含有偶联的酶系统的组合物.pdf

本发明涉及含有偶联的酶系统的组合物，该组合物用于通过将能产生过氧化氢的第一种酶系统偶联至利用第一种酶系统的非过氧化物产物，并且任选能产生另外的过氧化氢的第二种酶系统而快速有效地生产过氧化氢。

权利要求书
1.  含有第一种氧化酶、第一种底物和至少一种另外的酶的组合物，其中，第一种底物可以由第一种氧化酶氧化而形成过氧化氢和第二种底物；并且该第二种底物可以由所述的至少一种另外的酶转化形成产物。

2.  根据权利要求1的组合物，其中第一种底物是多元醇。

3.  根据权利要求2或3的组合物，其中所述的多元醇是戊糖醇或己糖醇。

4.  根据权利要求2或3的组合物，其中所述的多元醇选自己糖醇、戊糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、半乳糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、阿糖醇、赤藓醇和核糖醇。

5.  根据权利要求4的组合物，其中所述的多元醇是木糖醇。

6.  根据权利要求4的组合物，其中所述的多元醇是山梨糖醇。

7.  根据权利要求1-6任意一项的组合物，其中所述的第二种底物是糖。

8.  根据权利要求7的组合物，其中所述的糖是单糖或二糖。

9.  根据权利要求8的组合物，其中所述的糖选自葡萄糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、异麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、赤藓糖和核糖。

10.  根据权利要求9的组合物，其中所述的糖是木糖或葡萄糖。

11.  根据权利要求1-10任意一项的组合物，其中所述的第一种氧化酶是多元醇氧化酶。

12.  根据权利要求11的组合物，其中所述的第一种氧化酶选自己糖醇氧化酶、戊糖醇氧化酶、山梨糖醇氧化酶、木糖醇氧化酶、麦芽糖醇氧化酶、甘露醇氧化酶、半乳糖醇氧化酶、异麦芽酮糖醇氧化酶、乳糖醇氧化酶、阿糖醇氧化酶、阿糖醇氧化酶、赤藓醇氧化酶和核醣醇氧化酶。

13.  根据权利要求11或12的组合物，其中所述的第一种氧化酶在使用各自的多元醇底物时具有至少5单位/g蛋白质的多元醇氧化酶(特异性)活性。

14.  根据权利要求11-13任意一项的组合物，其中所述的多元醇氧化酶是山梨糖醇氧化酶或木糖醇氧化酶。

15.  根据权利要求11-14任意一项的组合物，其中所述的多元醇氧化酶对各自的多元醇的特异性活性与对相应的糖的特异性活性的比率大于1。

16.  根据权利要求11-15任意一项的组合物，其中所述的多元醇氧化酶对各自的多元醇的特异性活性与对葡萄糖的特异性活性的比率大于1。

17.  根据权利要求11-16任意一项的组合物，其中所述的多元醇氧化酶对山梨糖醇较于对木糖醇具有更高的特异性活性。

18.  根据权利要求11-17任意一项的组合物，其中所述的多元醇氧化酶源于链霉菌属或黄单胞菌属的菌株。

19.  根据权利要求11-18任意一项的组合物，其中所述的第一种氧化酶含有多肽序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2或其同系物、变体或片段。

20.  根据权利要求19的组合物，其中所述第一种氧化酶由序列SEQID NO 1或SEQ ID NO 19组成。

21.  根据权利要求11-20任意一项的组合物，其中存在于该组合物(或加入至该组合物)中的第一种氧化酶活性的水平是在大约0.1-大约200,000单位/kg所述组合物之间。

22.  根据权利要求1-21任意一项的组合物，其中所述的至少一种另外的酶是另外的氧化还原酶。

23.  根据权利要求22的组合物，其中所述的第二种底物可由所述的另外的氧化还原酶氧化而形成过氧化氢和所述产物。

24.  根据权利要求22或23的组合物，其中所述的另外的氧化还原酶是糖氧化酶。

25.  根据权利要求23或24的组合物，其中所述的糖氧化酶选自：碳水化合物氧化酶、寡糖氧化酶、麦芽糖氧化酶、己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、甘露糖氧化酶、半乳糖氧化酶、异麦芽酮糖氧化酶、乳糖氧化酶、阿拉伯糖氧化酶、赤藓糖氧化酶、戊糖氧化酶、木糖氧化酶和丙糖氧化酶。

26.  根据权利要求23-25任意一项的组合物，其中所述的糖氧化酶选自：EC 1.1.3.4葡萄糖氧化酶、EC 1.1.3.5己糖氧化酶、EC 1.1.3.9半乳糖氧化酶、EC 1.1.3.10吡喃糖氧化酶、EC 1.1.3.11L-山梨糖氧化酶和EC 1.1.3.40D-甘露醇氧化酶。

27.  根据权利要求22-26任意一项的组合物，其中存在于所述组合物中的至少一种另外的氧化还原酶的量与第一种氧化酶例如多元醇氧化酶的量的比率大于1，这通过所述组合物中存在的各自的酶单位数测定。

28.  根据权利要求1-27任意一项的组合物，其中从所述第二种底物产生的产物的存在不减少从第一种氧化酶氧化第一种底物而产生过氧化氢的速率。

29.  根据权利要求1-28任意一项的组合物，其中从所述第二种底物产生的产物是内酯、二醛糖或脱氢糖。

30.  根据权利要求1-29任意一项的组合物，其中所述的组合物是可食性的。

31.  可食性组合物，所述的组合物含有根据权利要求30的组合物。

32.  根据权利要求1-31任意一项的组合物，所述的组合物用作药物。

33.  口腔护理产品，所述的产品含有根据权利要求1-32任意一项的组合物和用于口腔护理产品的至少一种另外的成分。

34.  根据权利要求33的口腔护理产品，其中所述的口腔护理产品是选自以下的形式：口香糖、漱口剂、口腔喷雾剂、芳香熏剂、锭剂、口腔清新剂、鼻腔喷雾剂和口服糊剂。

35.  根据权利要求33或34的口腔护理产品，该产品含有木糖醇和/或山梨糖醇。

36.  美容产品，该产品含有根据权利要求1-30任意一项的组合物和用于美容产品的至少一种另外的成分。

37.  皮肤、头发或牙齿漂白产品，该产品含有根据权利要求1-30任意一项的组合物和用于皮肤、头发或牙齿漂白和/或增白产品的至少一种另外的成分。

38.  用于漂白和/或增白外部的哺乳动物组织的美容方法，该方法包括让所述外部的哺乳动物组织以适于漂白和/或增白外部的哺乳动物组织的量和持续时间与根据权要求1-30任意一项的组合物或根据权要求33-37任意一项的产品接触。

39.  根据权利要求38的美容方法，其中所述的外部的哺乳动物组织选自牙齿、头发和皮肤。

40.  去污剂或漂白产品，其适合用于非活体组织，该产品含有根据权利要求1-29任意一项的组合物和用于去污剂或漂白产品中的至少一种另外的成分。

41.  涂料产品，例如海上用涂料、装饰性涂料或保护性涂料，该产品含有根据权利要求1-29任意一项的组合物和用于涂料中的至少一种另外的成分。

42.  杀虫剂，该产品含有根据权利要求1-29任意一项的组合物和用于杀虫剂中的至少一种另外的成分。

43.  根据权利要求1-30任意一项的组合物或根据权要求33-35任意一项的口腔护理产品用于产生过氧化氢的用途。

44.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在口腔护理产品中以提供有益的牙齿漂白和/或增白效果，和/或延长的贮藏期，和/或在使用前或使用期间的抗微生物/抗细菌效果。

45.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在可食用产品中以在由哺乳动物个体消费时提供有益的益生菌效果和/或提供延长的贮藏期。

46.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在美容产品中以提供延长的贮藏期，和/或能漂白和/或增白外部的哺乳动物组织，和/或在施用至人皮肤时具有抗微生物/抗细菌效果。

47.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在去污剂中以在用于非活体材料上时增强该去污剂的漂白、增白或消毒能力。

48.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在涂料产品中，该涂料产品在施用前或施用后显示了提高的防腐性。

49.  根据权利要求43的用途，其中所述的用途出现在杀虫剂产品中，该产品显示了改善的预防、减少或杀死微生物害虫的能力。

50.  用于制备组合物的方法，该方法包括将如任意一项前述权利要求中定义的第一种氧化酶和根据任意一项前述权利要求的第一种底物，以及根据任意一项前述权利要求的至少一种另外的氧化还原酶和合适的基质混合。

51.  根据权利要求50的方法，其中所述的基质是可食用的。

52.  根据权利要求51的方法，其中所述的组合物选自药物、口腔护理产品和饮料。

53.  根据权利要求52的方法，其中所述的基质是去污剂或漂白成分或产品。

54.  根据权利要求53的方法，其中所述的基质是涂料，例如海上用涂料或装饰性涂料。

55.  根据权利要求54的方法，其中所述的基质是杀虫剂基质。

56.  如权利要求1-30中定义的组合物在生产药物中的用途，所述的药物是用于治疗或预防选自以下的医学疾病：龈疾病、龈炎、肠易激综合征、乳糖不耐受、结肠癌、高血胆固醇、高血压、高血压症、感染、炎症和营养缺乏。

57.  医学治疗的方法，该方法包括施用根据权利要求1-30任意一项的组合物或根据权利要求33-35任意一项的口腔护理产品至需要治疗或预防的患者。

58.  根据权利要求57的方法，其中所述的方法是用于治疗或预防选自以下的医学疾病：龈疾病、龈炎、肠易激综合征、乳糖不耐受、结肠癌、高血胆固醇、高血压、高血压症、感染、炎症和营养缺乏。

59.  包装的产品，该产品包含根据权利要求1-30任意一项的组合物，其中所述的组合物保持在所述包装产品内的氧气限制性环境中以便防止或减少在所述包装产品内产生过氧化氢。

60.  含有以下组分的部件套盒：第一种酶、至少一种另外的酶和第一种底物，其中所述的第一种酶和第一种底物相互分开。

61.  产生过氧化氢的方法，该方法包括将第一种氧化酶和第一种底物，以及至少一种另外的酶和合适的基质，在适于由于第一种氧化酶的活性而氧化第一种底物产生过氧化氢和第二种底物的条件下混合，其中所述的第二种底物可以由至少一种另外的酶转化为产物。

