含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104119448A43申请公布日20141029CN104119448A21申请号201310151609422申请日20130426C07K19/00200601C12N15/62200601C12N15/63200601C12N5/10200601C12P21/0220060171申请人李华顺地址200123上海市浦东新区洪山路1889弄32号901室72发明人李华顺74专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司31266代理人祝莲君雷芳54发明名称含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用57摘要本发明公开了一种含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用。具体的。

2、，本发明涉及一种融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有以下结构AXEY1Y2式IA；AY2Y1EX式IB；其中，A为任选的分泌信号肽；X为SLIT3蛋白神经导向因子3富含亮氨酸的重复序列2LRRS2元件；E为酶切位点；Y1为第一标签多肽元件；Y2为第二标签短肽元件，所述第二标签短肽元件为HIS标签元件；“”表示连接上述元件的肽键或肽接头。本发明融合蛋白有助于LRR正确折叠，形成有活性的功能多肽，而且可以简便地通过一次酶切就将两种标签元件清除，从而制得高纯度、高活性的LRR序列。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表13页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求。

3、书1页说明书11页序列表13页附图3页10申请公布号CN104119448ACN104119448A1/1页21一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白自N端至C端具有式IA或IB所述的结构AXEY1Y2式IA；AY2Y1EX式IB；其中，A为任选的分泌信号肽；X为SLIT3蛋白的富含亮氨酸的重复序列2LEUCINERICHREPEAT2，LRR2元件；E为酶切位点；Y1为第一标签多肽元件；Y2为第二标签短肽元件，所述第二标签短肽元件为HIS标签元件；“”表示连接上述元件的肽键或肽接头。2如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1包括SEQIDNO2所示的改良型亲和素标签STRAPII。

4、标签、链亲和素STREPAVIDIN标签。3如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的Y1为STRAPII标签，而Y2为8HIS标签元件。4如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的SLIT3LRR2的氨基酸序列如SEQIDNO5所示。5一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。6一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。7一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体或转染了权利要求5所述的多核苷酸。8如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞；较佳地包括CHO细胞、293。

5、细胞。9一种制备SLIT3LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤I在合适的表达条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的融合蛋白；II从培养体系中分离纯化出权利要求1所述的融合蛋白；III对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得SLIT3LRR2。10一种制备SLIT3LRR2蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤对权利要求1所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得SLIT3LRR2。11一种纯化的SLIT3LRR2蛋白，其特征在于，是通过权利要求9或10所述的方法生产制备的。权利要求书CN104119448A1/11页3含有。

6、富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用技术领域0001本发明涉及生物分子领域，尤其涉及含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用。背景技术0002神经导向因子SLIT是一种在进化上高度保守的分泌型细胞外基质糖蛋白，其基因在1988年发现在中枢神经系统的形成中发挥作用。SLIT是一组相对分子质量为170190KDA的细胞外分泌蛋白，对轴突生长和神经元迁移起导向作用的轴突定向分子族成员之一。0003SLIT蛋白是作为ROUNDABOUTROBO的配体发挥多功能的导向分子，它不仅具有调节神经轴突生长方向、引导神经细胞迁移、影响神经细胞形态分化的功能。近年来的研究发现，SLIT在血管生成、心脏。

7、形态发生、肿瘤细胞迁移等多种生理过程中也发挥作用。0004在脊椎动物中存在3种SLIT基因，即SLITL、SLIT2、SLIT3，并在各种生物组织中广泛表达。0005SLIT蛋白的主要结构包括N端的胞外分泌信号肽,4个连续的富含亮氨酸的重复序列LEUCINERICHREPEAT，LRRS,也被命名为D1D4结构域，串联的69个EGFEPIDERMALGROWTHFACTOR样功能区，一个LAMINING样结构域和一个富含半光氨酸的C末端结构域。0006为了研究和应用，有必要对SLIT蛋白或其片段进行表达和分离纯化。然而，由于天然蛋白的含量有限，分离困难，因此需要开发高效的重组生产工艺。0007。

8、在重组生产工艺中，高效地生产出构象正确且便于分离和纯化的目的蛋白，常常是较为困难的。常用的大肠杆菌表达系统虽然可以较高效地表达目的蛋白，但却常常需要复杂的复性工艺，且复性后的目标蛋白的活性往往难以令人满意。0008当采用真核表达系统进行表达时，虽然避免了复性工艺，但目标蛋白的正确折叠、如何实现高表达水平以及如何有效分离目标蛋白仍然是难点，尤其是对于某些短肽或含重复序列的多肽而言。0009获得了含目标蛋白的培养液或发酵产物后，可采用各种不同的纯化手段进行分离纯化。目前，一种常用的分离纯化重组蛋白的方法为亲和层析技术。0010以采用的HIS标签为例，6HIS是专门设计用于重组蛋白质纯化工作的标签蛋。

