v/v含水乙醇中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH/25％乙醇(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在冷室中在20％v/v含水乙醇中存储以前，所述凝胶用pH7.0的0.1M PBS(3×150mL)洗，然后再次用RO水(10×150mL)洗。
实施例4  吸附剂V的合成
用RO水(438mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(59mL)和表氯醇(83mL)将6％的交联Purabead琼脂糖凝胶(650g沉降在RO水中)制成浆。搅拌所述浆2小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。环氧基的分析表明每g沉降的凝胶衍生了16.5μmol环氧基。
在加入RO水(520mL)和0.88比重的氨水溶液(130mL)以前，将凝胶中的水排出。搅拌该混合物并加热到40℃，然后在该温度下搅拌16小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。对于胺基的TNBS分析表明每g沉降的凝胶衍生了22.9μmol的胺基。
用DMF(500mL)浆化500g的一部分沉降的氨化的凝胶，然后排水。然后用DMF(250mL)浆化该凝胶，并在搅拌下加入DIPEA (11.0mL)。搅拌该混合物10分钟，然后一次性加入在DMF(250mL)中的4-(4-吗啉基)苯胺基二氯三嗪(20.6g)。在室温下搅拌该混合物3小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用70％v/v含水DMF(4×150mL)、50％v/v含水DMF(2×150mL)和RO水(10×150mL)洗。对于氯化物释放的分析表明每g沉降的凝胶衍生了20.2μmol的取代单氯三嗪。衍生之后用TNBS试验不能检测到残余的胺。
在1M硼酸钠缓冲液(150mL)中浆化150g(沉降的)的部分凝胶，并用10M氢氧化钠将pH调节到10。一次性加入精氨酸酰胺二盐酸盐(7.75g)。在60℃搅拌该混合物过夜，同时保持pH在10。过滤所述浆，然后用RO水(15×150mL)洗。洗涤并沉降的凝胶的残余氯化物的分析表明所述凝胶已经被精氨酸酰胺衍生完全。
在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH/25％v/v含水乙醇中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在冷室中在20％v/v含水乙醇中存储以前，所述凝胶用pH7.0的0.1M PBS(3×150mL)洗，然后再次用RO水(10×150mL)洗。
实施例5  吸附剂VI的合成
用RO水(438mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(59mL)和表氯醇(83mL)将6％的交联Purabead琼脂糖凝胶(650g沉降在RO水中)制成浆。搅拌所述浆2小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。对于环氧基的分析表明每g沉降的凝胶衍生了16.5μmol的环氧基。
在加入RO水(520mL)和0.88比重的氨水溶液(130mL)以前，将凝胶中的水排出。搅拌该混合物并加热到40℃，然后在该温度下搅拌16小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用12×1L RO水(12×1L)洗。对于胺基的TNBS分析表明每g沉降的凝胶衍生了22.9μmol的胺基。
在1M磷酸钾(70mL)中浆化沉降的氨化凝胶(70g)，并使其沉降。然后加入1M磷酸钾(20mL)，剧烈搅拌混合物，并加入丙酮(10mL)。混合物在冰盐浴中冷却到0℃，然后一次性加入在冷丙酮(17.5mL)中的氰尿酰氯(1.75g)。然后在0-4℃搅拌该浆1小时，然后排水，然后用50％v/v含水丙酮(5×70mL)、RO水(5×70mL)、50％v/v含水丙酮(5×70mL)和RO水(10×70mL)洗。分析表明每g沉降的凝胶连接18.0μmol的二氯三嗪基团。
用50％v/v含水DMF洗所述二氯三嗪基琼脂糖(55g)，然后在50％v/v含水DMF(55mL)中浆化。将4-(4-吗啉基)苯胺(1.23g)溶于75％v/v含水DMF(15mL)中，并用冰冷却，然后加入到二氯三嗪基琼脂糖中。混合物在4℃反应60分钟。此后取出上清液样品，然后用50％DMF(5×100mL)和RO水(10×100mL)洗所述凝胶。反应中释放的氯离子的分析表明每g沉降的凝胶负载206μmol的胺。