62.  根据权利要求61的方法，其中所述的至少一种另外的酶是另一种氧化还原酶，其将第二种底物转化为另外的过氧化氢和产物。

63.  根据权利要求61或62的方法，其中所述的混合步骤包括混合根据权利要求60的部件套盒的组分。

64.  根据权利要求61或62的方法，其中所述的方法包括将包含于根据权利要求59的包装产品内的组合物曝露于外部氧源。

65.  含有多元醇氧化酶和第一种底物的涂料组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。

66.  含有多元醇氧化酶和第一种底物的美容组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。

67.  含有多元醇氧化酶和第一种底物的食物或饲料组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。

68.  根据权利要求59的食物或饲料组合物，其中所述的食物或饲料组合物选自：乳制品，例如牛奶、奶油、奶酪、乳清；饮料，例如果汁。

69.  含有多元醇氧化酶和第一种底物的药物组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。

70.  根据权利要求66的药物，其中所述的第一种底物是木糖醇。

71.  含有多元醇氧化酶和第一种底物的杀虫剂组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。

说明书含有偶联的酶系统的组合物
发明领域
本发明涉及含有偶联的酶系统的组合物，所述偶联的酶系统通过将能产生过氧化氢的第一种酶系统偶联至利用第一种酶系统的非过氧化物产物，并且任选能产生另外的过氧化氢的第二种酶系统而用于快速有效地产生过氧化氢。
发明背景
口臭和牙的变色是影响许多人的病状。口腔的恶臭也称为口臭或难闻的气味。通常认为，引起这些病状是由于口中的厌氧细菌，特别是革兰氏阴性厌氧细菌的存在。这些细菌将产生挥发性硫化合物(VSC)，其被认为引起了口气恶臭。
牙菌斑是在牙齿上形成的浅黄色生物膜。如果不定期除去，其可以导致牙龋洞(龋)、龈炎和牙周炎并最终导致牙缺失。形成该生物膜的微生物几乎完全是细菌，其组成随在口腔中位置而改变。牙周病影响牙周组织(periodontum)，牙周组织是牙周围的包埋和支持组织(即牙周韧带、牙龈和牙槽骨)。龈炎和牙周炎分别是牙龈和更深的牙周组织的炎性疾病。
如今，消费者十分乐于使他们的牙齿变白。具有更白的牙齿的人被认为具有更多自信和更好的社会认同。牙齿包括内部的牙本质层和外部硬的釉质层。釉质层保护内部的牙本质层和活组织并作为固体食物咀嚼的接触表面。釉质层通常是半透明的而且颜色是浅米白色。釉质也被认为是多孔的，因为构成釉质的羟基磷灰石晶体形成了微观的六棱棒或六棱柱，在它们之间具有微观孔隙或通道。由于这种多孔结构，着色剂和退色物质，例如含有着色物质的抗生素、食物、咖啡、可乐、茶、烟草等可以渗入釉质并改变其表面而显得颜色发黄或呈褐色。
由于良好的口腔卫生，如通过用清洗洁牙剂刷牙而获得的良好口腔卫生，可以有助于减少着色、龈炎、牙菌斑、牙周病和/或口臭的发生，但其不必然防止或消除它们的出现。微生物有助于龈炎、牙菌斑、牙周病和/或口臭的开始和发展。因而，为了防止或处理这些病状，必须通过一些除了简单的机械刷洗外的手段来抑制这些微生物。而且，简单的机械刷洗将不会完全有效地除去所有着色类型和/或洁白牙齿。
属于E.C 1.1.3.的酶是氧化还原酶，其利用氧作为受体，CH-OH基团作为供体。已经利用这种氧的氧化还原酶产生过氧化氢(具有抗微生物效果)的能力来改善某些食品(包括奶酪、黄油和果汁)的存储稳定性，如JP-B-73/016612中公开的。而且还提出，氧化还原酶可能可潜在地用作食品中的去氧剂或抗氧化剂。US 6,379,653中描述了含有氧化还原酶的牙漂白组合物，其中牙的漂白通过用葡糖氧化酶处理实现。葡糖氧化酶对葡萄糖是高度特异性的并且需要存在这种在口中降解成造成牙龋洞的生龋性糖。
WO97/06775公开了含有至少一种氧化还原酶的口腔组合物。WO97/06775考虑的氧化还原酶包括含有氧化酶的酶类型中的酶(包括E.C.1.1.3.E.C.1.2.3，E.C.1.3.3，E.C.1.4.3，E.C.1.5.3，E.C.1.7.3，E.C.1.8.3，E.C.1.9.3)、E.C.1.10.3中包含的漆酶和相关酶以及E.C.1.11中的过氧化物酶。非生龋性底物，例如氨基酸、醇、糖醇(例如木糖醇和山梨糖醇)被认为是氧化还原酶的合适底物。考虑的特异性木糖醇氧化酶是JP 80892242中公开的木糖醇氧化酶，据报道其在存在氧时氧化木糖醇、D-山梨糖醇、D-半乳糖醇、D-甘露醇和D-阿糖醇。
将某些氧化酶包含于口用组合物(例如牙膏、口腔清洗剂和洁牙剂)中可以减少牙菌斑和龈炎。已经用作它们的活性成分的酶包括淀粉葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶。这些酶从膳食发酵性糖产生过氧化氢，过氧化氢在存在唾液乳过氧化物酶时又将硫氰酸盐(thiocyanate)转化为次硫氢酸盐。产生的次硫氢酸盐通过干扰细胞代谢而作为细菌抑制剂起作用。山梨糖醇氧化酶例如从Hiraga K.等，″Molecularcloning and expression of a gene encoding a novel sorbitoloxidase from Streptomyces sp.H-7775.″；描述了从链霉菌(Streotomyces sp.)克隆并表达山梨糖醇氧化酶的Biosci.Biotechnol.Biochem.62：347-353(1998)中了解。
大多数批准用于食用的糖替代品是人工合成的化合物。然而，一些天然的糖替代品是已知的，包括山梨糖醇和木糖醇，它们是在浆果、水果、蔬菜和蘑菇中发现的。尽管是天然的，但是它们可以在批量的食品生产中合成产生，以降低生产成本。木糖醇和山梨糖醇都用于口腔护理组合物(例如牙膏或口香糖)以提供甜味，并且在木糖醇的情形中，用于降低乳酸和增加唾液产生(Hayes C.JDent Educ.65(10)：1106-1109 2001)。
尽管已经进行了大量研究来寻找可用于治疗和/或预防龈炎、牙菌斑、牙周病和/或口臭和/或用于洁白牙齿的组合物，用于这些目的的其它有效组合物和治疗方法仍然是期望的。
用于衣物和餐具洗涤的去污剂由多种成分的复杂混合物组成，成分通常包括许多组分，例如离子型和非离子型表面活性剂、溶剂、增量组分、香料、酶和漂白组分。在这种复杂的混合物中，贮存稳定性问题，特别是酶的贮存稳定性问题是众所周知的。在一些情形中，稳定性问题涉及去污剂的物理稳定性，而在一些情形中，其涉及去污剂中各个成分的功能稳定性。漂白剂例如过碳酸盐和过硼酸盐通常用于粉末去污剂中，其中它们与漂白活化剂(例如四乙酰基乙二胺(TAED)和壬酰氧苯磺酸盐(NOBS))一起，在洗涤周期期间一加入水即起作用而产生过酸(例如过乙酸)、过氧化氢和/或其它相关的种类。然后过酸或其它活性氧物种起作用而漂白或减轻织物或餐具上的某些污点。然而，没有理想的漂白系统可在含水流体制剂中使用。而且，需要在衣物洗涤液中稀释时即产生漂白剂(例如活性氧类、过氧化物和过酸)以漂白和/或减轻污点。
酶例如氧化酶特别是对在流体去污剂制剂中的存储稳定性问题敏感。这阻碍了它们在涉及漂白作用的织物和家庭清洁组合物中的广泛使用。在存储期间保持在去污剂中的氧化酶酶促活性已经成为一种挑战，特别是在还含有氧化酶底物成分的去污剂中。氧化酶和氧化酶底物的存在导致原位产生过氧。由于流体和干制剂中酶的氧化，这导致酶稳定性降低。过氧化物通过多种机制，例如氧化酶中的一些氨基酸残基或通过与酶的辅因子相互作用而破坏酶。这常常导致活性逐渐丧失。在干去污剂制剂中，酶可以通过例如如WO 96/02623中描述的，将酶包封来稳定。
发明概述
本发明涉及包含第一种酶、第一种酶的底物和另外的酶的组合物及其用于增白和/或漂白例如牙、皮肤、头发、纺织品或纸的用途、涉及口腔护理产品和用于增白和/或漂白牙的方法、涉及作为防腐剂和作为抗微生物剂的用途、涉及在美容剂中、在去污剂中、在涂料中、在食品和饲料中、在食品和饲料生产和制备中以及在杀虫剂中的用途。
本发明是基于本发明人在将含有第一种酶(例如多元醇氧化酶)和第一种底物(例如多元醇)的过氧化氢产生系统偶联至利用由第一种氧化酶产生的非过氧化氢产物(即第二种底物)、任选进一步产生过氧化氢的另一酶系统(例如氧化还原酶酶系统)时，发现的令人惊奇的增效作用。
已经发现所述的第一种和第二种酶(系统)大大地增强了从第一种酶系统产生过氧化氢的效率，并且还可以导致过氧化氢从第一种和第二种底物两者产生。效果是产生相当高的过氧化氢，并且由于第一种氧化酶和另外的酶/氧化还原酶之间令人惊奇的增效作用，远比期望从第一种底物/第一种氧化酶系统单独(或者所述另一种氧化还原酶酶系统单独)产生过氧化氢的效率更高。好像所述的另一种酶的偶联“涡轮增压(turbo-charge)”了第一种氧化酶，驱动产生很高水平的过氧化氢。
第一种酶优选是氧化酶，并且在此称为第一种氧化酶。优选的氧化酶是多元醇氧化酶，例如山梨糖醇氧化酶。
本发明提供了含有本发明组合物的去污剂组合物以及将本发明组合物用于流体去污剂组合物用以漂白和清洁例如有色的食物污点的方法。
在本发明的研发过程中，令人惊奇地发现，山梨糖醇氧化酶适合用于漂白系统，该系统避免了困扰当前使用的漂白系统的缺点。
第一种氧化酶偶联至另一种酶因而使得能完全利用在第一种底物中锁定的氧化能力。第一种氧化酶看起来起到‘钥匙’的作用，该作用在去污剂环境中令人惊奇地强，并且如在此公开的，使得能有效且快速产生过氧化氢漂白能力，特别是在偶联至另一种氧化还原酶时。
本发明在一方面提供了含有第一种氧化酶、第一种底物和氧化还原酶的组合物，其中第一底物可以由第一种氧化酶氧化而形成过氧化氢和第二种底物，并且该第二种底物可以由所述氧化还原酶氧化而形成过氧化氢和产物。
在另一方面，本发明提供了含有根据本发明的组合物和口腔护理产品中使用的成分的口腔护理产品。
在另一方面，本发明提供了含有根据本发明的组合物和美容产品中使用的一种或多种成分的美容剂。
在另一方面，本发明提供了含有根据本发明的组合物和去污剂产品中使用的一种或多种成分的去污剂产品。
在另一方面，本发明提供了含有根据本发明的组合物和涂料产品中使用的一种或多种成分的涂料产品。
在另一方面，本发明提供了含有根据本发明的组合物和杀虫剂产品中使用的一种或多种成分的杀虫剂产品。
在另一实施方案中，本发明提供了漂白或增白产品，例如用于漂白或增白外部的哺乳动物组织(例如皮肤、头发或牙齿)的漂白或增白产品，该产品含有根据本发明的组合物和适于施用于外部的哺乳动物组织的漂白和增白产品中使用的成分。
在另一实施方案中，本发明提供用用于漂白或增白外部的哺乳动物组织的美容方法，该方法包括让所述外部的哺乳动物组织以适于漂白和/或增白外部的哺乳动物组织的量和持续时间与根据本发明的组合物或根据本发明的用于漂白和/或增白外部的哺乳动物组织的产品接触。
本发明还提供含有根据本发明的组合物的药物。
本发明还提供含有根据本发明的组合物可食用饮料，例如果汁。
在一个实施方案中，所述组合物不含有第一种底物，但是该第一种底物是天然存在或加入至该组合物或施用基质(applicationmatrix)中。
本发明进一步提供含有根据本发明的组合物和至少一种另外的用于去污剂或漂白产品中的成分。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在口腔护理产品中的用途，所述的产品具有有益的牙齿漂白和/或增白效果，和/或延长的贮藏期，和/或在使用前或使用期间具有抗微生物/抗细菌效果。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在可食用产品中的用途，所述的产品在被哺乳动物个体消耗时具有有益的益生菌效果和/或具有延长的储藏期。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在美容产品中的用途，所述的美容产品具有延长的贮藏期，和/或能漂白和/或增白外部的哺乳动物组织，和/或在施用至人皮肤时具有抗微生物/抗细菌效果。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在涂料产品中的用途，该产品在施用前和施用后显示改良的防腐作用，和/或显示减少的防污作用。
本发明进一步提供用于制备组合物的方法，该方法包括将第一种酶和第一种底物以及至少一种另外的酶混合，其中第一种底物可以由第一种酶(例如山梨糖醇氧化酶)氧化，以形成过氧化氢和第二种底物，并且该第二种底物可以由所述的至少一种另外的酶转化而形成产物。
该组合物可以包含第一种酶和至少一种另外的酶与其掺合的合适的基质成分。也可以将第一种底物掺入该基质成分中，或者，在一个实施方案中第一种底物形成该基质成分的部分或甚至整个基质成分。该基质成分因而可以由第一种底物组成或包含第一种底物。
本发明进一步提供用于制备组合物的方法，该方法包括将第一种酶和第一种底物以及至少一种另外的氧化还原酶混合，其中第一种底物可以由第一种氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)氧化，以形成过氧化氢和第二种底物，并且该第二种底物可以由所述的氧化还原酶转化而形成过氧化氢和产物。
本发明进一步提供根据本发明的组合物在生产药物中的用途，所述的药物用于治疗或预防选自以下的医学疾病：龈疾病、龈炎、牙周病、肠易激综合征、乳糖不耐受、结肠癌、高血胆固醇、高血压、高血压症(hypertension)、感染、炎症和营养缺乏。
本发明进一步提供医学治疗的方法，该方法包括施用根据本发明的组合物或根据本发明的药物或口腔护理产品至需要治疗或预防的患者。
本发明进一步提供产生过氧化氢的方法，该方法包括将第一种酶和第一种底物以及至少一种另外的酶在适合产生过氧化氢的条件下混合，所述的过氧化氢是由于第一种酶的活性氧化第一种底物产生，并且任选由于所述的至少一种另外的酶的活性氧化第二种底物而产生另外的过氧化氢，其中所述的第二种底物通过第一种氧化酶氧化第一种底物而产生，并且其中该第二种底物由所述的至少一种另外的酶转化为产物。
本发明进一步提供产生过氧化氢的方法，该方法包括将第一种氧化酶和第一种底物以及至少一种另外的氧化还原酶在适合产生过氧化氢的条件下混合，所述的过氧化氢是由于第一种氧化酶的活性氧化第一种底物以及由于所述的至少一种另外的酶的活性氧化第二种底物而产生，其中所述的第二种底物通过第一种氧化酶氧化第一种底物而产生。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的组合物用于增白和/或漂白的用途。
在另一方面，本发明提供了用于漂白和/或增白牙齿的方法，该方法包括用包含根据本发明的组合物的口腔护理产品以适合用于漂白和/或增白牙齿的量和时间与牙齿接触。
本发明提供了根据本发明的组合物用于增白和/或漂白牙齿的用途。
尽管本发明的主要方面涉及在一些实施方案中(例如下面的实施方案中)的偶联的酶系统，本发明提供了含有如在此谈及的多元醇氧化酶和第一种底物的组合物。已经发现多元醇氧化酶/第一种底物酶系统的使用在这些应用中是高度有益的，例如从非发酵底物产生过氧化氢而任选不降低pH(例如像在不偶联至另外的氧化还原酶系统时)，因而提供了抗微生物/细菌、抗-酸败、漂白和增白特性。
本发明提供了含有多元醇氧化酶和第一种底物的涂料组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。
本发明提供了含有多元醇氧化酶和第一种底物的美容组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。
本发明提供了含有多元醇氧化酶和第一种底物的食物或饲料组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢，例如选自以下的食物或饲料组合物：乳制品，例如牛奶、奶油、奶酪、乳清；饮料，例如果汁。
本发明提供了含有多元醇氧化酶和第一种底物的药物组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢，例如当第一种底物是山梨糖醇或优选木糖醇时。
本发明提供了含有多元醇氧化酶和第一种底物的杀虫剂组合物，其中第一种底物可以由该多元醇氧化酶氧化而形成过氧化氢。
附图说明：
图1：表达质粒(pKB105-TAT-SOX-7775)。
图2：质粒“pKB105-CelA-Sox7775”。
图3：使用具有第一种酶和另一种酶(氧化还原酶)的组合物产生H2O2的初始速度，其中所述的另一种酶1倍-3000倍过量于第一种氧化酶(SOX)，该速度是在300μL ABTS测定法中在5分钟期间测定的。使用葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶两者观察到了引人注目的增效作用，表现出过氧化氢产生速率高达大约250-300％的增加。
图4：使用具有多元醇氧化酶和另一种酶(氧化还原酶)的组合物产生H2O2的初始速度，其中所述的另一种酶1倍-3000倍过量于该多元醇氧化酶，该速度是在300μL ABTS测定法中在5分钟期间测定的。使用葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶两者观察到了引人注目的增效作用，特别是所述的另一种酶以比该多元醇氧化酶大于1倍，例如至少2倍剂量的使用时。
图5a：pET 24a-山梨糖醇氧化酶(H7775)表达载体。
图5b.活性山梨糖醇氧化酶在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株中的表达：
a)含有1.27NdeI-BamHI片段的表达载体，该片段编码链霉菌属(Streptomyces)H-7775 SOX合成基因。
b)在使用山梨糖醇作为底物的凝胶覆盖活性测定法(PMS/NBT)中。阴性对照：泳道1中为葡萄糖氧化酶(GOX)，泳道2-10是来自不同转化体的细胞溶解物。