9、白，是目前最常见的表达方式，其表达纯化技术都很成熟，而且相对比便宜，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。通常带组氨酸蛋白都可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附，但是因为HIS标签非常小，如果在融合蛋白折叠过程中被折叠到蛋白内部而导致HIS标签不容易暴露的话，则很难开展蛋白纯化工作；同时HIS标签确实还存在特异性不够的问题。0011通常，使用HIS标签技术分离所得的蛋白质纯度约为90左右，而现有技术中，使蛋白进一步纯化的工艺和步骤都相对较为繁琐，且添加的蛋白或肽段常会对目标蛋白的活说明书CN104119448A2/11页4性造成干扰，导致目标蛋白的表达不准确或杂质过多。。

10、0012综上所述，为了简便高效地制备高纯度、高活性的重组蛋白，本领域迫切需要开发高效简便的生产工艺。发明内容0013本发明的目的就是提供一种高效简便的生产外源蛋白的方法，从而简便高效地制备高纯度、高活性的重组蛋白。0014本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白自N端至C端具有式IA或IB所述的结构0015AXEY1Y2式IA；0016AY2Y1EX式IB；0017其中，0018A为任选的分泌信号肽；0019X为SLIT3蛋白的富含亮氨酸的重复序列2LEUCINERICHREPEAT2，LRR2元件；0020E为酶切位点；0021Y1为第一标签多肽元件；0022Y2为第二标签短肽元件，所述第二。

11、标签短肽元件为HIS标签元件；0023“”表示连接上述元件的肽键或肽接头。0024在另一优选例中，所述的融合蛋白具有位于N端的分泌信号肽。0025在另一优选例中，所述的分泌信号肽是来自于SLIT3的分泌信号肽、或来自于其他蛋白的分泌信号肽。0026在另一优选例中，所述的分泌信号肽在其N端具有或不具有起始氨基酸MET。0027在另一优选例中，所述的第一标签多肽元件的46AA。0028在另一优选例中，在X和E之间的“”为肽键。0029在另一优选例中，在Y1和Y2之间无蛋白酶切位点。0030在另一优选例中，在Y1和Y2之间的“”为肽键。0031在另一优选例中，所述的酶切位点是TEV蛋白酶的酶切位点。。

12、0032LEUGLUVALLEUPHEGLNGLYPRO,SEQIDNO30033在另一优选例中，所述的肽接头长度为315个氨基酸；较佳地510个氨基酸。0034在另一优选例中，所述的SLIT3蛋白来源于哺乳动物。0035在另一优选例中，所述的SLIT3蛋白来源于人、大鼠、小鼠；更佳地，来源于人。0036在另一优选例中，所述的Y1包括SEQIDNO2所示的改良型亲和素标签STRAPII标签、链亲和素STREPAVIDIN标签。0037在另一优选例中，所述的HIS标签元件包括8HIS标签元件和6HIS标签元件。0038在另一优选例中，所述的Y1为STRAPII标签，而Y2为8HIS标签元件。00。

13、39在另一优选例中，所述的SLIT3LRR2的氨基酸序列如SEQIDNO5所示。0040本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。0041在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQIDNO6所示。说明书CN104119448A3/11页50042本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。0043在另一优选例中，所述的表达载体包括真核表达载体、原核表达载体。0044本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体或转染了本发明第二方面所述的多核苷酸。0045在另一优选例中，。

14、所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞；较佳地包括CHO细胞、293细胞。0046本发明第五方面，提供了一种制备SLIT3LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步骤0047I在合适的表达条件下，培养如本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的融合蛋白；0048II从培养体系中分离纯化出本发明第一方面所述的融合蛋白；0049III对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得SLIT3LRR2。0050在另一优选例中，在步骤II中，先用针对Y1元件的亲和层析进行第一次分离；然后用针对Y2元件的亲和层析进行第二次分离。0051在另一优选例中，在步骤III中，还包括将SLIT3LRR2。