在1M硼酸钠缓冲液(37mL)中浆化37g(沉降的)的部分凝胶，并用10M氢氧化钠将pH调节到9。一次性加入4-氨基苄脒二盐酸盐(1.93g)。在60℃下搅拌该混合物过夜，同时保持pH在10。过滤所述浆，然后用RO水(15×150mL)洗。所述凝胶用RO水(10×150mL)洗后，在冷室中在4℃下存储在20％v/v含水乙醇中。
实施例6  吸附剂VII的合成
用RO水(438mL)、10M氢氧化钠(NaOH)(59mL)和表氯醇(83mL)将6％的交联Purabead琼脂糖凝胶(650g沉降在RO水中)制成浆。搅拌所述浆2小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。对于环氧基的分析表明所述凝胶衍生了每g沉降的凝胶16.5μmol的环氧基。
在加入RO水(520mL)和0.88比重的氨水溶液(130mL)以前，将凝胶中的水排出。搅拌该混合物并加热到40℃，然后在该温度搅拌16小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(12×1L)洗。对于胺基的TNBS分析表明所述凝胶衍生了每g沉降的凝胶22.9μmol的胺基。
用DMF(150mL)浆化150g的一部分沉降的氨化的凝胶，然后排水。然后用DMF(75mL)浆化该凝胶，并在搅拌下加入DIPEA (1.38mL)。搅拌该混合物10分钟，然后一次性加入在DMF(75mL)中的4-(4-吗啉基)苯胺基二氯三嗪(2.58g)。在室温下搅拌该混合物3小时。取出用于分析的样品之后，过滤所述浆，然后用70％v/v含水DMF(4×150mL)、50％v/v含水DMF(2×150mL)和RO水(12×150mL)洗。对于氯化物释放的分析表明所述凝胶衍生了每g沉降的凝胶21.4μmol的取代单氯三嗪。残余胺分析表明衍生之后每g沉降的凝胶保留了0.8μmol的胺基。
在1M硼酸钠缓冲液(132mL)中浆化132g(沉降的)的部分凝胶，并用10M氢氧化钠将pH调节到10。一次性加入胍基丁胺硫酸盐(3.73g)。在60℃下搅拌该混合物过夜，同时保持pH在10。取出用于分析的上清液样品之后，过滤所述浆，然后用RO水(15×150mL)洗。氯化物释放的分析表明凝胶已经衍生了每g沉降的凝胶19.9μmol的胍基丁胺。
在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH/25％v/v含水乙醇中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH/25％v/v含水乙醇(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在40℃下在最终浓度0.5M的NaOH中培养凝胶过夜，然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗。最后的清洗之后使得在重力下排水，加入0.5M NaOH(150mL)，并在40℃下培养所述混合物过夜。然后用0.5M NaOH(5×150mL)洗所述凝胶，然后用RO水(10×150mL)洗。在冷室中在4℃在20％v/v含水乙醇中存储以前，所述凝胶用pH7.0的0.1M PBS(3×150mL)洗，然后再次用RO水(10×150mL)洗。
实施例7  人血浆的色谱分析
用每一种吸附剂III、IV、V、VI和VII，使用1cm直径、10mL柱体积的omnifit柱，使用Biologic LP色谱系统，进行色谱实验。用5柱体积的13mM柠檬酸钠、140mM氯化钠pH7.0，100cm/小时，平衡所述柱。然后以50cm/小时加入人血浆(0.45μm过滤的，100mL)。用13mM柠檬酸钠、140mM氯化钠pH7.0进行加入后的冲洗，直到基线吸收度。然后用0.3M甘氨酸、0.5M氯化钠和1％w/v胆酸钠pH9.0洗脱所述柱，并用2M盐酸胍pH7.0消毒。在分析之前立即用0.4MHCl中和洗脱级分。通过浊度测定法分析加入的、未结合的和洗脱的级分，以确定结合和洗脱能力。进行SDS PAGE以确定纯度。
每个洗出液中纤维蛋白原的纯度均大于85％。结合能力和洗脱能力列于表1。
表1
 吸附剂 结合能力(mg/ml) 洗脱能力(mg/ml) III 3.23 3.04 IV 2.76 0.28 V 6.43 3.77 VI 8.36 3.99 VII 17.97 15.04