图6.用于在变青链霉菌(Streptomyces lividans)株g3s3中表达推定的SOX基因的构建体。将推定的SOX基因克隆为Nco1-BamH1PCR片段并插入。
发明详述
在一方面本发明涉及含有第一种酶例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)、第一种底物和另外的酶例如氧化还原酶的组合物，其中第一种底物可以由第一种氧化酶氧化，以形成过氧化氢和第二种底物，并且该第二种底物可以由所述的另外的酶转化产生产物。
优选地，所述的另外的酶是另外的一种氧化还原酶，并且该第二种底物可以由该氧化还原酶氧化产生过氧化氢和(另外的)产物。
根据本发明的组合物可以适用于其中需要产生H2O2的所有目的，例如用于其中需要漂白和/或增白的应用中或用于抗微生物目的，以及特别是用于其中期望非毒性或环境可接受成分的产品中。
第一种底物
在本发明上下文中，术语“第一种底物”指可以由第一种酶(例如第一种氧化酶，例如山梨糖醇氧化酶)氧化而产生过氧化氢和第二种底物的底物。
在本发明的一方面，第一种底物是多元醇，例如一种或多种选自糖醇的底物，所述的糖醇选自D-山梨糖醇、D-木糖醇、D-甘露醇、D-阿糖醇、丙三醇、肌醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇。
在一个实施方案中，第一种底物是一种或多种选自D-山梨糖醇或D-木糖醇的多元醇。
在一个实施方案中，第一种底物是D-山梨糖醇。
人们认识到，以D或L立体异构体存在的糖和糖醇，是D型在自然界中占优势，并因而关于在此提及的第一种和第二种底物，D型是优选的。
在本发明的另一方面，第一种底物是非生龋性增甜剂，例如选自D-山梨糖醇或D-木糖醇的增甜剂。在又一个实施方案中，第一种底物是D-山梨糖醇。D-山梨糖醇和D-木糖醇基本上是非生龋性的并已经用于口腔护理产品，例如口香糖中作为具有有益作用的人工增甜剂(Hayes C.J Dent Educ.65(10)：1106-1109 2001)。
在一方面，第一种底物是一种或多种糖醇底物，所述的糖醇底物选自山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、半乳糖醇、异麦芽酮糖醇(isomalt)、乳糖醇、阿糖醇和赤藓醇。
在一方面，第一种底物可以选自：核醣醇、苏糖醇、来苏糖醇(lyxitol)、蒜糖醇、阿卓糖醇、古洛糖醇(gulitol)、艾杜糖醇、塔罗糖醇、戊糖醇和己糖醇。
在一方面，第一种底物是一种或多种糖醇底物，选自山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、半乳糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、阿糖醇、赤藓醇、丙三醇、肌醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇。
在本发明的一个优选的方面，第一种底物是或含有山梨糖醇。
在本发明的一个方面，第一种底物是或含有木糖醇。
多元醇氧化酶和另外的氧化还原酶是能产生过氧化物(H2O2)的氧化酶。
根据本发明的组合物中存在的多元醇的水平将取决于应用和使用的制剂。对于在口腔护理产品中的使用，可以使用高水平的多元醇，其中多元醇可以是组合物中的主要基质组分。多元醇也可以形成美容制剂中的主要成分。在这种应用中，可以加入多元醇作为湿润剂。也可以将多元醇加至去污剂例如肥皂中，其中它们也可以具有湿润剂功能或作为澄清剂。
然而，在一些应用中，例如在一些涂料和去污剂应用中，可以加入多元醇作为次要成分，其足以提供足够的第一种底物用于产生过氧化氢，但不形成主要的基质成分。
因而，例如，本发明的组合物中存在的第一种底物的水平，在氧化成第二种底物前，可以在大约0.05％-大约80％w/w之间，例如在大约0.1％-大约70％w/w之间。
合适地，在一个实施方案中，口腔护理产品中存在的多元醇水平因而可以在大约1％-大约80％w/w之间，例如在大约10％-大约75％w/w之间，或例如在大约20％-大约70％w/w之间
合适地，在一个实施方案中，涂料产品中存在的多元醇水平可以在大约0.01％-大约20％w/w之间，例如在大约0.1％-大约10％w/w之间，例如在大约1％-大约5％w/w之间变化。
合适地，在一个实施方案中，根据本发明的美容组合物和产品中存在的多元醇水平可以在大约1％-大约50％w/w之间，例如在大约5％-大约40％w/w之间，或例如在大约10％-大约40％w/w之间变化。美国专利7094395公开了含有大约8-32％的多元醇(湿润剂)的美容剂，这种范围也可以本发明的组合物中使用。
合适地，在另外的实施方案中，去污剂产品中存在的多元醇水平可以在大约0.01％-大约40％w/w之间，例如在大约0.1％-大约30％w/w之间，或例如在大约1％-大约20％w/w之间，例如在大约1％-大约10％w/w之间或在大约1％-大约5％w/w之间变化。
第一种酶
第一种酶通常是氧化酶，并且在此称为“第一种氧化酶”。
第一种酶，例如第一种氧化酶可以源于生物体或从其中分离，所述的生物体选自：链霉菌属、黄单包菌属(Xanthomonas)、短杆菌属(Brevibacterium)、弗兰克菌属(Frankia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、两面神菌属(Janibacter)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、副球菌属(Paracoccus)、色素杆菌属(Chromabacterium)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)、假单胞菌属(Psuedomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和芽孢杆菌(Bacillus species)以及它们的同系物。
合适的第一种氧化酶可以包括分类在在选自以下酶分类号(E.C.)下的酶：EC 1.1.3.14儿茶酚氧化酶、EC 1.1.3.18仲醇氧化酶、EC1.1.3.41木糖醇氧化酶、EC 1.1.3.13醇氧化酶、EC 1.1.3.194-羟基杏仁酸氧化酶、EC 1.1.3.20长链醇氧化酶、EC 1.1.3.40D-甘露醇氧化酶。EC 1.1.3.7芳基醇氧化酶、EC 1.1.3.30聚乙烯醇氧化酶、EC 1.1.3.21甘油氧化酶以及EC 1.1.3.38乙烯醇氧化酶。
JP 80892242公开了在存在氧时氧化木糖醇、D-山梨糖醇、D-半乳糖糖醇、D-甘露醇和D-阿糖醇的木糖醇氧化酶。
木糖醇氧化酶可以从链霉菌(Streptomyces sp.)的菌株(例如链霉菌I KD472，FERM P14339)，7.5是其最适宜的pH值，其在pH 5.5-10.5以及在高达65℃的温度下稳定；性质十分适合在此公开的应用，例如口腔护理和去污剂组合物和产品。
在一个特定的实施方案中，第一种酶不是可以从链霉菌(Streptomyces sp.)的菌株(例如链霉菌IKD472，FERM P14339)获得的、具有7.5的最适宜pH值且在pH 5.5-10.5以及在高达65℃的温度下稳定的木糖醇氧化酶。
在本发明的研发过程中，令人惊奇地发现，多元醇氧化酶例如山梨糖醇氧化酶适合用于漂白系统，该系统避免了困扰当前使用的漂白系统的缺点。这些山梨糖醇氧化酶包括从生物体如链霉菌或黄单包菌以及它们的同系物分离的酶。然而，无意于将本发明局限于这些具体的和任意特殊的山梨糖醇氧化酶。
山梨糖醇氧化酶(“SOX”或“SoX”)是一种催化山梨糖醇转化为葡萄糖和过氧化氢的酶。山梨糖醇氧化酶是已知的并且用于多种应用中(参见例如Oda and Hiraga，Ann.NY Acad.Sci.，864：454-457[1998]和Yamashita等，J.Biosci.Bioengin.，89：350-360[2000])。山梨糖醇(D-葡糖醇，C6H14O6，MW 182.2，CAS 50-70-4)是一种在酶产品制剂中通常使用的成分。因而，山梨糖醇氧化酶提供了有吸引力生物漂白剂，用于合并了这些含山梨糖醇糖的酶产品制剂的去污剂中。
在一个实施方案中，与木糖醇比较，第一种氧化酶具有更高的对山梨糖醇的特异性活性，例如与木糖醇比较，具有高至少约1.5倍或至少约2倍的对山梨糖醇的特异性活性。
在一个实施方案中，第一种氧化酶对山梨糖醇具有至少大约5单位/mg的特异性活性。
第一种氧化酶对山梨糖醇和木糖醇底物的特异性活性可以体外测定，例如使用实施例中提供的测定法，或备选地，特异性活性可以在所述的口腔护理组合物内原位测定。
一种优选的SOX是利用共价结合的FAD作为辅因子用于将山梨糖醇氧化为葡萄糖的氧化还原酶。这种酶为其可能自身可用作生物漂白剂以及与碳水化合物氧化酶(carbohydrate oxidase)例如葡萄糖氧化酶和/或己糖氧化酶(参见WO 96/39851)、(葡聚)寡糖氧化酶和雪霉叶枯菌(M.nivale)糖氧化酶(参见WO99/31990)组合使用作为生物漂白剂提供了极难得的机会。
使用这种组合的优势是由于这样一个事实：SOX将山梨糖醇转化为葡萄糖，而葡萄糖然后可以由葡萄糖氧化酶和/或己糖氧化酶转化为葡糖酸，因而每摩尔山梨糖醇产生两摩尔的过氧化氢，如下面图示说明的。
山梨糖醇+O2→D-葡萄糖+H2O2
D-葡萄糖+O2→D-葡糖酸+H2O2
一种优选的甘油氧化酶(GLOX)是青霉属(Penicillium)和葡萄孢属(Botrytis)中发现的一种酶(参见例如，Lin等，Enz.Micro.Technol.，18：383-387[1996]；以及Uwajima等，Agric.Biol.Chem.，44：399-406[1989])。这种酶催化甘油和氧转化为甘油醛和过氧化氢，如下面显示的。
CH2OH-CHOH-CH2OH+O2→CH2OH-CHOH-CHO+H2O2
甘油(丙三醇，C3H8O3，MW 92.09，CAS 56-81-5)通常用于酶产品制剂、肥皂和去污剂制剂、食品和饮料、药物中，并且广泛用于美容和个人护理应用中。因而，甘油氧化酶提供了有吸引力生物漂白剂，用于掺入了这些含甘油的酶产品制剂的去污剂中。
在本发明的研发过程中，山梨糖醇分离自变青链霉菌(SCO6147)(SEQ ID NO.2)和链霉菌H7775(SEQ ID NO.1)(参见，Hiraga等，Biosci.Biotech.Biochem.，61：1699-1704[1997])。山梨糖醇氧化酶在这些生物体的细胞内和细胞外表达。辅基是共价结合的FAD(1mol FAD对1mol SOX)。因而，其为黄素蛋白，对于H7775 SOX，典型的最大吸收是在276、358和455nm，对于SCO6147 SOX(如在变青链霉菌中表达的)是在345nm，这指示组氨酸-黄素键。黄素在功能上参与山梨糖醇的氧化，这通过UV-VIS谱中的期望改变观察到。FAD与蛋白质十分紧密地结合并因而提供了稳定的酶用于衣物洗涤应用。
SOX基因从链霉菌H-7775(Genbank登记号为AB000519)克隆并测序。
来自链霉菌H-7775(Genbank登记号为AB000519)的山梨糖醇氧化酶基因含有一个1260bp的开放阅读框(ORF)，其编码具有420个氨基酸的蛋白质，理论的分子量为45,158道尔顿。该酶在pH 7.5-10之间在30℃下24小时是稳定的，其最适宜的温度是在pH 7.5下50℃。其在高达55℃时也是热稳定性的。这种酶的鉴定了的最近同系物是木糖醇氧化酶(51％的同源性)。SOX是一种有效用于多种应用的酶，所述的应用包括去污剂、织物保养、家居护理、口腔护理(例如牙齿增白和/或清洁)、个人护理、纺织加工、食物加工和工业清洗。而且，许多SOX可以催化其它底物，例如木糖醇、甘露醇、阿糖醇、核醣醇、赤藓醇、肌醇、丙三醇、丙二醇和丁二醇。因而，这种酶利用更广的底物谱，提供了在多种应用中使用底物的灵活性。
这些第一种底物的许多，如在此提供的，存在于通常的去污剂、口腔护理和美容制剂中或可以加入至它们中。
来自链霉菌H7775的山梨糖醇氧化酶的氨基酸序列是本领域已知的并且在SEQ ID NO：1中列出。
如上面指出的，发现在此利用的多元醇氧化酶例如山梨糖氧化酶是热稳定性的并且在广的pH范围内是稳定的。确实，发现使用的山梨糖醇氧化酶的pH谱与工业中以及去污剂和其它去污剂中必须使用的pH相兼容。
而且，由本发明提供的多元醇氧化酶例如山梨糖醇氧化酶可以优选产生糖例如葡萄糖，即一种醛产物，其可以用其它的氧化酶例如己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶进一步氧化成葡糖酸(羧酸产物)，从起始底物山梨糖醇释放另外的过氧化氢分子。类似地，由山梨糖醇氧化酶、木糖醇氧化酶、甘露醇氧化酶在大气氧的帮助下氧化多元醇例如木糖醇、阿糖醇、甘露醇而分别形成对应的糖，例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖，作为用于由其它有关的氧化酶例如己糖氧化酶、木糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、阿拉伯糖氧化酶和甘露糖氧化酶进一步氧化的第二种底物是可行的。
对于在可食用组合物和口腔护理组合物的使用，使用在口腔中的常有pH值下，即在pH 5.0-9.0之间，优选pH 6.0-8.5之间，特别是pH 6.4-7.5之间基本有活性的酶也是有利的。
在一个实施方案中，多元醇氧化酶是戊糖醇或己糖醇。
在一个实施方案中，多元醇氧化酶不是丙糖氧化酶，或不是甘油氧化酶。
应该认识到，酶可以对多于一种底物具有活性。因而，当我们用其氧化的化合物的名称提及酶时，例如山梨糖醇氧化酶(山梨糖醇)或己糖氧化酶(己糖)或葡萄糖氧化酶(葡萄糖)，该名称指该酶已经给定的类别，例如EC号，或本领域中称呼该酶的名称，或与该酶对其具有最高特异性活性的底物比较的主要的活性。在这方面，山梨糖醇氧化酶对山梨糖醇比例如木糖醇具有更高的特异性活性。合适地是，山梨糖醇氧化酶，在一个实施方案中，也可以催化几种多元醇的氧化，所述的几种多元醇包括D-山梨糖醇、D-木糖醇、D-甘露醇、D-阿糖醇、丙三醇、肌糖、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇中的至少两种。
在一个实施方案中，多元醇氧化酶选自核糖醇氧化酶、苏糖醇氧化酶、木糖醇氧化酶、蒜糖醇氧化酶、阿卓糖醇氧化酶、古洛糖醇氧化酶、艾杜糖醇氧化酶、塔罗糖醇氧化酶、戊糖醇氧化酶和己糖醇氧化酶。
在一个实施方案中，多元醇氧化酶对用其命名的多元醇的特异性活性与对一种备选底物(如在此列出的所述第一种底物或所述第二种底物，不包括用其命名的多元醇底物)的特异性活性的比率大于1，例如大于大约1.5，例如大于大约2，例如大于大约3，例如例如大于大约4，例如大于大约5，例如大于大约10。在一个实施方案中，多元醇氧化酶对山梨糖醇的特异性活性与对备选底物的特异性活性的比率大于1，例如大于大约1.5，例如大于大约2，例如大于大约3，例如例如大于大约4，例如大于大约5，例如大于大约10，其中所述备选底物选自：糖例如麦芽糖、己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、异麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、赤藓糖、戊糖、木糖和丙糖，优选葡萄糖；丙糖多元醇，例如甘油；和木糖醇。
在一个实施方案中，多元醇氧化酶不是木糖醇氧化酶。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)展示出对山梨糖醇比对木糖醇更高的活性，例如至少是其1.5倍的活性，例如至少2倍的活性。在相同的实施方案中或在不同实施方案中，多元醇氧化酶对山梨糖醇较于对木糖醇，具有不多于3倍的活性。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)选自：山梨糖醇氧化酶、木糖醇氧化酶、麦芽糖醇氧化酶、甘露醇氧化酶、半乳糖醇氧化酶、异麦芽酮糖醇氧化酶、乳糖醇氧化酶、阿糖醇氧化酶、阿糖醇氧化酶和赤藓醇氧化酶。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)在使用各自的(例如多元醇)底物时，具有至少大约5单位/g蛋白质的(特异性的)氧化酶活性，所述的底物选自：山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、半乳糖醇、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、阿糖醇、阿糖醇和赤藓醇。
优选的第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)是山梨糖醇氧化酶或展示山梨糖醇活性的酶。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)是木糖醇氧化酶或展示木糖醇氧化酶活性。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)是甘油氧化酶或含有甘油氧化酶活性。
在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)对各自的多元醇的特异性活性与对相应的糖的特异性活性的比率大于1，例如至少大约1.5，例如至少大约2，例如至少大约3，例如至少大约4，例如至少大约5，例如至少大约10。在一个实施方案中，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)对各自的多元醇的特异性活性与对葡萄糖的特异性活性的比率大于1，例如至少大约1.5，例如至少大约2，例如至少大约3，例如至少大约4，例如至少大约5，例如至少大约10。
在一个实施方案中，第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶或木糖醇氧化酶)源于链霉菌属菌株，例如天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或链霉菌IKD472，或从其获得。