15、与多肽EY1Y2或Y2Y1E分开，从而制得纯化的SLIT3LRR2。0052本发明第六方面，提供了一种制备SLIT3LRR2蛋白的方法，所述的方法包括步骤0053对本发明第一方面所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得SLIT3LRR2。0054本发明第七方面，提供了一种纯化的SLIT3LRR2蛋白，是通过本发明第五或第六方面所述的方法生产制备的。0055应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明0056图1为原始的PCDNA31质粒的图谱；0057图。

16、2显示了实施例1中的真核表达SLIT3蛋白的LRR2结构域部分序列的表达质粒的构建方法的流程图；0058图3为SLIT3蛋白的LRR2结构域部分序列的RTPCR扩增电泳图；0059图4为STRAPII蛋白标签、HIS蛋白标签以及TEV酶切位点序列的PCR扩增电泳图；0060图5为构建好的PCDNA31/SLIT3LRR2质粒的图谱；0061图6为WESTERNBLOT方法检测构建质粒的蛋白表达图。具体实施方式0062本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在LRR序列的一端尤其是C端添加第一标签多肽元件和第二标签短肽元件，不仅有助于LRR正确折叠，形成有活性的功能多肽，而且可以极其简便地。

17、通过一次酶切就将两种标签元件清除，从而制得高纯度、高说明书CN104119448A4/11页6活性的LRR序列。在此基础上完成了本发明。0063术语0064如本文所用，“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”、“具有式IA或IB的融合蛋白”可互换使用，均指具有式IA或IB的融合蛋白，其N端至C端分别含有任选的分泌信号肽、目标基因、酶切位点、第一标签多肽元件以及第二标签短肽元件；或任选的分泌信号肽、第二标签短肽元件、第一标签多肽元件、酶切位点以及目标基因。本发明融合蛋白的一个显著特点是在C端或N端具有可通过酶切去除的连续串联标签元件。此外，应理解，所述术语还包括重组融合蛋白的活性片段和衍生物。0065。

18、如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来如果是天然的物质，原始环境即是天然环境。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。0066如本文所用，术语“标签蛋白”、“标签”、“标签蛋白元件”、“标签元件”可互换使用，均指可用于分离纯化具有本发明式IA或IB的融合蛋白的标签多肽。0067SLIT3蛋白及其LRR0068SLIT3蛋白的全长序列如SEQIDNO15所示，编码其蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO14所示。本发明SLIT3LRR2蛋白的序列如SEQIDNO5所示，编码其蛋白的核苷酸序列如S。

19、EQIDNO4所示。0069本发明SLIT3蛋白来源于哺乳动物，优选地，来源于人、大鼠、小鼠。0070如本文所用，“SLIT3LRR2蛋白”是指SLIT3蛋白的LRR2结构域。0071如本文所用，“纯化的SLIT3LRR2蛋白”是指SLIT3LRR2蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化SLIT3LRR2蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。0072肽键或肽接头0073本发明的具有式IA或IB的融合蛋白各元件之间可以直接以肽键相连接，或者通过肽接头连接。作为本发明的一种优选的方式，所述的具有式IA或IB的。

20、融合蛋白各元件之间通过肽键之间连接，从而形成融合蛋白。0074通常，过短的肽接头可在融合蛋白内部造成空间位阻，影响蛋白的正确折叠，过长的肽接头可能增加融合蛋白的免疫原性，还可能影响融合蛋白的活性和功能。因此，可用于本发明的肽接头一般包括315个氨基酸；较佳地为510个氨基酸。0075具有连续串联标签元件的融合蛋白0076本发明融合蛋白的氨基端或羧基端连续地含有两个标签元件如式IA或IB所示。0077AXEY1Y2式IA0078AY2Y1EX式IB0079其中，A、X、E、Y1、Y2的定义如上所述。0080对于第一标签多肽元件Y1而言，优选的Y1选自下组改良型亲和素标签STRAPII标签长度为4。

21、6AA、链亲和素STREPII标签长度为9AA。0081改良型亲和素标签STRAPII标签是在链亲和素STREPII标签的基础上改良过的一种标签蛋白，其多肽序列如SEQIDNO2所示，编码其多肽的核苷酸序列如SEQ说明书CN104119448A5/11页7IDNO1所示。0082本发明STRAPII标签与STREPII标签的纯化方式可以是相同或基本相同，即通过与生物素的亲和力进行层析。与STREPII标签相比，STRAPII标签SEQIDNO2增加了标签的亲和性，其优点在于纯化过程在生理条件下进行，使用的脱硫生物素温和程度的洗脱保护了靶蛋白的活性。而且，避免了常规STREPII标签的纯化技术需。