在一个实施方案中，第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)源于天蓝色链霉菌菌株或从其获得。
在一个优选的实施方案中，第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)是由SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2及其同系物、变体或片段组成或源于它们的多肽。
在一个实施方案中，使用实施例6提供的测定法，该多元醇氧化酶对D-山梨糖醇、D-木糖醇、D-核糖醇、肌醇和丙三醇有活性。在可能相同的或不同的另一实施方案中，该多元醇氧化酶对1，3丙二醇和/或1，2丙二醇有活性。
在一个实施方案中，使用实施例6提供的测定法，该多元醇氧化酶对丙二醇和/或乙二醇不具有活性。
山梨糖醇氧化酶(SOX)可以从合适的微生物例如链霉菌属获得。Hiragi K.等，(Biosci.Biotechnol.Biochem.62：347-353(1998))描述了在大肠杆菌中产生重组的山梨糖醇氧化酶。其它来源在例如美国专利5,741,687和5,472,862中描述，其中描述了来自日本岐阜县不破郡关原町(Sekigahara-cho，Fuwa-gun，Gifu Prefecture，Japan)土壤的黄单包菌属例如嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophilia)TE3539(FERM BP-4512)的微生物。其它多元醇氧化酶的实例是来自蜗牛(Helix aspersa)和Arion ater的甘露醇氧化酶(EC 1.1.3.40)，其催化D-阿糖醇、D-甘露醇的氧化，并且在较低程度上，催化D-葡糖醇(山梨糖醇)的氧化，以及来自天蓝色链霉菌的木糖醇氧化酶(EC 1.1.3.41)，其氧化D-木糖醇为木糖和H2O2，以及氧化D-山梨糖醇为葡萄糖和H2O2。
第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇或木糖醇氧化酶)可以从微生物来源例如细菌或真菌获得。特别是来自属于放线菌纲和放线菌目的细菌。
第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇或木糖醇氧化酶)可以从不同物种获得，这些物种是链霉菌属、黄单胞菌属、短杆菌属、弗兰克菌属、诺卡氏菌属、两面神菌属、伯克霍尔德菌属、副球菌属、色素杆菌属、喜热裂孢菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属和芽孢杆菌以及它们的同系物。
第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇或木糖醇氧化酶)可以从链霉菌，优选从天蓝色链霉菌菌株或链霉菌IKD472(Yamashita，Mitsuo等，Journal of Bioscience and Bioengineering(2000)，89(4)，350-360)和链霉菌H-7775(Hiraga，Kazumi等，Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry(1997)，61(10)，1699-1704.)获得。
JP 09206072公开了链霉菌属的山梨糖醇氧化酶及其产生方法和用途，其也可能用于本发明。
JP 06169764公开了黄单胞菌的山梨糖醇氧化酶，其也可能用于本发明。
在本发明的一个方面，第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)源于链霉菌菌株。
在另一方面，第一种酶，例如第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)通过重组方法产生。
在一个实施方案中，第一种酶/氧化酶和另一种酶在环境温度下是有活性的。
在一个实施方案中，第一种酶/氧化酶和另一种酶在口腔或身体温度(例如大约37℃)下是有活性的。
尽管认识到技术人员将会以适合所需要求的水平(有效量)施用第一种酶/氧化酶，我们设想在一个实施方案中第一种氧化酶是在大约0.1-大约200,000单位/kg之间，例如在大约0.1-大约100,000单位/kg之间，例如在大约1-大约100,000单位/kg之间，例如在大约5-大约50,000单位/kg之间，例如在大约10-大约20,000单位/kg之间，例如在大约100-大约10,000单位/kg之间的水平。用于在一些实施方案中使用的其它合适的范围包括在大约10-大约1,000单位/kg之间，或在大约1-大约10,000单位/kg之间。
在一个实施方案中，涉及口腔护理组合物时可以使用在1-10000U(单位)/100g之间的第一种氧化酶。对于一些实施方案，大约5-20单位/100g的剂量也认为是合适的。
对于在食品和饲料组合物中的使用，上述剂量范围也是合适的。
在一个实施方案中，涉及涂料组合物时可以使用在大约10-大约10000U(单位)/100g之间的第一种氧化酶例如多元醇氧化酶。对于一些实施方案，大约10-50单位/100g的剂量也认为是合适的。
在一个实施方案中，涉及美容组合物时可以使用在大约1-大约10000U/100g之间的第一种氧化酶例如多元醇氧化酶。对于一些实施方案，大约5-20单位/100g的剂量也认为是合适的。
在一个实施方案中，涉及去污剂组合物时可以使用在大约0.1-大约10000U/100g之间的第一种氧化酶例如多元醇氧化酶。对于一些实施方案，大约5-100单位/100g的剂量也认为是合适的。
第二种底物
第二种底物能够由(至少一种)另外的酶转化为产物。第二种底物优选能由另外的酶(另外的氧化还原酶)氧化而产生另外的过氧化氢和产物。
在本发明上下文中，术语“第二种底物”指是第一种底物氧化的结果并可由所述的另外的酶转化而形成产物的底物。
在优选的实施方案中，术语“第二种底物”指是第一种底物由第一种酶氧化的结果并可由所述的另外的氧化还原酶氧化而形成过氧化氢和产物的底物。
在一方面，第二种底物是一种或多种糖，例如选自葡萄糖、木糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、异麦芽酮糖、乳糖、阿拉伯糖和赤藓糖的糖。
在一方面，第二种底物是一种或多种糖，例如选自核糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖和塔罗糖的糖。
第二种底物因而可以是或包含例如葡萄糖，例如在第一种底物是或包含山梨糖醇时。
由于第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)和另外的酶(例如另外的氧化还原酶)之间显著的增效作用，第二种底物的稳态水平通常是低的。在口腔护理产品中以及防腐应用例如涂料或美容剂中，低水平的第二种底物是高度有利的，特别是在第二种底物是发酵性或生龋性糖，即可以促进或’喂养’有害生物体例如微生物/细菌(例如口腔中的生龋性细菌)或藻类和藤壶类(barnicales)(例如海船用的涂料上的积垢)生长的化合物。因此，本发明不仅提供过氧化氢高效且大量的产生，还提供其中存在最低水平的发酵性底物的系统，减少不需要的有害生物体的生长的可能性。
在一个实施方案中，如通过摩尔比测量的，存在于根据本发明的组合物中的由第一种氧化酶产生的第二种底物(例如一种或多种发酵性或生龋性糖)的水平是少于大约50，例如少于大约25％，例如少于大约10％，例如少于大约5％，例如少于大约1％，例如少于大约0.5％，例如少于大约0.1％，例如少于大约0.05％，例如少于大约0.01％的存在于该组合物中的多元醇的(初始)水平。
在一个优选的实施方案中，第二种底物是糖。
在一个实施方案中，糖是单糖己糖，例如选自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖的己糖。
在一个实施方案中，糖是单糖戊糖，例如选自核糖、阿拉伯糖、木糖或来苏糖的戊糖。
在一个实施方案中，该糖是三糖、例如丙醛糖或酮丙醣。
在一个实施方案中，该糖是二糖例如蔗糖或麦芽糖。
另外的酶
(至少一种)另外的酶的特征是其能够转化第二种底物而产生产物。
另外的酶不是与第一种酶相同的酶或酶实体(enzymaticentity)。然而，在一个实施方案中，另外的酶可以连接至第一种酶，例如第一种酶和另外的酶可以作为多蛋白共表达。
另外的酶可以是在根据本发明的组合物内或在在此公开的应用中能将第二种底物转化为产物的任何酶，其存在不会不利地影响第一种酶氧化第一种底物产生过氧化氢。
合适的另外的酶的实例包括葡萄糖脱氢酶(E.C：1.1.1.118)，其在提供NAD+时导致产生D-葡萄糖酸-1，5-内酯+NADH；葡萄糖1-脱氢酶(E.C：1.1.1.119)(NADP(+))，其在提供NADP+时导致产生D-葡萄糖酸-1，5-内酯+NADPH；葡糖激酶(E.C.2.7.1.2)，其磷酸化葡萄糖的COOH基团而产生葡萄糖-6-磷酸；葡糖激酶，其转化D-葡萄糖+D-果糖<＝>D-葡糖酸内脂+D-葡萄糖醇。
因而在一个实施方案中，该组合物可以包含另外的化合物，该化合物由所述的另外的酶利用与第二种底物一起产生产物合适的这种另外的化合物可以例如选自NAD+、NADP+或果糖。
在一个优选的方面，(至少一种)另外的酶是(至少一种)另外的氧化还原酶(也称为氧化还原酶)。
另外的氧化还原酶优选是不同于多元醇氧化酶的氧化酶。另外的氧化还原酶不是在此在第一种酶的上下文中提及的多元醇氧化酶。
氧化还原酶是属于EC类型1.x.x.x的酶。在本发明中，氧化还原酶利用氧受体，例如CH-OH或醛或氧(EC 1.2.3.x)
在一个实施方案中，在本文中的氧化还原酶是属于EC类型1.1.3.的酶，与作为受体的氧反应。例如，己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)是在存在氧时能将D-葡萄糖和几种其它还原性糖(包括麦芽糖、乳糖和纤维二糖)氧化成它们对应的内酯，在形成过氧化氢时内酯随后水解为各自的醛糖二糖酸的酶。通过己糖氧化酶催化对葡萄糖和半乳糖的氧化可以例如如下显示的：
D-葡萄糖+O2→δ-D-葡萄糖酸内酯+H2O2，或
D-半乳糖+O2→γ-D-半乳糖酸内酯+H2O2
在本发明的另一方面，氧化还原酶是选自己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、碳水化合物氧化酶和寡糖氧化酶例如(葡聚)寡糖氧化酶中的一种或多种。在本发明的另一方面，氧化还原酶是一种或多种催化糖氧化的酶，例如选自碳水化合物氧化酶、(葡聚)寡糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶。在本发明的另一方面，氧化还原酶是葡萄糖氧化酶和/或己糖氧化酶。在本发明的又一方面，氧化还原酶是己糖氧化酶。
在一个优选的实施方案中，氧化还原酶是糖氧化酶(sugaroxidase)，例如选自以下的糖氧化酶：碳水化合物氧化酶、寡糖氧化酶、麦芽糖氧化酶、己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、甘露糖氧化酶、半乳糖氧化酶、异麦芽酮糖氧化酶、乳糖氧化酶、阿拉伯糖氧化酶、赤藓糖氧化酶、戊糖氧化酶、木糖氧化酶、丙糖氧化酶。
在一个实施方案中，糖氧化酶选自：EC 1.1.3.4葡萄糖氧化酶、EC 1.1.3.5己糖氧化酶、EC 1.1.3.9半乳糖氧化酶、EC 1.1.3.10吡喃糖氧化酶、EC 1.1.3.11 L-山梨糖氧化酶和EC 1.1.3.40 D-甘露醇氧化酶。
合适的氧化酶可以根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的建议(1992)鉴定在酶分类号E.C.1(氧化还原酶)下的酶，其为催化氧化还原反应的酶，特别是在E.C.1.1.3.或E.C.1.2.3下列出的氧化酶，即利用CH-OH或醛或氧基作为供体作用于分子氧(O2)并产生过氧化物(H2O2)的氧化酶。
合适的葡萄糖氧化酶可以源于曲霉(Aspergillus sp.)，例如黑曲霉素(Aspergillus niger)的菌株，或来自枝孢霉(Cladosporiurnsp.)，特别是尖孢枝孢霉(Cladosporium oxysporum)的菌株，尤其是WO 95/29996(来自Novo Nordisk A/S)中描述的尖孢枝孢霉CBS163。
来自红海藻爱尔兰海藻(Chondrus crispus)(通常称为爱尔兰青苔)的己糖氧化酶(Sullivan和Ikawa，(1973)，Biochim.Biophys.Acts，309，p.11-22；Ikawa，(1982)，Meth.In Enzymol.89，carbohydrate metabolism part D，145-149)氧化广谱的糖类，例如D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖、D-葡萄糖6-磷酸、D-甘露糖、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧-D-半乳糖、D-海藻糖、D-葡糖醛酸和D-木糖。
而且红海藻Iridophycus flaccidum产生可易于提取的己糖氧化酶，其可以氧化几种不同的单糖和二糖(Bean和Hassid，(1956)，J.Biol.Chem，218，p.425；Rand等，(1972，J.of Food Science 37，p.698-710)。
己糖氧化酶的广的底物谱在关于牙齿漂白时是有利的，因为口腔中存在的可用底物(即糖类)的总量显著大于具有更特异性的催化性质的相关酶的总量。
EP 1041890中描述的来自雪霉叶枯菌糖氧化酶作用于几种糖，包括葡萄糖和木糖以及作用于寡糖。
能作用于几种糖和寡糖的另一种氧化还原酶从点枝顶孢霉(Acremonium strictum)获得(Lin等，Biochemica and BiophysicaActa 118(1991))。其在面包应用中的使用在JP 11056219中描述。
合适的氧化还原酶的其它实例是葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)和半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.9)。
在一个实施方案中，氧化还原酶是一种或多种选自碳水化合物氧化酶、己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶的酶。
在一个实施方案中，氧化还原酶是己糖氧化酶。
合适的氧化还原酶的另一个实例是己糖氧化酶(HOX)(EC1.1.3.5)，其可以通过从几种红色海藻物种例如Iridophycusflaccidum(Bean和Hassid，1956)和爱尔兰海藻(Sullivan等，1973)分离该酶而获得。在本发明的一个优选的方面，HOX是如WO 01/38544中描述的获得或制备。HOX可以从Danisco A/S(DairyHOXTM)获得。
所述的另外的氧化还原酶的剂量可以在与上面提及的关于多元醇氧化酶的范围相同的范围内，尽管应该认识到在一个实施方案中，加入了过量的所述的另外的氧化酶，如在此指出的。
酶组合物
优选地是使用了纯化的酶，例如山梨糖醇氧化酶和/或另外的氧化还原酶，即酶在加入本发明的组合物之前进行了纯化。酶的纯度优选用SDS-PAGE和密度测定法测定。纯化的酶是至少约20％的纯度，例如至少大约30％的纯度，例如至少大约40％的纯度，例如至少大约50％的纯度。然而应该认识到，纯化的酶可以与其它蛋白质配制，例如与蛋白质稳定剂(例如BSA)或其它酶混合，因此酶纯度的评估排除了在纯化后加入至该酶的蛋白质。
过氧化氢产生的速率可以通过，例如，制备含有特定比率的有效量的第一种酶/氧化酶与另外的酶/氧化还原酶的组合物来控制。通常，以及如实施例中显示的，所述的另外的酶/氧化还原酶不断增加的过量导致过氧化氢产生速率增加。
在一个实施方案中，产生的(或可产生的)总的过氧化氢的摩尔量大于转化(或可转化)为第二种底物的第一底物的摩尔量或存在的第一种底物的量。在一个实施方案中，合适地是，产生的(或可产生的)过氧化氢的摩尔量是转化(或可转化)为第二种底物的第一底物摩尔量或存在的第一种底物的量的大于100％和小于或等于200％之间。与单独使用山梨糖醇糖氧化酶而产生单分子的过氧化氢比较，本发明的使用因而使得能从第一种底物山梨糖醇产生2分子的过氧化氢。在一个实施方案中，产生的(或可以产生的)过氧化氢摩尔量多达可以从没有另外的氧化还原酶的多元醇氧化酶系统产生的过氧化氢摩尔量的2倍。
在一个优选的实施方案中，至少一种另外的酶/氧化还原酶的量与存在于根据本发明的组合物中的第一种酶/氧化酶例如多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)的量的比是大于1，这通过所述组合物中存在的各个酶单位的数目测定，例如大于大约1.5，例如大于大约2，例如大于大约3，例如大于大约5，例如大于大约10，例如大于大约20，例如大于大约50，例如大于大约100，例如大于大约150，例如大于大约200，例如大于大约300，例如大于大约500，例如大于大约1000。
根据本发明的组合物的另一个优势是选择产生增白剂过氧化氢而不积累生龋性增甜剂或糖作为产物的酶和底物的组合的可能性。
例如，SOX催化D-山梨糖醇氧化而产生1摩尔D-葡萄糖和1摩尔H2O2。氧化还原酶例如HOX催化D-葡萄糖氧化而产生1摩尔D-葡糖酸和1摩尔H2O2。组合使用SOX和HOX因而从1摩尔山梨糖醇氧化酶底物产生了2摩尔H2O2，如下面的图示说明的。
SOX酶促反应的结果是中间产物葡萄糖，其是生龋性的，但是其具有短的生存期，因为其快速地转化为葡糖酸。本发明的另一个优势是每产生2摩尔过氧化氢仅形成了1摩尔葡糖酸。


上面描述的反应表示通过两个相继的酶促步骤多元醇转化为相应的酸。示例是D-山梨糖醇转化为葡糖酸。(1)D-山梨糖醇、(2)通过多元醇氧化酶催化(3)D-葡萄糖(4)通过己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡聚寡糖氧化酶、碳水化合物氧化酶催化(5)D-葡萄糖酸-1，5-内酯(6)在含水环境中水解(7)D-葡糖酸。
该反应可以概括如下：
第一种氧化酶         另外的氧化还原酶
多元醇→糖           →内酯
另外的特定实例包括：
山梨糖醇→葡萄糖     →D-葡萄糖酸-1，5-内酯
半乳糖醇→半乳糖     →D-半乳糖酸-1，5-内酯*
甘露醇→甘露糖       →D-甘露糖酸-1，5-内酯
乳糖醇→乳糖         →D-乳糖酸-1，5-内酯
木糖醇→木糖         →D-木糖酸-1，5-内酯
*(或D-半乳己二醛糖(如果使用半乳糖氧化酶)在C6氧化)
内酯产物在含水环境中通常转化为酸。第一种氧化酶可以选自在此公开的那些。另外的氧化还原酶是如在此提及的糖氧化酶，例如己糖氧化酶或甘露糖氧化酶(用于甘露糖)。
存在于本发明的组合物的每种酶的量或存在于或加入至在此提及的组合物或(应用)产物的酶的总量将取决于使用的酶和所需的期望制剂，但是通常可以在总组合物重量的大约0.0001％-大约20％之间，例如大约0.001％-大约10％之间，大约0.005％-大约2％之间，大约0.01％-大约1％之间。
通常，已经发现这两种酶的偶联产生的过氧化氢与单独使用第一种酶/第一种底物系统的比率是大约200-300％。尽管多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶)和另外的氧化还原酶(例如己糖或葡萄糖氧化酶)两者采用等价的单位剂量使过氧化氢的产生获得了相当大的提高，通过加入过量的另外的氧化还原酶至组合物进一步增强了增效作用，导致产生更多的过氧化氢且以更快的速率产生。
在本发明的一个方面，该组合物含有山梨糖醇氧化酶和己糖氧化酶以及作为第一种底物的D-山梨糖醇。
在本发明的另一个方面，该组合物含有山梨糖醇氧化酶和葡萄糖氧化酶以及作为第一种底物的D-山梨糖醇。
在一个实施方案中，例如当另外的氧化还原酶是HOX时，多元醇氧化酶例如山梨糖醇或木糖醇氧化酶可以催化D-木糖醇氧化产生1摩尔木糖和1摩尔H2O2。这特别是在其中存在不同于木糖醇的备选多元醇，例如山梨糖醇的实施方案中可能是有利的，因为由于HOX对木糖具有低的活性，木糖将积累。木糖是益生菌化合物(prebioticcompound)。因此这种组合物可以用于食品和饲料组合物中，或用于药物，或用于制备食物或饲料组合物或药物的制备，用于增加木糖含量而同时也获得本发明的其它有利效果。
多元醇氧化酶(例如山梨糖醇氧化酶或木糖醇氧化酶)和多元醇(例如D-木糖醇或山梨糖醇)的使用具有这样的优势：使用非毒性成分获得了H2O2产生的抗微生物和/或增白效果，并且避免了加入生龋性化合物。
组合物基质
合适地，根据本发明的组合物可包含通常用于在这里提及的产品和应用或其他合适的应用/产品的其他材料。
恰当地选择该基质材料以确保与组合物中使用的酶相容以使得能使用有效量的酶。
产物
如上文中描述的，优选的实施方案是在所述的另外的酶作用于第二种底物时产生了另外的过氧化氢和产物。所述的产物因而不同于过氧化氢。
在一个实施方案中，通过另外的酶作用于第二种底物获得的产物可以是不止一种单一产物，即可以是多种产物。
产物在本发明的组合物中或在此描述的应用中的积聚优选不会不利地影响由第一种酶转化第一种底物产生过氧化氢的速率。确实，正如本发明者发现的，第二种底物转化成产物有效地去除了第二种底物，这不仅通过影响第一种酶对第一种底物的活性极大提高了过氧化氢的产生速率，而且减少了可能不希望的第二种底物的积聚。
在一个优选的实施方案中，该产物由另一种氧化还原酶氧化第二种底物产生，并且可以是例如内酯(在C1处氧化)、二醛糖(对于戊糖在C5处氧化，对于己糖在C6处氧化等)。一个实例是由半乳糖氧化酶产生的D-半乳己二醛糖或脱氢糖(如果氧化发生在糖链中间的任何其他位置)。另外的实例是由吡喃糖氧化酶在C2处氧化葡萄糖而产生的2-脱氢-D-葡萄糖。
产物可以选自D-葡萄糖酸-1，5-内酯、D-木糖酸-1，5-内酯、D-麦芽糖酸-1，5-内酯、D-甘露糖酸-1，5-内酯、D-半乳糖酸-1，5-内酯、D-己二醛糖，D-乳糖酸-1，5-内酯、D-阿拉伯糖酸-1，5-内酯、D-赤藓糖酸-1，5-内酯、D-核糖酸-1，5-内酯、D-来苏糖酸-1，5-内酯、D-蒜糖酸-1，5-内酯、D-阿卓糖酸-1，5-内酯、D-古洛糖酸-1，5-内酯、D-艾杜糖酸-1，5-内酯、D-塔罗糖酸-1，5-内酯和异麦芽酮糖的内酯，以及可能更多的一些来自半乳糖氧化酶对糖的C6位置氧化的产物。
定义
除非另外说明，本发明的实践涉及通常用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域和工业酶的使用和发展的常规技术，所有这些都是在本领域技术范围内。
除非在此另外定义，这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员通常理解的相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury的Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，2d Ed.，John Wiley and Sons，NY(1994)以及Hale和Margham的The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)给本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管类似或等同于在此描述的那些方法和材料的任何方法和材料可用于本发明的实践，在这里描述了优选的方法和材料。因此，在下面定义的术语通过将参考整篇本文来更充分地描述。同样，如在此使用的，单数术语“一种”、“一个”、“所述”和“该”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。除非另外说明，分别将核酸按5′至3′的方向从左到右书写；氨基酸序列按氨基至羧基的方向从左到右书写。应该理解，本发明不限于描述的特定方法论、方法和试剂，因为这些可以取决于本领域技术人员使用它们的环境而变化。
这意味着本说明书中通篇给出的每个最大数值界限包括每一个较小的数值界限，就如同这些较小的数值界限在这里明确写出一样。在本说明书中通篇给出的每个最小数值界限将包括每个较大的数值限制，就如同这些较大的数值界限在这里明确写出一样。本说明书中通篇给出的每个数值范围将包括属于这个较宽数值范围的每个更窄的数值范围，就如同这些更窄的数值范围都在这里明确写出一样。
当涉及酶的“相应的多元醇底物”时，它指所述酶利用的底物，例如山梨糖醇氧化酶的相应底物是山梨糖醇，而木糖醇氧化酶的相应底物是木糖醇。
如在此使用的，术语“相容的”表示组合物基质材料(其他成分)不会减少在此提供的氧化酶的酶促活性至该氧化酶没有如在正常使用情形中所理想的有效程度。下文中详细地举例说明了具体的清洁组合物材料。
如在此使用的，“酶的有效量”指获得特定应用中所需的酶促活性所需要的酶的量。这种有效量容易通过本领域一般技术人员确定并且基于许多种因素，例如使用的特殊酶变体、清洁应用、清洁组合物的特定组成，以及需要流体组合物还是干(例如，粒状)组合物等。
氨基酸和多核苷酸的同源性可以用ClustalW算法采用标准设置测定：参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html，方法：EMBOSS：：water(局部)：Gap Open ＝10.0，Gap extend＝0.5，使用Blosum 62(蛋白质)或DNAfull(用于核苷酸序列)。
在提及“第二种底物可由至少一种另外的酶转化而形成产物”时，优选第二种底物可由所述的另外的酶(氧化还原酶)氧化形成过氧化氢和产物。
如在此使用的，关于多肽(序列)例如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO2的术语“变体”指用原始(亲本)多肽或利用序列信息，通过在所述多肽中插入、删减或取代一个或多个氨基酸，即至少一个氨基酸，但优选少于约50个氨基酸，例如少于约40、少于约30、少于约20、少于约10个氨基酸，例如1个氨基酸、1-2个氨基酸、1-3个氨基酸、1-4个氨基酸、1-5个氨基酸而制备的多肽。
如在此使用的，关于多肽序列例如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的术语“同系物”指与所述的多肽序列至少约70％同源，例如至少约80％同源，例如至少约85％同源，或至少约90％同源，例如至少约95％同源、约96％、约97％、约98％或约99％同源的多肽。两个多肽序列之间的同源性可以用ClustalW比对算法，采用如在此提及的标准设置测定。
如在此使用的，关于多肽序列例如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的术语“片段”指仅由所述多肽序列的一部分组成的多肽。因此，片段可以包含或由至少约50％，例如至少约60％，例如至少约70％，例如至少约80％，例如至少约90％或例如至少约95％的所述多肽序列组成。
根据本发明的变体、同系物和片段都保留了亲本酶的至少部分期望的(为本发明的目的)的酶促活性，例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或全部的亲本酶的酶促活性。
技术人员将认识到，当我们通过酶的特定SEQ ID来确定优选的酶用于本发明的组合物和方法时，其包括源自核酸的酶，所述核酸在他们的天然宿主种或异源宿主种中表达时编码相应的氨基酸SEQ ID，并因而这种酶可以受到共翻译或翻译后处理。
如在此使用涉及浓度、活性和条件等的术语“大约”包括并明确公开了涉及的确切值和确切范围。
如在此使用的术语“多元醇”指含有多于一个羟基的糖醇。多元醇是不同于糖的术语，因为多元醇仅含有羟基(COH)基团并且属于广义的醛糖醇，而糖具有羰基基团(COOH)。
二糖和单糖都可以形成糖醇；然而，源于二糖的糖醇(例如麦芽糖醇和乳糖醇)没有完全氢化，因为只有一个醛基可用于还原。在一个实施方案中，糖醇完全氢化。
通常将糖醇加入至食品中，因为他们的热焓比糖低；可是他们通常也是不太甜的，并且常常与高强度的甜味剂组合。也将他们加入至口香糖中，因为他们不受口中的细菌代谢(即分解)，所以他们不会促进牙脱落。麦芽糖醇、山梨糖醇和异麦芽酮糖醇是一些更普通的类型。糖醇可以在适度的还原条件下由他们的类似物糖形成。
如在此使用的，术语“氧化酶”指催化涉及分子氧(O2)作为电子受体的氧化/还原反应的酶。在这些反应中，氧还原成水(H2O)或过氧化氢(H2O2)。氧化酶是氧化还原酶的一个亚类。
术语“多元醇氧化酶”指能够将多元醇氧化成相应的糖的酶。多元醇通过多元醇氧化酶的氧化导致产生过氧化氢。
如在此使用的，术语“葡萄糖氧化酶(“Gox”)”指结合β-D-葡萄糖(即，六碳糖(葡萄糖)的异构体)并有助于使糖分解成它的代谢产物的氧化酶(EC 1.1.3.4)。GOx是催化β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸-1，5-内酯(随后水解成葡萄糖酸)伴随着分子氧还原成过氧化氢的二聚体蛋白质。
如在此使用的，术语“醇氧化酶(“Aox”)”指将醇转化成醛伴随着分子氧还原成过氧化氢的氧化酶(EC 1.1.3.13)。
如在此使用的，术语“胆碱氧化酶”(“Cox”)指催化胆碱四-电子氧化成甜菜碱，甜菜醛作为中间产物，伴随着两分子的分子氧还原成过两分子的氧化氢的氧化酶(EC1.1.3.17)。
如在此使用的，术语“己糖氧化酶(“Hox”)”指使单糖和二糖氧化成它们相应的内酯，伴随着分子氧还原成过氧化氢的氧化酶(EC1.1.3.5)。己糖氧化酶能够氧化多种底物，包括D-葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖等。
如在此使用的，“甘油氧化酶”指催化甘油氧化成甘油醛，伴随着分子氧还原成过氧化氢的氧化酶(EC 1.1.3.)。
应该认识到，酶的活性将取决于可利用的条件和底物，因而与在根据本发明的组合物内或与这种组合物在期望应用中使用比较，标准测定条件(体外测定)下的酶的活性可能会不同。在一个实施方案中，酶促活性如实施例中提及的通过体外检测法测定。备选地，原位测定酶的活性，即在根据本发明的组合物中并在使用该组合物的条件下测定。可以将与用于体外活性的相同的分析方法用于测定原位酶促活性，只是该检测法用组合物基质，或在根据本发明的组合物/产物的使用条件下进行。
如在此使用的，术语“糖”指单糖、二糖和寡糖、己糖，例如选自乳糖、麦芽糖、山梨糖、丙糖、戊糖、己糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、异麦芽糖、赤藓糖的糖。
糖含有醛基团(-CHO)或者酮基团(C＝O)，其中存在碳-氧双键，使糖有活性。优选地，术语糖符合(CH2O)n，其中n是在3和6之间，例如3、5或6，或者5或6。
糖可以是丙糖、戊糖或己糖，优选戊糖或己糖，优选为闭链形式。
糖可以选自蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖。
如在此使用的，“口腔护理产品”是表示这样一种产品：其不用于吞咽以全身施用治疗剂，而是保留在口腔内足够的时间以充分接触全部牙齿表面和/或口腔粘膜组织用于发挥口腔活性。在本发明的范围内，口腔护理产品也包括用于清洁义齿(denture)、假牙等的产品。口腔护理产品可以具有任意合适的外形，例如粉剂、糊剂、凝胶剂、流体剂、软膏剂、口香糖片剂或喷雾剂。
如在此使用的，“清洁组合物”和“清洁制剂”指可用于除去需要清洁的物品，例如织物、器皿、隐形眼镜、其他固体基材、头发(洗发剂)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等上的不希望的化合物的组合物。该术语包含选择用于期望的特殊类型的清洁组合物和产品形式(例如流体剂、凝胶剂、颗粒剂或喷雾剂组合物)的任何物质/化合物，只要所述的组合物与该组合中使用的氧化酶和其他酶以及组合物中的任何可逆的酶抑制剂兼容。清洁组合物材料的具体选择容易通过考虑将要清洁的表面、物品或织物以及在使用过程中清洁条件所期望的组合物形式而进行。
该术语进一步指适用于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体和/或表面的任何组合物。这意味着该术语包括(但不限于)去污剂组合物(例如，流体和/或固体衣物去污剂和精细纤维去污剂；硬表面清洁剂，例如用于玻璃、木质、陶瓷和金属台面以及窗的清洁剂；地毯清洁剂；烘炉清洁剂；纤维清新剂；纤维软化剂；和纺织品和衣物预洗剂，以及餐具去污剂)。
毫无疑问，如在此使用的术语“清洁组合物”包括(除非另外说明)颗粒或粉末形式的通用去污剂或重垢(heavy-duty)洗涤剂，尤其是清洁去污剂；流体剂、凝胶剂或糊剂形式的通用去污剂，尤其是所谓的重垢流体(HDL)型；流体精细纤维去污剂；手洗餐具用洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高泡型去污剂；机洗餐具用洗涤剂(machinedishwashing agent)，包括用于家庭和机构使用的多种片剂、颗粒剂、流体剂和水洗助剂形式；流体洗涤和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口剂、义齿清洁剂、汽车和地毯清洁剂、浴室洗洁剂；洗发水和染发液；洗浴凝胶和泡沫浴剂和金属清洗剂；以及清洗助剂，例如漂白添加剂和″去污棒″或预处理类型。
如在此使用的，术语“去污剂组合物”和“去污剂制剂”用于指计划用于洗涤介质的混合物，用于清洁受污染的物体。在一些优选的实施方案中，该术语用于指洗涤纤维织物和/或衣服(例如“衣物清洗剂”)。在备选的实施方案中，该术语指其他去污剂，例如用于清洁器皿、餐具等的那些(例如“餐具洗涤剂”)。无意于将本发明限于任何特殊的去污剂制剂或组合物。实际上，除了氧化酶，该术语还包括去污剂，该去污剂含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、过氧化氢酶(perhydrolase)、增量组分、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶激活剂、酶抑制剂、抗氧化剂和增溶剂。在一些优选的实施方案中，去污剂制剂包括(但不限于)可用于本发明的在美国专利申请序号10/576,331和10/581,014，以及WO 05/52161和WO 05/056782中列出的那些。然而，无意于将本发明局限于任何特殊的去污剂制剂，因为任何合适的去污剂制剂可用于本发明。
如在此使用的，“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具(包括刀叉餐具)的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒剂和流体剂形式。无意于将本发明局限于任何特殊的类型或餐具用组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料的餐具(例如器皿，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉餐具(例如用具，包括但不限于匙、刀、叉、上菜用餐具(serving utensil)等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷料、玻璃、丙烯酸树脂等。术语“餐具”在这里用于指器皿和刀叉餐具两者。
如在此使用的，酶的“洗涤性能”指酶对洗涤的贡献，其为没有加入酶至组合物中的去污剂提供了额外的清洁性能。洗涤性能是在相应的洗涤条件下比较。
术语“相应的洗涤条件”在这里用于表示在去污剂market segment中家庭中实际使用的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、sudconcentration、去污剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于指在相应的洗涤条件下，在使洗涤物品(例如织物或餐具和/或刀叉餐具)去污方面获得了更好的最终结果，或者表示相对于另一种酶，需要更少的酶(基于重量)来获得相同的最终结果。
术语“保留的洗涤性能”用于表示在相应的洗涤条件下，酶(基于重量基位)的洗涤性能是相对于另一种酶的至少80％。
酶的洗涤性能很方便地通过他们在适合的实验条件下去除某些典型污点的能力来测量。在这些测试系统中，可以控制其他的相关因素，例如去污剂组合物、sud concentration、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度而模拟某些market segment中典型的家庭应用条件。
如在此使用的，术语“消毒”指除去表面污染物，以及抑制或杀死物体表面上的微生物。无意于将本发明局限于任何特殊的表面、物品或将要除去的污染物或微生物。
反应的控制
两个氧化反应都需要氧的存在并因而只要组合物包含在密封容器中，例如控制氧气的环境(限氧环境)中，例如在隔绝或缺乏分子氧的限制条件下就不会显著程度地发生。一旦容器打开并且组合物接受大气空气或分子氧的备选来源，则该反应可以发生。
本发明因此也提供含有本发明组合物的包装产品，其中该组合物保持在控制氧的环境或限制氧的环境中，例如缺乏(可利用的)分子氧，以便防止或减少所述包装产品中过氧化氢的产生。
一种备选的方法是提供在控制水的环境中的本发明组合物，其中水的水平充分低以便防止或减少该组合物或包装产品内过氧化氢的产生。合适地，这种组合物中水的水平可以低于约2％，例如低于约1％，例如低于约0.5％，例如低于约0.2％或低于约0.1％。
备选地，可以通过本领域熟知的区室化方法将酶和底物成分彼此在物理上分开来防止该反应过早发生。在一个实施方案中，通过将第一种底物和包含第一种氧化酶和另外的氧化还原酶的组合物的隔室分开来防止该反应。第一种底物可以加入来激活组合物，或者其可以形成施用基质的部分，其作为所述施用基质的常规成分，或者在加入组合物之前、期间或以前补充给所述施用基质。因此，本发明还在部件套组中提供了含有如在此提及的第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶)和另外的氧化还原酶的第一种组合物，以及具有所述的第一种底物的另一种组合物，其中所述的第一种和第二种组合物彼此分开。
尽管设想可以将本发明的组合物作为在使用时合并的两个或多个罐系统(pot system)提供，还考虑可以采用技术例如胶囊化或微胶囊化来保持组合物的酶成分与底物分开。在使用本发明的组合物时，可以通过例如机械力或稀释触发从微胶囊释放。
在一方面，根据本发明的组合物包含含有至少两个罐的部件套组，其中第一个罐包含第一种氧化酶和另外的氧化还原酶，而第二个罐包含第一种底物。
在这里公开的应用中，例如在美容应用(以及在口腔护理应用中)中，在一个实施方案中，有利地是将本发明的组合物区室化，这样在应用时，例如通过器械擦洗使得在应用过程中(但不是在存储过程中)酶系统释放并让其原位接触第一种底物而实现过氧化氢的产生。
在本发明的一方面，组合物的pH是在5和9之间，优选在6和8之间。当根据本发明的组合物是空腔护理产品时，优选使用第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(如SOX和氧化还原酶)，其在口中常有的pH，即pH在(约)5和(约)9之间，优选在约6和约8之间，是充分有活性的。更优选地是，第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶(如山梨糖醇氧化酶和氧化还原酶)在环境温度下或在体温下是有活性的。
在一个实施方案中，可以将第一种氧化酶和/或另外的氧化还原酶以及存在的任何其他酶固定。
另外的酶和酶系统
根据本发明的组合物可以包含另外的酶，例如一种或多种选自以下的酶：过氧化物酶例如乳过氧化物酶、漆酶、淀粉葡萄糖苷酶、淀粉酶例如麦芽糖淀粉酶和非麦芽糖淀粉酶(例如NovamylTM、葡萄糖淀粉酶)、葡聚糖酶、蛋白酶、溶菌酶、变聚糖酶(mutanase)、脂酶、酰基-转移酶(例如在WO2004064537中公开的酰基转移酶)以及木聚糖酶。
在一个实施方案中，本发明的组合物，例如本发明的口腔用组合物，或如在此提及的备选组合物，包含硫氰酸盐，从而使得硫氰酸盐由于过氧化氢的产生而转化成次硫氰酸盐。对于口腔护理产品，通常口腔中的唾液中存在足够的乳过氧化物酶用以在存在过氧化氢时使硫氰酸盐转化成次硫氰酸盐。然而，根据本发明的组合物也可以包含乳过氧化物酶，以促进这种转化，从而使得在原位产生有效的抗菌剂。
应该认识到，如果氧的利用度有限，则过氧化氢的释放速率可能会变得受限。因此认为，将本发明的酶系统偶联至制氧系统可能是合适的。
应用
根据本发明的组合物可用于处理其中期望增白和/或漂白的任何类型的材料例如牙齿、纸和纺织品。
使用这种酶的组合用于漂白和/或增白的优势是，与先前在例如口腔护理产品中使用漂白剂比较，增白和/或漂白效果是通过是用非危害性材料获得的。
此外由于产生过氧化氢，根据本发明的组合物具有抗菌效果。本发明的另一方面涉及根据本发明的组合物在制造用于治疗或预防与口气恶臭或牙周炎相关的细菌影响的口腔护理产品中的用途。
本发明组合物的其他有利用途是用于食品保藏，其中该组合物用作除氧剂，每使用1摩尔的糖用2摩尔的O2。