22、要进行封闭处理步骤。0083Y2为第二标签短肽元件，且为HIS标签元件。可用于本发明的HIS标签元件包括6HIS或8HIS短肽，优选的，为8HIS标签元件。0084此外，Y1和Y2之间无蛋白酶切位点，并以肽键直接连接。0085连续串联标签的蛋白表达方案，一方面是结合两种载体的优点，避免存在的问题，另一方面可以优化蛋白纯化步骤，提高纯化后蛋白的纯度，尽量减少来自动物源性的污染和纯化过程中的离子性污染。0086在本发明融合蛋白中，在元件Y1和X之间为蛋白酶酶切位点，可以包括本领域常用的用于分离纯化蛋白的酶切位点，如TEV蛋白酶、HRV3C蛋白酶。附加条件是，在本发明融合蛋白的其他元件序列中，不含有。

23、该酶切位点。0087TEV蛋白酶是来源于烟草蚀纹病毒TEV的NLA蛋白酶经改进后的50KDA的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签；并且该酶是经由6HIS标签纯化而得含组氨酸标签，纯度达99，剪切反应完毕后可通过NI亲和层析去除。在PH70，30时可达到最佳活性，但在PH5585和430的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而修改。0088一种可用于本发明的蛋白酶酶切位点为TEV蛋白酶，如SEQIDNO3所示。0089此外，在本发明的融合蛋白的N端，可具有或不具有分泌信号肽。当具有分泌信号肽时，有助于。

24、实现融合蛋白的分泌表达，以便提高纯化效率。在本发明中，适用的分泌信号肽包括来自于SLIT3的分泌信号肽、或来外源导入的自于其他蛋白的分泌信号肽。其中，来源于SLIT3的分泌信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO16所示，其编码的信号肽序列如SEQIDNO17所示。0090编码序列和重组生产0091对于本发明的融合蛋白而言，本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。0092本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变。

25、异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。0093如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大说明书CN104119448A6/11页8致上”或“基本上”与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与。

26、模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3端与模板互补的引物的5端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物模板复合物，从而进行扩增。0094本发明融合蛋白的各元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的CDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的CDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增。

27、，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。0095一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。0096此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。0097应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。0098本发明也涉及包含本发明的多核苷酸。

28、的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及制备本发明所述融合蛋白的方法。0099通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤01001用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；01012在合适的培养基中培养的宿主细胞；01023从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。0103本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有。

29、效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导MRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。0104包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。0105宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或SF9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。0106用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指。

30、数生长期后收获，用CACL2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MGCL2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。说明书CN104119448A7/11页90107获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法如温度转换或化学诱导诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。0108在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞。

31、膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理盐析方法、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析HPLC和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。0109表达载体0110在获得了编码本发明融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋白。0111因此，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包。

32、含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。0112如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽分泌前导序列DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。0113在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母。

33、和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如POUWELS等，克隆载体实验室手册ELSEVIER最新版中所描述的。可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体。0114可用于本发明的一种优选的真核表达载体可以为PCDNA31购自INVITROGEN公司。0115表达载体包括连接有合适的转录和翻译调控序列的融合蛋白DNA序列，如来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫的基因。调控序列可包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合。

34、适的调控序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。0116另外，非天然的SLIT3蛋白的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如信号肽分泌引导物序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白可分泌到细胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。0117生产SLIT3LRR2蛋白的方法0118本发明还包括生产融合蛋白以及纯化的SLIT3LRR2蛋白的方法，所述方法包括培说明书CN104119448A8/11页10养含有融合蛋白编码核酸的宿主。

35、细胞，从而培养本发明融合蛋白，从培养体系中分离纯化出权利要求1所述的融合蛋白；以及对所述的融合蛋白，用针对元件E的蛋白酶进行酶解，从而制得纯化的SLIT3LRR2蛋白。0119在分离本发明融合蛋白的标签元件时，可以使用分别针对不同标签元件的亲和层析进行两次分离后，再使用针对酶切位点的蛋白酶进行酶解，从而分离出纯度更高的SLIT3LRR2蛋白。0120所述的融合蛋白包括SLIT3LRR2或其活性片段。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。此外所述方法还可包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。0121可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDSPAGE电。

36、泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如MILLIPORE、PELLICON等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析DEAE等或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q或SP基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱RPHPLC等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。0122可利用含有SLIT3LRR2结构域的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合性多肽进行纯。