在个人护理领域，本发明的组合物可以以有效用作抗菌剂的量添加至牙膏，尤其是牙齿增白剂、漱口剂、义齿清洗剂、液体肥皂、皮肤护理乳剂和洗剂、护发制剂和身体护理制剂以及用于清洁隐形眼镜的溶液剂中。本发明的组合物还可以是衣物清洗剂组合物或餐具洗涤剂组合物的成分，并且可用作过氧化氢来源。衣物清洗剂组合物可包含表面活性剂、所述的本发明组合物。餐具洗涤剂组合物可包含所述的本发明组合物和漂白剂前体或过酸。本发明的组合物可特别是用于除去污点。
去污剂
根据本发明的去污剂(产品)包含根据本发明的组合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了本发明组合物在去污剂产品例如清洁组合物、清洁制剂、去污剂组合物或去污剂制剂中的使用。
该去污剂(产品)可用作漂白剂或增白剂，或者可用作消毒剂，或者既用作漂白/增白剂又用作消毒剂。
去污剂(产品)可包含如在此公开的另外的酶或酶系统，特别是过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶、酰基转移酶和乳过氧化物酶(任选在存在硫氰酸盐时)。
在一个实施方案中，去污剂产品可以是清洁组合物或清洁制剂的形式。
在一个实施方案中，去污剂产品可以是去污剂组合物或去污剂制剂的形式。
去污剂产品可以是餐具洗涤组合物。
优选地，与不含本发明组合物的等价产品比较，根据本发明的去污剂产品在相应的洗涤条件下具有改善的洗涤性能。
在一些实施方案中，将含有本发明组合物的去污剂制剂和漂白强化剂用于在衣物洗涤液中产生活性氧物种来漂白污点。
在一些实施方案中，将另外含有酰基转移酶及其底物的去污剂组合物用于在衣物洗涤液中产生活性氧物种来漂白污点。
在一方面，该组合物是可食用组合物，例如口腔护理组合物、(经口施用的)药物组合物或食品或饲料组合物。
术语“可食用组合物”指用于经口施用或通过口腔消耗的组合物。
可食用组合物可以含有已经批准用于人(或动物)消费的一种或多种增香剂、防腐剂、结构组分(textural ingredient)、乳化剂、甜味剂、湿润剂和/或粘合剂。
口腔护理
在本发明的一个方面，提供了含有根据本发明的组合物和口腔护理产品中使用的组分的口腔护理产品。
在本发明的另一方面，根据本发明的口腔护理产品包含第一种酶(例如多元醇氧化酶，如山梨糖醇氧化酶)、另外的酶(例如另外的氧化还原酶)和多元醇(例如山梨糖醇)，并且提供了其中期望抗菌效果和/或增白和/或漂白效果的口腔护理产品的组分。
口腔护理产品的实例包括牙膏、牙科用乳剂、凝胶剂或牙粉、牙清洗剂、漱口剂、口腔喷雾剂、刷洗前或刷洗后清洗剂、口香糖、锭剂和糖果。
口腔护理产品可以包含另外的活性组分，例如硫氰酸盐、葡萄糖酸锌、溶菌酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和淀粉葡萄糖苷酶。另外的成分在WO97/06775中列出，并包括氧化还原介体。
在一个实施方案中，根据本发明的口腔护理组合物/产品另外含有氟化物。
牙膏和牙凝胶(tooth gel)通常包含组分例如研磨抛光材料、起泡剂、增香剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂、甜味剂、增白/漂白/去污剂、水和任选的酶。
漱口剂类(包括牙菌斑清除液)通常含有组分例如水/醇溶液、香料、湿润剂、甜味剂、起泡剂、着色剂和任选的酶。
口香糖：用于制备口香糖的合适组合物在W02005/006872和US4,564,519中公开。
当用于口腔护理产品时，第一种氧化酶(例如多元醇氧化酶，如山梨糖醇氧化酶)和另外的酶(例如另外的氧化还原酶)的量应该是安全且有效的量，这表示该量足够高以显著减轻需治疗的病状或实现期望的增白和/或漂白效果但又足够低以避免严重的副作用。
在另一方面，本发明提供了用于漂白和/或增白牙齿的方法，该方法包括用包含本发明组合物的口腔护理产品以适合用于漂白和/或增白牙齿的量和时间与牙齿接触。
本发明提供了安全的牙齿增白组合物，其通过利用可以作用于非致龋性底物(即不会降解成致龋性糖例如蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等的底物)的第一种氧化酶，例如多元醇氧化酶，如山梨糖醇氧化酶而优于当前技术。
食品和饲料
本发明的组合物可用于食品和饲料以及食品和饲料环境，例如制造、加工制备装置如挤乳装置、干酪制作装置、肉加工工厂、餐馆中蔬菜和水果的洗涤和加工设备等的普通消毒。
在肉类(即动物肉，包括鱼肉)加工工厂中，本发明的组合物可用于洗涤和消毒动物胴体和源自他们的食品。多元醇氧化酶/另外的酶系统的使用是特别优选的，因为这可减少存在于肉产品表面上的可发酵糖的水平，减少不希望的微生物的生长。根据本发明的组合物可以另外含有碱金属硅酸盐(US2004062851，特此通过参考引入本文)，这种组合物被认为是可特别用于净化肉产品。碱金属硅酸盐的使用还增加了肉和肉产品的保水性质，并且可用于增强本发明组合物在肉和肉产品中的保持力。
另一优势是由于产生了另外的酸性产物而引起的pH降低，这也抑制了肉表面内或其上微生物的产生。在蔬菜和水果的洗涤和加工设备中具有类似的优势。
本发明的组合物也可用于食品和饲料产品。过氧化氢在乳制品和蛋制品的生产中被广泛用作抗微生物剂。合适地是，根据本发明的组合物可以加入至选自下列的食品中或可以是选自下列的食品：乳制品，例如牛奶、奶油、奶酪、乳清、酸乳酪、黄油或蛋，例如蛋黄或蛋青。
由于酸性的其他产物积聚而使pH降低在其他食品类型例如奶酪的生产中也是相当有利的，其中pH的快速降低增加了奶酪，例如切达干酪和意大利硬干酪的成熟速率，减少了成熟和储存时间。因此，较低的pH也有助于增加奶酪的风味。
在一个实施方案中，将本发明的组合物用于饮料，例如果汁。果汁通常含有合适的第一种底物，因此可以不需要添加另外的第一种底物至果汁中，或者备选地，可以用这里提及的第一种底物补充它们。
此外，O2通过产生木糖而清除，这可以防止食品腐败。另外的优势是，与其中单独使用SOX的系统(其中没有观察到这种pH降低)比较，pH降低还可以防止或减少食品腐败。
个人护理产品
在身体护理领域，本发明的组合物可以以有效用作抗菌剂的量加入至不是口腔护理产品的个人护理产品中，例如义齿清洁剂、液体肥皂、皮肤护理乳剂和洗剂、护发制剂和身体护理制剂以及用于清洁隐形眼镜的溶液剂中。
纸产品
本发明的组合物也可用于清洁造纸机，产生的过氧化氢将糖类氧化成相应的酸，所述酸又认为可与无机盐例如锅垢的阳离子部分螯合。这使得能够更好地清除和/或控制沉积物，并且对于水流，它导致浊度降低、导致沉淀情况改善，以及导致颜色变浅，所有这些使得清洁和流出物控制步骤更容易和花费较少(参见WO06/061018)。
美容剂
葡萄糖氧化酶已经用作用于美容剂和化妆品的商业防腐剂系统的主要成分。然而，本发明提供了葡萄糖氧化酶的使用的合适取代物，因为它在使用时提供了更有效的系统来产生过氧化氢，和/或还可提供有效的抗-微生物/抗-菌作用。还可能提供双功能产品，是在使用过程中还漂白或增白皮肤的美容剂。
将乳过氧化物酶系统用于许多美容产品中。根据本发明的美容剂组合物或产品因而可另外含有乳过氧化物酶和硫氰酸盐。
多元醇例如山梨糖醇通常为美容剂的主要成分，或者可以加入至美容剂中以给根据本发明的组合物中的多元醇氧化酶提供合适的底物。
本发明组合物在美容产品中的使用可以提供一种或多种下列优势：美容剂的防腐剂，以及在施用于皮肤时的抗微生物/细菌活性、皮肤增亮/漂白效果。
美容剂组分包括：抗氧化剂、粘合剂、软化剂、乳化剂、湿润剂、色素、润滑剂、防腐剂、溶剂、芳香剂、表面活性剂、赋形剂，例如惰性基质、稳定剂和增稠剂。
本发明的组合物/产品可以以一种或多种选自以下的美容产品的形式使用：唇膏、润唇膏、唇笔和Lip-Ink；粉底液；粉底霜；香粉；胭脂；古铜粉；睫毛油；眼线膏和眼影膏；指甲油；遮瑕膏；皮肤护理产品例如护肤霜和润肤露，例如用于湿润脸和身体；防晒霜和防晒乳液；用于修复或遮掩皮肤瑕疵的处理产品。
美容剂还可以按照产品的形式以及施用区域描述。美容剂可以是流体或膏状乳剂、粉剂(压缩的和松散的两种)、分散剂和无水乳剂或笔剂。
根据本发明的组合物/产品还可用于美容技术，例如皮肤漂白和/或增白。
皮肤漂白
已经将对苯二酚用作皮肤漂白制剂中的成分。然而，最近美国环境保护局已经颁布了一条将要制定的拟议规章制定通知，基于对苯二酚的非处方(OTC)类皮肤漂白药物产品可能是致癌性的并且不是公认安全有效的(GRAS)并且是伪劣(misbranded)产品。
根据本发明的组合物和产品可用于制备用于皮肤漂白的基于酶的产品，并因此提供了对使用对苯二酚的安全替代方案。
皮肤漂白产品可以包含其他漂白剂，例如甘草萃取液、桑椹萃取液、熊果甙、曲酸、熊果萃取液、AHA混合物、水杨酸、aloeleicacid、柠檬酸、乳酸，以及合适的base matrixies和防晒剂。
头发漂白
对于头发颜色漂白，使用了化学氧化剂。合适的氧化剂是过硫酸盐、亚氯酸盐并且，尤其是过氧化氢或其与脲、三聚氰胺和硼酸钠的加成产物。因此，本发明的组合物也可用作用于头发漂白的过氧化氢的安全备选来源。
合适地，头发漂白组合物也可用于使角蛋白纤维着色，并因而可以包含至少一种染料前体以及本发明的组合物。本发明还涉及用于用本发明组合物使含角蛋白的纤维着色的方法。
涂料
如本发明上下文中使用的术语“涂料”在此指通过用色素性或非色素性涂层覆盖在物体或表面上，用于保护该物体或表面和/或使其增加颜色的产品系列，并且包括清漆、木材着色料、虫漆、真漆和瓷漆。涂料可涂覆于几乎任何种类的物体。涂料是一种半成品，因为最终产物是着色的物体本身。
涂料可用于其中干涂料曝露于天然水环境中的应用，例如海船涂料。将海船涂料用于防止或减少小船和轮船的船体上由生物体(例如藻类、藤壶类等)生长引起的污垢。
涂料可以是例如用于建筑和其他物体的内部或外部装饰的装饰性涂料。
涂料可以是防护漆，防止或减少该涂料涂覆于其上的表面或材料的微生物造成的腐败，例如湿腐或干腐。
根据本发明的组合物可以用作涂料中的防腐剂。备选地或者另外，该组合物可以用于用来减少污垢的涂料，例如用于海船涂料，其中过氧化氢的产生引起了氧化层，防止或减少表面上污着生物的附着或生长。这种含有根据本发明的组合物的涂料为该问题提供了有利的酶解决方案，因为产生了过氧化氢而在涂料中没有增加或显著积聚可发酵的底物，这确实可以促进抗污垢，特别是如果涂料中的酶变成失活时。
杀虫剂
杀虫剂产品通常含有不到35％的过氧化氢，其随后在作为喷雾剂或流体剂施用时通常稀释至1％或更低。将过氧化氢在收获之前和之后用于室内和室外的许多非食用作物和食用作物(例如水果、坚果和蔬菜)并用于对食品储存设备消毒。靶标有害生物通常为微生物，包括引起植物病害的真菌和细菌。用于预防和控制植物病原体的含有过氧化氢的杀虫剂通常作为喷雾剂施用于叶面上，或者作为浸液用于插条和根，或者作为种植前的土壤处理剂。
根据本发明的组合物因此可直接用作杀虫剂，使得在原位产生过氧化氢，或者用作产生过氧化氢的系统，随后可将产生的过氧化氢施用于合适表面上。
另外的实施方案：
1.含有山梨糖醇氧化酶、第一种底物和氧化还原酶的组合物，其中第一种底物可由山梨糖醇氧化酶氧化形成过氧化氢和第二种底物，并且所述的第二种底物可由氧化还原酶氧化形成过氧化氢和产物。
2.根据本发明例如实施方案1的组合物，其中所述的第一种底物是选自D-山梨糖醇、D-木糖醇、D-甘露醇、D-阿糖醇、甘油、肌醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇和1，4-丁二醇的一种或多种。
3.根据本发明例如实施方案2的组合物，其中所述的第一种底物是选自D-山梨糖醇或D-木糖醇的一种或多种。
4.根据本发明例如实施方案3的组合物，其中第一种底物是D-山梨糖醇。
5.根据本发明例如实施方案1的组合物，其中所述的氧化还原酶是选自己糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、糖氧化酶和寡糖氧化酶的一种或多种。
6.根据本发明例如实施方案5的组合物，其中所述的氧化还原酶是选自碳水化合物氧化酶、己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶的一种或多种。
7.根据本发明例如实施方案6的组合物，其中所述的氧化还原酶是己糖氧化酶。
8.根据本发明例如实施方案1的组合物，其中所述的山梨糖醇氧化酶源自链霉菌属的菌株。
9.根据本发明例如实施方案1-8任意一项的组合物，其中该组合物的pH是在5-9之间。
10.根据本发明例如实施方案1-9任意一项的组合物，其中该组合物的pH是在6-8之间。
11.根据本发明例如实施方案1-10任意一项的组合物，其中所述的山梨糖醇氧化酶和氧化还原酶在环境温度下有活性。
12.一种口腔护理产品，所述的口腔护理产品含有根据本发明例如实施方案1-11任意一项的组合物和口腔护理产品中使用的组分。
13.山梨糖醇氧化酶用于增白和/或漂白的用途。
14.根据本发明例如实施方案1-10任意一项的组合物用于增白和/或漂白的用途。
15.根据本发明例如实施方案13-14任意一项的组合物用于增白和/或漂白牙齿的用途。
16.用于漂白和/或增白牙齿的方法，该方法包括用含有根据本发明例如实施方案1-10任意一项的组合物的口腔护理产品以适合用于漂白和/或增白牙齿的量和时间接触牙齿。
17.用作药物的山梨糖醇氧化酶和D-木糖醇。
18.根据本发明例如实施方案17的药物，其中所述的山梨糖醇氧化酶源于链霉菌属的菌株。
19.一种口腔护理产品，所述的口腔护理产品含有山梨糖醇氧化酶和D-木糖醇，以及口腔护理产品使用的组分。
20.山梨糖醇氧化酶和D-木糖醇用于增白和/或漂白牙齿的用途。
实施例
提供下面的实施例以便证明和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面并且不应将其看作是限制本发明的范围。
在接下来的试验公开内容中，使用了下列缩写：℃(摄氏度)、rpm(每分钟转数)、H2O(水)、HCl(盐酸)、aa(氨基酸)、bp(碱基对)、kb(千碱基对)、kD(千道尔顿)、gm(克)、μg和ug(微克)、mg(毫克)、ng(纳克)、μl和ul(微升)、ml(毫升)、mm(毫米)、nm(纳米)、μm和um(微米)、M(摩尔)、mM(毫摩尔)、μM和uM(微摩尔)、U(单位)、V(伏特)、MW(分子量)、sec(秒)、min(s)(分钟/数分钟)、hr(s)(小时/数小时)、MgCl2(氯化镁)、NaCl(氯化钠)、OD280(光密度为280nm)、OD600(光密度为600nm)、EFT(“有效发酵时间”)、HDL(重垢去污剂流体剂)、EtOH(乙醇)、PBS(磷酸盐缓冲盐水[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])、SDS(十二烷基硫酸钠)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、TAED(N，N，N’N’-四乙酰基乙二铵)、w/v(重量比容积)、v/v(容积比容积)、GOX和GOx(葡萄糖氧化酶)、AOX和AOx(醇氧化酶)、COX和Cox(胆碱氧化酶)、HOX和HOx(己糖氧化酶)、SOX和Sox(山梨糖醇氧化酶)、AATCC(美国纺织化学家及染色家协会)、WFK(wfkTestgewebe GmbH，Bruggen-Bracht，德国)、Testfabrics(Testfabrics Inc，Pittston PA，)、ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)、Geneart(Geneart，Regesburg，德国)、Invitrogen(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)、Baker(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、NAEF(NAEF，Press and Dies公司，Bolton Landing，NY)、Fluka(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)、Prometric(PrometicBiosciences，Wayne NJ)、Minolta(Konica Minolta.Glen Cove，NY)以及Sigma(Sigma-Aldrich Chemical公司，St.Louis，MO)。
实施例1：在变青链霉菌中表达链霉菌h-7775的山梨糖醇氧化酶的菌株的构建
山梨糖醇氧化酶的蛋白质序列(SEQ ID NO：1)从公开的氨基酸序列(参见例如Hiraga等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62：4347-353[1998])获得。天蓝色链霉菌SCO6772基因的双精氨酸途径的信号序列(SEQ ID NO：3)从天蓝色链霉菌的完整基因组序列获得。
山梨糖醇氧化酶在链霉菌属中作为SCO6772蛋白的信号序列(SEQID NO：3)和山梨糖醇氧化酶(SEQ ID NO：1)的融合蛋白表达。为了克隆，在DNA的5’末端引入限制性位点NcoI，这导致在位置2加入了氨基酸甘氨酸残基(见，SEQ ID NO：4)。
为了克隆，还在DNA的3’末端引入限制性位点BamHI。优化该融合基因的密码子以在天蓝色链霉菌中表达。DNA由Geneart合成。将跨越这两个限制性位点的DNA片段(即从NcoI到BamHI(SEQ ID NO：5))克隆进链霉菌表达质粒pKB105中(参见，于2005年12月16日申请的美国专利申请序号11/303,650，通过参考将其全文合并入本文中)，所述质粒用BamHI完全切割并用NcoI部分切割。
将该表达质粒(pKB105-TAT-SOX-7775；图1)转化进变青链霉菌菌株g3s3(参见美国专利申请序号11/305,650，同上)中，并且选择3个转化株并让其在30℃下存在50ug/ml硫链丝菌素时于TS培养基中生长2-3天。然后将细胞转移至不含抗菌剂的生产培养基中并让其另外继续生长3天。然后，将1ml培养物转移至两根培养管的每根中，并在足以使细胞与上清液分离的条件下通过离心除去细胞。在酶活性测定法中检测从这两根培养管获得的上清液。从Invitrogen获得两个寡核苷酸(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)。
GCGCTAGCCGGCCCCCCGGCACAGGCCATGACCCCGGCCGAGAAGAACTGGG(SEQ ID NO：6)
CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO：7)
将该引物用于PCR中以扩增山梨糖醇氧化酶基因并用于将山梨糖醇氧化酶基因融合至celA信号序列。将含有1×缓冲液中的DNA、dNTP、引物和4％DMSO的PCR反应混合物加热达到98℃4分钟以使DNA模板变性。将II酶(Stratagene)加入至试管中并进行30次循环的PCR反应，每次循环是在98℃下30秒、62℃下30秒以及72℃下1分零8秒。让72℃下的最后延伸反应进行5分钟并将该反应物冷却至4℃。
得到的PCR片段含有celA信号序列的一部分、山梨糖醇氧化酶基因，以及含有两个限制性酶切位点的载体序列的一部分(SEQ IDNO：8)。
将该PCR片段用限制性内切酶NheI和BamHI消化以去除载体序列部分。随后将得到的片段克隆至表达载体pKB105以产生质粒“pKB105-CelA-Sox7775”(参见，图2)。让该表达质粒转化进铅青链霉菌菌株g3s3中，并且选择2株转化株并让其在30℃下存在50ug/ml硫链丝菌肽时于TS培养基中生长2-3天。然后将细胞转移至不含抗生素的生产培养基中并另外继续生长3天。然后，将1ml样品转移至两根新培养管的每根中，并如实施例2中描述地除去细胞并纯化酶。
实施例2：来自链霉菌H-7775的山梨糖醇氧化酶在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中的表达
来自链霉菌H-7775 SOX基因的山梨糖醇氧化酶基因的氨基酸序列(由Hiraga等1998.Bioscience Biotech Biochem.61：1699-1704，1998公开)从序列数据库中获得。
将编码H-7775SOX基因的合成基因(具有中性密码子)用于在大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中表达山梨糖醇氧化酶基因。将具有SOX基因的表达载体pET 24a克隆为Ndel+Bam H1片段。将得到的质粒(图5a)转化进大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，美国)中并在其中增殖。通过直接的菌落PCR方法鉴定含有1.2kb SOX基因的卡那霉素抗性转化体。培养SOX阳性转化体并分离质粒DNA。然后将含有克隆的SOX基因的质粒DNA用于转化宿主株BL21(DE3)pLysS。将整个转化反应物直接用于接种于含有25ml LB+抗生素卡那霉素(50ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的250ml烧瓶中。将培养物在37℃下摇动孵育过夜。用25ml该过夜培养物接种于含有500ml含卡那霉素(50ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的LB的2升烧瓶中，并进一步让其生长2小时以达到约OD600 0.4-0.6对数中期。将终浓度为1mM的IPTG加入至培养物中。将培养物进一步孵育另外2小时并然后通过离心收集。将得到的沉淀颗粒再悬浮于磷酸盐缓冲液中并让细胞通过弗氏细胞压碎器用于细胞破碎/溶解。分析不同的细胞溶解产物的sox活性(见下表1)并将其通过凝胶电泳(非变性&变性条件)分级。将细胞溶解产物在非变性凝胶上分级，该非变性凝胶进一步在用山梨糖醇作底物的凝胶内覆盖活性测定法(in-gel overlay activity assay)和基于PMS介导的NBT还原的测定法中检测。图5b显示存在对应对山梨糖醇有活性的黄素蛋白(SOX蛋白)的不连续的染色蛋白质条带。PMS/NBT是黄素蛋白的鉴别试剂，其中PMS＝吩嗪硫酸甲酯是一种由还原性FAD还原的氧化还原介体。图5b的泳道1中的葡萄糖过氧化酶也是一种黄素蛋白，但对山梨糖醇没有活性因此不存在染色带。P10是具有空载体pET24a(不含SOX基因)的转化株，显示不存在活性SOX蛋白条带。泳道1中不存在染色条带表明，葡萄糖氧化酶对山梨糖醇(用于覆盖测定混合物中的底物)没有活性。该测定法因此可用于确定第一种氧化酶例如本发明的多元醇氧化酶是否对第二种底物没有显著的活性。
1.测定试剂(100mM Kpi，pH 7、1％山梨糖醇、5mM ABTS、10U 7ml HRP)
2.37℃，990μl(如果为测定试剂)
3.3分钟
4.P10对照＝0.2U/mg
5.P18＝1.2U/mg
6.P6＝1.05U/mg
7.P6H＝1.49U/mg
8.P19＝0.69U/mg
9.P19H＝1.17U/mg
10.在细胞提取阶段SOX的Oda & Hiraga大肠杆菌表达＝1.1U/mg。
表1：采用(ABTS/HRP测定法)检测的6种不同大肠杆菌细胞提取物的SOX活性。P10提取物是具有本底活性(background activity)的阴性对照。
表1显示了在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中产生山梨糖醇氧化酶活性酶。阴性对照显示本底活性为0.2U/mg。酶活性通过加热(H)无细胞提取物增强(P6H & P19H)，表明热处理步骤可用于纯化SOX蛋白质。大肠杆菌表达的SOX具有与早先由Kohei Oda & Kazumi Hiraga进行的工作(Biosci Biotech Biochem 61：1699-1704，1997)类似的特异性活性。
实施例3：来自天蓝色链霉菌/变青链霉菌的推定山梨糖醇氧化酶在变青链霉菌菌株S3G3中的表达
注解为可能的木糖醇氧化酶(XOX)的天蓝色链霉菌gi|28380233|sp|Q9ZBU1|XYOA_STRCO已通过blast搜索确定为与链霉菌H-7775山梨糖醇氧化酶基因的序列同一性最接近(取决于比对，序列同一性在54-60％之间)。含天蓝色链霉菌的推定XOX基因SCO6147(开放阅读框名＝SC1A9.11c)序列的基因座从序列数据库获得，并将几种基因特异性引物&旁侧引物通过PCR分离对应的变青链霉菌基因。变青链霉菌的完整基因组序列仍然不可获得，但是其与完全测序了的天蓝色链霉菌的基因组几乎一致。最终的PCR反应物由引物us-sco15′gcccatatgagcgacatcacggtcacc(SEQ ID NO 9)和ls-sco1 5′ggatcctcagcccgcgagcacccc(SEQ ID NO 10)、作为模板的来自变青链霉菌的基因组DNA组成，合成了1.269kb的PCR片段。在该最终的PCR步骤中使用的PCR条件由下列30次循环组成：在94℃下变性55秒，在55℃下退火55秒，在68℃下延伸1-2分钟。使用的聚合酶是来自Invitrogen的Platinum Pfx DNA聚合酶加上增强剂溶液。将得到的PCR产物直接在大肠杆菌载体PCR Blunt TOPO中克隆。用与上文中相同的条件，将引物us-s1 5′gccatgggcgacatcacggtcaccaac(SEQ ID NO 11)和ls-s1 5′atggatcctcagcccgcgagcacccc(SEQ ID NO12)用于PCR反应。将1.268kb的PCR产物用Nco1-BamH1消化并将得到的片段直接克隆进Nco1+Bam H1消化的链霉菌载体pKB105中。最终的构建体是图6中命名为pSMM-SOX(变青链霉菌)的表达载体。将PCR Blunt TOPO中克隆的SOX用于检验假定的SOX基因的核苷酸序列。将5ul质粒DNA(图6)用于转化链霉菌g3s3原生质体。将转化反应物涂布于R5平板上并在32℃下孵育18小时。将含有硫链丝菌肽的软营养琼脂覆层倾倒在该平板上，将其进一步孵育3天。将单一的菌落用于接种具有20ml含硫链丝菌肽的TS-G培养基的250ml烧瓶。在30℃下摇动孵育3天后，将2ml等份试样用于接种含有生产培养基的250ml烧瓶。通过离心收集细胞沉淀颗粒，将沉淀颗粒再悬浮于缓冲液中并破碎。表2显示了存在于源自不同链霉菌转化体的无细胞提取物中的SOX活性。
  转化体  17  20  22  24  1  11.38  8.03  10.89  13.60  2  6.77  13.14  12.38  10.38  3  8.88  16.81  8.85  17.03  4  9.37  12.32  16.30  18.28  5  7.34  11.68  0.02  18.14
表2.来自20个不同链霉菌转化体的无细胞提取物的SOX活性，显示了不同量的活性。推定的SOX的活性测定法(ABTS/HRP)(U/mg)。
来自天蓝色链霉菌(SCO6147)的山梨糖醇氧化酶的DNA和蛋白质序列分别显示为SEQ ID NO：2和13。
实施例4：山梨糖醇氧化酶的纯化
在该实施例中，描述了用于纯化由变青链霉菌产生的山梨糖醇氧化酶(见，实施例1-4)的方法。来自变青链霉菌的山梨糖醇氧化酶位于菌丝体中。因而，该酶通过用弗氏细胞压碎器溶解细胞从100mM Kpi缓冲液，磷酸钾，pH 7.0中的细胞提取物分离。将细胞提取物加热至50℃1小时，之后进行足以除去细胞碎片的离心。然后将细胞溶解产物上清液与硫酸铵混合达到32％的饱和以便沉淀出含有山梨糖醇氧化酶的蛋白质级分。将该蛋白质沉淀物保持在4℃下过夜并然后用Sorvall离心机和SLA-1500Sorvall转子通过离心(10,000RPM)与母液分离。
随后将蛋白质沉淀物用32％的饱和硫酸铵溶液洗涤。将洗涤过的蛋白质沉淀物重新溶解于Kpi缓冲液中并弃去不溶解物质。可溶性级分相对25mM Kpi缓冲液，pH 7.0透析并过夜，并然后将其在反应性橙树脂(reactive orange resin)(Prometic)上用亲和色谱法进一步纯化。将这种部分纯化的山梨糖醇氧化酶制品和发酵肉汤细胞溶解产物(108小时的EFT)在用于生物漂白试验中用作样品。该酶的分子量通过SDS-PAGE凝胶电泳测定为～45,000Da。辅基是共价结合的FAD(1mol FAD对1mol SOX)。
实施例5：SOX在HDL衣物洗涤条件中的稳定性和漂白性能
在这个实施例中，描述了测定SOX在AATCC流体去污剂衣物洗涤条件中的稳定性和漂白性能。在这些试验中，使用AATCC标准去污剂(美国纺织化学家及染色家协会重垢流体去污剂2003版，不含光亮剂；主要组分包括直链烷基磺酸盐、醇乙氧基化合物、丙二醇、柠檬酸、脂肪酸、氢氧化钠和水；测试织物)。
使用沾有果汁(STC CFT CS-15)、酒(STC CFT CS-3)和茶(STCCFT BC-3)的三种可漂白绵质布样。将布样用纺织品冲压机(安装有5/8”冲压裁剪机的B型、93046型、NAEF)剪成15mm的圆片。
将单个布样圆片放入24孔微孔板(Costar 3526)的每个孔中。将每升含有1.5ml AATCC HDL去污剂、75-100mM山梨糖醇，6 gpg硬度(稀释自含有1.735M氯化钙和0.67M氯化镁的硬度为15000gpg的母液)和0.05％TAED(四乙酰基乙二铵，Fluka)的1ml洗涤液(pH8)加入至每个孔中。将5至50微升(5-50ul)如实施例1和2中描述产生的部分纯化的山梨糖醇氧化酶或从后面的发酵操作(108hr EFT“有效发酵时间”)获得的山梨糖醇氧化酶用容积式吸液管(positivedisplacement pipette)加入至一个柱中的3-8个孔中。加入0.5、5、50、500、1000和1500U的已糖氧化酶或葡萄糖氧化酶。对照孔不含酶。将微量培养板用塑料盖和铝箔盖上，并在37℃下伴随100rpm的轻微旋转孵育14小时。然后将平板从振荡器中移出并用过氧化物测试条(Baker)检测过氧化氢的存在。
将100微升(100ul)的0.1mM碳酸钠加入至每个孔中以使pH增加至10。将微量培养板旋转培养另外90分钟并通过抽吸移出上清液。将每个孔用1.5ml Dulbecco’s PBS，pH 7.3洗涤三(3)次并用1.5ml蒸馏水洗涤三(3)次。将每个圆片从其孔中移出并在纸张之间干燥过夜并且不暴露于直射光下。肉眼观察所述的圆片并然后用在标准白瓷砖上校准了的反射计CR-200(Minolta)分析。平均L值计算出为去污百分比(％SR＝100％X(最终反射比-最初反射比)/(白标准物的反射比-最初反射比))。
初步结果证实，山梨糖醇氧化酶/己糖氧化酶组合物在典型的流体去污剂系统中是稳定的，并且在存在它的与去污剂混合的底物山梨糖醇和可利用的大气氧时，能够产生有效浓度的过氧化氢。此外，产生过氧化氢的该组合物在存在漂白强化剂(即TAED)时能够有助于漂白典型的有色污点例如蓝莓汁、茶和酒。
实施例6：山梨糖醇氧化酶的底物范围研究
试验用实施例3-4中描述的方法获得的山梨糖醇氧化酶以发现它对多种多元醇底物的活性。该测定法中使用的所有底物都在25℃下100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中为55mM。相对活性在下面的表1中显示，山梨糖醇作为(++++++＝100％)。除了这些底物，还考虑其他底物(包括但不限于甘油)将可用于本发明。
  化合物  相对活性(+，0)  D-山梨糖醇  ++++++  D-木糖醇  ++++  D-甘露醇  +++  D-核糖醇  +  肌醇  +  甘油  +  1，3-丙二醇  +/2  1，2-丙二醇  +/2  丙二醇  0  乙二醇  0
实施例7：SOX、HOX和GOX活性的测定
葡萄糖氧化酶具有氧化葡萄糖以产生过氧化氢的能力。实例是碳水化合物氧化酶、葡聚寡糖氧化酶和葡萄糖氧化酶。尽管己糖氧化酶通常具有更广的特异性，对其他己糖以及二糖例如麦芽糖具有显著活性，其也可以归为葡萄糖氧化酶。
单位定义
1多元醇氧化酶(POX)单位相当于在特定条件下导致每分钟转化1μmol的特定多元醇，结果产生1μmol的过氧化氢(H2O2)的酶的量。
1山梨糖醇氧化酶(SOX)单位相当于在特定条件下导致每分钟转化1μmol的山梨糖醇，结果产生1μmol的过氧化氢(H2O2)的酶的量。
定义：1己糖类氧化酶(HOX)单位相当于特定条件下导致每分钟转化1μmol的葡萄糖或备选的己糖，结果产生1μmol的过氧化氢(H2O2)的酶的量。
定义：1葡萄糖氧化酶(gluOX)单位相当于在特定条件下导致每分钟转化1μmol的葡萄糖，结果产生1μmol的过氧化氢(H2O2)的酶的量。
微量滴定板(300μl)中SOX、HOX或GOX活性的测定
将通常使用的辣根过氧化物酶染料底物ABTS掺入进测定物中，测量分别由HOX或GOX产生的H2O2的产量。ABTS用作过氧化物酶的显色底物。过氧化物酶与H2O2组合促进了电子从显色染料转移，显色染料氧化成了强烈的绿色/蓝色化合物。
体外测定
测定混合物含有266μl山梨糖醇(Sigma P-5504，0.055M于0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.3中)，(或备选的底物，例如木糖醇)、12μl2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(Sigma A-9941，5mg/ml含水溶液)、12μl过氧化物酶(POD)(Sigma P-6782，0.1mg/ml于0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.3中)和10μl酶(SOX或HOX)含水溶液。
该测定在25℃下进行。
加入葡萄糖起始孵育。在ELISA酶标仪中在405nm下监控吸光度。将基于不同浓度的H2O2的标准曲线用于计算根据上面定义的酶活性。
用山梨糖醇举例说明，反应可以以下列方式描述：
山梨糖醇+O2+→葡萄糖+H2O2(1)
葡萄糖+O2+H2O→葡萄糖酸+H2O2(2)
H2O2+2ABTS(无色)+2H+→2H2O+2ABTS(蓝色/绿色)
(3)
反应(1)由酶(SOX)催化
反应(2)由酶(HOX或GOX)催化
反应(3)由酶(POD)催化
关于反应(2)，GOOX和MnCO也是能够催化该反应的酶。
对于‘原位’测定，可能需要在进行该检测之前稀释基质，这样与测定组成分非特异性反应的干扰物质的影响变得足够小而忽略不计。备选地，可以制备不含干扰物质的基质组合物。
实施例8：对木糖醇和山梨糖醇的相对活性
目的是为了测量山梨糖醇氧化酶对D-山梨糖醇和D-木糖醇的活性的不同。如先前描述的将ABTS测定法用于测量在D-山梨糖醇和D-木糖醇都过量时的H2O2产生速率。将相同量的如在前面的实施例中制备的酶用于这两种情形中。下表显示了对这两种底物的相对活性(以百分比值给出)。使用的酶如实施例3&4中制备。
  底物  相对活性％  D-山梨糖醇  100  D-木糖醇  47.6
实施例9.两种酶之间的增效作用
在该实施例中使用的三种酶是：
1.己糖类氧化酶：HoxypureTM，可从Danisco A/S获得。
2.天蓝色链霉菌(SCO6147)山梨糖醇氧化酶如前面的实施例3-4中描述的获得。
3.葡萄糖氧化酶：Sigma G7141
在下面的实施例中，酶的量以单位量给出。
1单位的HOX是在底物过量时每分钟产生1umol H2O2的酶的量。
1单位的GOX是在底物过量时每分钟产生1umol H2O2的酶的量。
1单位的SOX是在底物过量时每分钟产生1umol H2O2的酶的量。
注意.在下面的实施例中，只有SOX将具有过量的底物。产生的糖将是第二种酶的限制因素。如上面说明的，在D-山梨糖醇和氧都过量时，活性作为催化D-山梨糖醇的SOX的百分比值给出。
初速率是在300uL ABTS测定法(如先前描述的)中在5分钟内测量。从标准曲线推断过氧化氢产物的产生速率。测量的活性(在图3和图4中显示)作为百分比值给出。100％定义为在底物D-山梨糖醇和氧过量时由单独的山梨糖醇氧化酶产生的过氧化氢的速率(线性的速率曲线)。
实施例10：咀嚼片剂
酶组合物通过在每微升的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.7)、50mM山梨糖醇中加入1单位的SOX(如实施例1-4中制备)，并且加入0.5、5、50、500、1000和1500U的己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶而制备。将含水的酶组合物用于制备咀嚼片剂。含有酶组合物的片剂和口香糖组合物用如下面列出的常规的主要组分(组分以wt％列出)制备。
含有酶组合物的片剂和口香糖组合物用如下面列出的常规的主要成分(成分以wt％列出)制备。
酶组合物                          0.5％(作为水组分的部分提供)
Lycasin 75％                      48.9％
异麦芽酮糖醇或木糖醇              23.1％
氢化植物油                        8.7％
水                                4.8％
明胶(40％的溶液)                  2.9％
淀粉涂覆的磷酸氢钙                8.7％
甘油一酸酯-甘油二酸酯混合物       0.8％
卵磷脂                            0.3％
阿斯巴甜                          0.05％
阿斯巴甜K                         0.05％
香草醛                            0.05％
甘油                              0.1％
碳酸氢钠                          0.10％
薄荷香料                          0.19％
咀嚼片剂通过将异麦芽酮糖醇、Lycasin、水、脂肪、甘油一酯和甘油二酯混合物、甘油和卵磷脂煮沸至131℃，随后加入甘油并将该混合物冷却至30℃(HOX)或60℃(GOX)而制备。其后，加入碳酸氢钠、酶组合物、磷酸氢钙和剩下的组分。随后，将冷却至室温(23℃)混合物研磨成粉并用压片机压缩成片剂。
体内菌斑减少效率在由人自愿者咀嚼2小时和5小时后，在羟基磷灰石盘上利用口内固位体中体内生长的菌斑试验了该咀嚼片剂的菌斑减少效率。将共焦显微镜用于观察和定量菌斑覆盖度和菌斑超微结构。菌斑的除去也通过常规的光学显微术测量，该方法是通过在处理之前或之后用结晶紫指示剂染色并测量颜色强度的改变来进行。Image Pro Analysis So aware用于进行图像分析和定量测量。测量了颜色强度并用于测定污点的除去。强度越大，清洁效率就越高。
实施例11：香糖
可以合并下列组分来制备含有本发明的组合物的口香糖：
香糖胶基          31.20％
山梨糖醇          28.08％
木糖醇            5.23％
酶组合物1.00％(参见前面的实施例)
乙酰磺胺酸钾      0.16％
阿斯巴甜          0.16％
薄荷醇粉          1.00％
液体香料          0.47％
异麦芽酮糖醇PF    11.70％
异麦芽酮糖醇DC    16.00％
消结块剂*         4.00％
香料              2.00％
*硬脂酸镁、滑石、硅胶。
实施例12：水基涂料
可以合并下列组分来制备含有本发明的组合物的水基涂料：
酶组合物          0.5％
山梨糖醇          0.5％
色素              15％
丙烯酸粘合剂      25％
水                50％
其它添加剂*       9.5％
*取决于涂料类型可以包括以下物质：弥散剂、悬浮剂、分散剂、消泡剂、湿润剂、成膜助剂、多种充填剂、表面活性剂、辅生物杀灭剂(co-biocide)、增稠剂、辅防腐剂(co-preservative)、乳胶。
实施例13：油基漆
可以合并下列组分来制备含有本发明的组合物的油基涂料：
酶组合物               0.5％，溶解于80％的山梨糖醇中
TiO2色素               20％
醇酸粘合剂             40％
烃溶剂                 20％
其它添加剂*            19.5％
*取决于涂料类型可以包括以下物质：弥散剂、悬浮剂、分散剂、消泡剂、湿润剂、成膜助剂、多种充填剂、表面活性剂、辅生物杀灭剂(co-biocide)、增稠剂、辅防腐剂(co-preservative)、乳胶。
序列表
<110>Dansico A/S
<120>含有偶联的酶系统的组合物
<130>16318PCT00
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>420
<212>PRT
<213>链霉菌H7775(Streptomyces sp.H7775)
<400>1
Met Thr Pro Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Phe Gly Ala
1               5                   10                  15
Lys Arg Leu Cys Val Pro Arg Ser Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val
            20                  25                  30
Ala Ala Ser Gly Ala Val Arg Pro Leu Gly Thr Arg His Ser Phe Asn
        35                  40                  45
Thr Val Ala Asp Thr Ser Gly Asp His Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro
    50                  55                  60
Arg Val Val Asp Ile Asp Val Pro Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Ala
65                  70                  75                  80
Gly Leu Arg Phe Gly Glu Phe Ala Ala Glu Leu His Ala Arg Gly Leu
                85                  90                  95
Ala Leu Ala Asn Leu Gly Ser Leu Pro His Ile Ser Val Ala Gly Ala
            100                 105                 110
Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Arg Ser Leu Ala
        115                 120                 125
Gly Ala Val Arg Ala Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Thr Leu Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Ala Gly Ala Val Val Ser Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Glu Leu Asp Leu Val Pro Ala
                165                 170                 175
Phe Glu Val Arg Gln Trp Val Tyr Glu Asp Leu Pro Glu Ala Thr Leu
            180                 185                 190
Ala Ala Arg Phe Asp Glu Val Met Ser Ala Ala Tyr Ser Val Ser Val
        195                 200                 205
Phe Thr Asp Trp Arg Pro Gly Pro Val Gly Gln Val Trp Leu Lys Gln
    210                 215                 220
Arg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu
225                 230                 235                 240
Gly Ala Arg Leu Ala Asp Gly Pro Arg His Pro Val Pro Gly Met Pro
                245                 250                 255
Ala Gly Asn Cys Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu
            260                 265                 270
Arg Leu Pro His Phe Arg Met Glu Phe Thr Pro Ser Asn Gly Asp Glu
        275                 280                 285
Leu Gln Ser Glu Tyr Phe Val Ala Arg Ala Asp Ala Val Ala Ala Tyr
    290                 295                 300
Glu Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Arg Ile Ala Pro Val Leu Gln Val
305                 310                 315                 320
Ser Glu Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Asp Leu Trp Leu Ser Pro Ala
                325                 330                 335
His Gly Arg Asp Ser Val Ala Phe His Phe Thr Trp Val Pro Asp Ala
            340                 345                 350
Ala Ala Val Ala Pro Val Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Leu Ala Pro
        355                 360                 365
Phe Gly Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Ser Thr Ala Pro Glu
    370                 375                 380
Val Leu Arg Thr Leu Tyr Pro Arg Tyr Ala Asp Phe Glu Glu Leu Val
385                 390                 395                 400