37、化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。0123重组蛋白以及编码该重组蛋白的核酸可利用适当的方法制备，例如，化学合成、重组表达，或其合并应用。参见JOHNWILEYSONS，INC2000年出版的CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，以及COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS1989年出版的MOLECULARCONINGALABORATORYMANUAL。0124本发明的有益效果01251本发明融合蛋白独特的连续串联标签元件设计，尤其是经改良的STRAPII标签，其长度合。

38、适，使表达的蛋白在宿主细胞中能够得到各种修饰，能在不影响蛋白质折叠的情况下，最大程度的还原其天然构象，使SLIT3LRR2蛋白能于宿主细胞中表达，其表达量高，且表达完整、准确。01262本发明融合蛋白的连续串联标签元件设计使目标蛋白更易纯化，且标签元件能通过一次酶切完整切除，制备工艺简单，制得的SLIT3LRR2蛋白纯度高，活性强。0127下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等人，分子克隆实验室手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORAT。

39、ORYPRESS,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。0128实施例1构建PCDNA31/SLIT3LRR2载体0129方法采用外切酶法构建质粒。构建质粒的过程，共PCR扩增3段片段信号肽序列、目标序列、酶切位点标签蛋白序列，进行3次片段连接插入。所使用的引物分别是PRIMER1、PRIMER2和PRIMER3。说明书CN104119448A109/11页110130外切酶法具体步骤01311、配制反应体系载体片段BAMHI酶切后胶回收并测定浓度和PCR片段PCR后胶回收并测定浓度各50NG，1UL10X外切酶BUFFER，补。

40、充DDH2O至10UL；01322、冰上放置5MIN，加入1UL稀释至20U/UL的外切酶IIITAKARA公司，混匀后冰上放置60MIN；01333、加入1UL05MEDTAPH80溶液终止反应，之后65水浴5MIN；01344、水浴后冰上放置5MIN；01355、转化连接产物。0136引物0137PRIMER1FCCACACTGGACTAGTTGCCCCACCAAGTGTACCTGSEQIDNO80138PRIMER1RACCGAGCTCGGATCCTTAGGCGACGGCTGGAGGCCCASEQIDNO90139PRIMER2FCCTCCAGCCGTCGCCATCTCCTGCCCTTC。

41、GCCCTSEQIDNO100140PRIMER2RACCGAGCTCGGATCCTTAGAAGCACTCGCTGCTGAACCSEQIDNO110141PRIMER3FAGCAGCGAGTGCTTCCTGGAAGTGCTGTTCCAGSEQIDNO120142PRIMER3RACCGAGCTCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGSEQIDNO130143结果目标序列、酶切位点标签蛋白序列的扩增结果图3和4所示，图中可见，目标序列、酶切位点标签蛋白序列扩增成功。0144实施例2PCDNA31/SLIT3LRR2的成功表达0145方法为了检测构建的质粒是否成功表达，通过把质粒转。

42、染到AD293细胞中，之后经标签蛋白8HIS来做WESTERNBLOT，检测融合蛋白是否成功表达。0146材料HIGHGLUCOSEDMEM培养基、胎牛血清均购自HYCLONE公司；转染试剂MAGETRAN购自ORIGENE公司；AD293细胞用含10胎牛血清的HIGHGLUCOSEDMEM培养液培养。倒置显微镜为OLYMPUS产品，荧光倒置显微镜为NIKON公司产品。0147步骤014821将冻存的细胞复苏培养，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,进行铺板检测。MAGETRAN试剂转染贴壁细胞。014922接种AD293细胞至6孔板，用含10胎牛血清的HIGHGLUCOSEDMEM培养基培。

43、养至密度约为7080时可用于转染。将MAGETRAN试剂及质粒PCDNA31/SLIT3LRR2溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合液200LOPTIDMEM、2G质粒、6LMAGETRAN转染试剂，震荡混匀后静置室温孵育10MIN。给细胞更换新的培养基后将混合液加入培养盘中，摇匀。置于37、5CO2培养箱中培养，培养12小时候移除培养基，更换为新鲜的含10胎牛血清的HIGHGLUCOSEDMEM培养基继续培养，转染48H后，收蛋白用于WESTERNBLOT检测质粒的蛋白表达情况。015023去除培养基后加入4PBS将细胞用细胞刮刮下来放入15ML离心管中，2000转5MIN离心，去除上清。。

44、接着开始裂解细胞，将RIPA强裂解液与蛋白酶抑制剂，1001的比例混合后加到细胞沉淀中，4摇晃裂解1H后，4，14000G离心30MIN，取上清即样品。最后测样品蛋白浓度，并加入LOADINGBUFFER煮沸8MIN，再调平上样量用SDS聚丙烯凝胶电泳跑胶。电泳3小时，转膜2小时，之后抗体孵育，一抗2小时，显色曝光。0151结果WESTERNBLOT检测结果如图6所示。转染质粒组蛋白表达正常，而转染空说明书CN104119448A1110/11页12载组没有检测到蛋白表达，说明所构建的真核表达质粒能正常的在真核细胞中表达，质粒构建成功。0152实施例3表达量的测试0153将一个纯化得到的已知浓。

45、度20G/ML的HISGFP蛋白作为对照，用WESTERNBLOT的方法进行蛋白表达量的测定。0154具体方法同实施例2，先转染细胞，之后做WESTERNBLOT检测。区别在于，跑SDSPAGE电泳时，加入一定已知量的HISGFP蛋白作为阳性对照。0155曝光得到结果后，通过对条带进行灰度分析，计算得到蛋白的表达量。0156实施例4SLIT3LRR2蛋白的纯化0157方法及材料由于采用的蛋白表达系统是哺乳动物高效表达系统，选择的细胞是广泛用于蛋白表达的经过优化的中国仓鼠卵巢细胞CHOS，而表达载体中有加入胞外分泌信号肽，因此采用悬浮培养的方法，使细胞在高密度情况下分泌尽可能多的蛋白到培养液中，。

46、收集培养液用于后续蛋白纯化。0158纯化方法015941先用针对第一标签多肽元件的生物素亲和柱进行层析，再用针对第二标签短肽元件的NI亲和柱进行层析；或016042先用针对第二标签短肽元件的NI亲和柱进行层析，再用针对第一标签多肽元件的生物素亲和柱进行层析。0161首先，对纯化得到的蛋白片段进行定量，按比例的加入TEV蛋白酶进行酶切，去除蛋白标签。0162酶切缓冲液50MMTRIS75，500MMNACL，5GLYCEROL的反应体系，于4过夜酶切。0163酶切过后体系内的标签蛋白片段和TEV蛋白酶均可通过NI亲和层析去除。0164实施例5纯化的SLIT3LRR2的测定0165方法纯化得到SL。

47、IT3LRR2蛋白之后，将采用细胞生物学实验进行功能检测。其中，细胞划痕实验和TRANSWELL细胞迁移实验进行蛋白功能的初步判断。0166划痕实验借鉴了体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。0167胰酶消化对数生长期细胞，计数调整细胞浓度为210105个/ML，24孔板每孔加入500UL细胞悬液，37细胞培养箱中培养24H，使细胞贴壁。用10UL移液枪枪头或者无菌牙签在单层细胞上呈“一”字划痕，用PBS清洗3次，然后加入用2FBS培养基配好的不同的SLIT3LRR2蛋白片段可设置浓度梯度溶液，取34个平行样本，依据肿瘤细胞的侵袭。

48、能力不同，37培养1224H。镜下拍照测量细胞迁移的面积。0168TRANSWELL细胞迁移实验主要采用24孔板小室。用胶原COLLAGEN包被TRANSWELL小室MILLIPORE公司底部膜。消化细胞，PBS洗12遍，用含02BSA的无血清培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度至110105，取细胞悬液200L加入TRANSWELL小室，24孔板下室加入500L含血清的培养基，其中加入不同的SLIT3LRR2蛋白片段。依据肿瘤细胞的侵袭能力不同，37培养1248H。采用结晶紫染色细胞，镜下拍照计数穿过的细胞数，评价SLIT3LRR2蛋白片段对肿瘤细胞侵袭能力的影响。说明书CN104119448。

49、A1211/11页130169在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。说明书CN104119448A131/13页1400010002序列表CN104119448A142/13页150003序列表CN104119448A153/13页160004序列表CN104119448A164/13页170005序列表CN104119448A175/13页180006序列表CN104119448A186/13页190007序列表CN104119448A197/13页200008序列表CN104119448A208/13页210009序列表CN104119448A219/13页220010序列表CN104119448A2210/13页230011序列表CN104119448A2311/13页240012序列表CN104119448A2412/13页250013序列表CN104119448A2513/13页26序列表CN104119448A261/3页27图1图2说明书附图CN104119448A272/3页28图3图4说明书附图CN104119448A283/3页29。