Gly Arg His Asp Pro Glu Gly Thr Phe Arg Asn Ala Phe Leu Asp Arg
                405                 410                 415
Tyr Phe Arg Arg
            420
<210>2
<211>418
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>2
Met Gly Asp Ile Thr Val Thr Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ala Lys Glu Leu Leu Arg Pro His Ser Leu Asp Ala Leu Arg Ala Leu
            20                  25                  30
Val Ala Asp Ser Ala Arg Val Arg Val Leu Gly Ser Gly His Ser Phe
        35                  40                  45
Asn Glu Ile Ala Glu Pro Gly Asp Gly Gly Val Leu Leu Ser Leu Ala
    50                  55                  60
Gly Leu Pro Ser Val Val Asp Val Asp Thr Ala Ala Arg Thr Val Arg
65                  70                  75                  80
Val Gly Gly Gly Val Arg Tyr Ala Glu Leu Ala Arg Val Val His Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Ala Leu Pro Asn Met Ala Ser Leu Pro His Ile Ser Val
            100                 105                 110
Ala Gly Ser Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Gly
        115                 120                 125
Ser Leu Ala Ser Val Val Arg Glu Val Glu Leu Val Thr Ala Asp Gly
    130                 135                 140
Ser Thr Val Val Ile Ala Arg Gly Asp Glu Arg Phe Gly Gly Ala Val
145                 150                 155                 160
Thr Ser Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Thr Leu Asp Leu
                165                 170                 175
Glu Pro Ala Tyr Glu Met Glu Gln His Val Phe Thr Glu Leu Pro Leu
            180                 185                 190
Ala Gly Leu Asp Pro Ala Thr Phe Glu Thr Val Met Ala Ala Ala Tyr
        195                 200                 205
Ser Val Ser Leu Phe Thr Asp Trp Arg Ala Pro Gly Phe Arg Gln Val
    210                 215                 220
Trp Leu Lys Arg Arg Thr Asp Arg Pro Leu Asp Gly Phe Pro Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Ala Pro Ala Ala Glu Lys Met His Pro Val Pro Gly Met Pro Ala Val
                245                 250                 255
Asn Cys Thr Glu Gln Phe Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu Arg Leu
            260                 265                 270
Pro His Phe Arg Ala Glu Phe Thr Pro Ser Ser Gly Ala Glu Leu Gln
        275                 280                 285
Ser Glu Tyr Leu Met Pro Arg Glu His Ala Leu Ala Ala Leu His Ala
    290                 295                 300
Met Asp Ala Ile Arg Glu Thr Leu Ala Pro Val Leu Gln Thr Cys Glu
305                 310                 315                 320
Ile Arg Thr Val Ala Ala Asp Ala Gln Trp Leu Ser Pro Ala Tyr Gly
                325                 330                 335
Arg Asp Thr Val Ala Ala His Phe Thr Trp Val Glu Asp Thr Ala Ala
            340                 345                 350
Val Leu Pro Val Val Arg Arg Leu Glu Glu Ala Leu Val Pro Phe Ala
        355                 360                 365
Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Thr Val Pro Ala Gly Glu Leu
    370                 375                 380
Arg Ala Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Asp Phe Gly Ala Leu Ala Gly Ala
385                 390                 395                 400
Leu Asp Pro Ala Gly Lys Phe Thr Asn Ala Phe Val Arg Gly Val Leu
                405                 410                 415
Ala Gly
<210>3
<211>47
<212>PRT
<213>天蓝色链霉菌
<400>3
Met Thr Glu Val Ser Arg Arg Lys Leu Met Lys Gly Ala Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Gly Ala Leu Ala Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Ala Thr Ala
            20                  25                  30
Ala Pro Ala Ala Gly Pro Glu Asp Leu Pro Gly Pro Ala Ala Ala
        35                  40                  45
<210>4
<211>468
<212>PRT
<213>链霉菌H7775
<400>4
Met Gly Thr Glu Val Ser Arg Arg Lys Leu Met Lys Gly Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Ser Gly Gly Ala Leu Ala Leu Pro Ala Leu Gly Ala Pro Pro Ala Thr
            20                  25                  30
Ala Ala Pro Ala Ala Gly Pro Glu Asp Leu Pro Gly Pro Ala Ala Ala
        35                  40                  45
Met Thr Pro Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Phe Gly Ala
    50                  55                  60
Lys Arg Leu Cys Val Pro Arg Ser Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ser Gly Ala Val Arg Pro Leu Gly Thr Arg His Ser Phe Asn
                85                  90                  95
Thr Val Ala Asp Thr Ser Gly Asp His Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro
            100                 105                 110
Arg Val Val Asp Ile Asp Val Pro Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Ala
        115                 120                 125
Gly Leu Arg Phe Gly Glu Phe Ala Ala Glu Leu His Ala Arg Gly Leu
    130                 135                 140
Ala Leu Ala Asn Leu Gly Ser Leu Pro His Ile Ser Val Ala Gly Ala
145                 150                 155                 160
Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Arg Ser Leu Ala
                165                 170                 175
Gly Ala Val Arg Ala Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Arg
            180                 185                 190
Thr Leu Arg Arg Thr Asp Glu Asp Phe Ala Gly Ala Val Val Ser Leu
        195                 200                 205
Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Glu Leu Asp Leu Val Pro Ala
    210                 215                 220
Phe Glu Val Arg Gln Trp Val Tyr Glu Asp Leu Pro Glu Ala Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ala Ala Arg Phe Asp Glu Val Met Ser Ala Ala Tyr Ser Val Ser Val
                245                 250                 255
Phe Thr Asp Trp Arg Pro Gly Pro Val Gly Gln Val Trp Leu Lys Gln
            260                 265                 270
Arg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu
    275                 280                 285
Gly Ala Arg Leu Ala Asp Gly Pro Arg His Pro Val Pro Gly Met Pro
    290                 295                 300
Ala Gly Asn Cys Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu
305                 310                 315                 320
Arg Leu Pro His Phe Arg Met Glu Phe Thr Pro Ser Asn Gly Asp Glu
                325                 330                 335
Leu Gln Ser Glu Tyr Phe Val Ala Arg Ala Asp Ala Val Ala Ala Tyr
            340                 345                 350
Glu Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Arg Ile Ala Pro Val Leu Gln Val
        355                 360                 365
Ser Glu Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Asp Leu Trp Leu Ser Pro Ala
    370                 375                 380
His Gly Arg Asp Ser Val Ala Phe His Phe Thr Trp Val Pro Asp Ala
385                 390                 395                 400
Ala Ala Val Ala Pro Val Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Leu Ala Pro
                405                 410                 415
Phe Gly Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Ser Thr Ala Pro Glu
            420                 425                 430
Val Leu Arg Thr Leu Tyr Pro Arg Tyr Ala Asp Phe Glu Glu Leu Val
        435                 440                 445
Gly Arg His Asp Pro Glu Gly Thr Phe Arg Asn Ala Phe Leu Asp Arg
    450                 455                 460
Tyr Phe Arg Arg
465
<210>5
<211>1415
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>信号序列和SEQ ID No 1间的融合物核苷酸序列
<400>5
ccatgggcac cgaggtctcc cgccgcaagc tgatgaaggg cgcggcggtg tcgggcggcg      60
cgctggcgct gccggccctc ggcgccccgc ccgccaccgc ggcgccggcc gccggccccg     120
aggacctccc gggccccgcc gccgccatga ccccggccga gaagaactgg gccggcaaca     180
tcaccttcgg cgccaagcgc ctgtgcgtcc cgcgctccgt ccgcgagctg cgcgagaccg     240
tggccgcctc cggcgccgtg cgcccgctgg gcacccgcca ctcgttcaac accgtcgccg     300
acacctccgg cgaccacgtg tcgctggccg gcctgccgcg cgtcgtcgac atcgacgtcc     360
cgggccgggc cgtgtccctg tccgccggcc tgcgcttcgg cgagttcgcc gccgagctgc     420
acgcccgcgg cctggccctg gccaacctgg gctccctgcc gcacatctcc gtggcgggcg     480
cggtcgccac cggcacccac ggctccggcg tcggcaaccg ctccctggcg ggcgccgtcc     540
gcgccctgtc cctggtcacc gccgacggcg agacccgcac cctgcgccgc accgacgagg     600
acttcgccgg cgccgtcgtg tccctgggcg ccctgggcgt cgtcacctcc ctggagctgg     660
acctggtccc ggccttcgag gtccgccagt  gggtctacga ggacctgccc gaggccaccc    720
tggccgcccg cttcgacgag gtcatgtccg ccgcctactc cgtgtccgtg ttcaccgact     780
ggcgcccggg cccggtcggc caggtctggc tgaagcagcg cgtcggcgac gagggcgccc     840
gctccgtcat gccggccgag tggctgggcg cccgcctggc cgacggcccg cgccacccgg     900
tccccggcat gcccgccggc aactgcaccg cccagcaggg cgtcccgggc ccgtggcacg     960
agcgcctgcc gcacttccgc atggagttca ccccgtccaa cggcgacgag ctgcagtccg    1020
agtacttcgt cgcccgcgcg gacgccgtcg cggcctacga ggcgctggcc cgcctgcgcg    1080
accgcatcgc cccggtcctg caggtctccg agctgcgcac cgtcgccgcc gacgacctgt    1140
ggctgtcccc ggcccacggc cgcgactccg tcgccttcca cttcacctgg gtcccggacg    1200
ccgccgccgt cgccccggtc gccggcgcca tcgaggaggc cctggccccg ttcggcgccc    1260
gcccgcactg gggcaaggtg ttctccaccg cccccgaggt cctgcgcacc ctgtacccgc    1320
gctacgccga cttcgaggag ctggtcggcc gccacgaccc cgagggcacc ttccgcaacg  1380
ccttcctcga ccgctacttc cgccgctgag gatcc                             1415
<210>6
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>6
gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg gg           52
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>7
caggaaacag ctatgac                                                  17
<210>8
<211>1370
<212>DNA
<213>编码带有导入的RE位点的信号序列和SEQ ID No 1间的融合物的核苷酸序列
<400>8
gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg ggccggcaac     60
atcaccttcg gcgccaagcg cctgtgcgtc ccgcgctccg tccgcgagct gcgcgagacc    120
gtggccgcct ccggcgccgt gcgcccgctg ggcacccgcc actcgttcaa caccgtcgcc    180
gacacctccg gcgaccacgt gtcgctggcc ggcctgccgc gcgtcgtcga catcgacgtc    240
ccgggccggg ccgtgtccct gtccgccggc ctgcgcttcg gcgagttcgc cgccgagctg   300
cacgcccgcg gcctggccct ggccaacctg ggctccctgc cgcacatctc cgtggcgggc   360
gcggtcgcca ccggcaccca cggctccggc gtcggcaacc gctccctggc gggcgccgtc   420
cgcgccctgt ccctggtcac cgccgacggc gagacccgca ccctgcgccg caccgacgag   480
gacttcgccg gcgccgtcgt gtccctgggc gccctgggcg tcgtcacctc cctggagctg   540
gacctggtcc cggccttcga ggtccgccag tgggtctacg aggacctgcc cgaggccacc   600
ctggccgccc gcttcgacga ggtcatgtcc gccgcctact ccgtgtccgt gttcaccgac   660
tggcgcccgg gcccggtcgg ccaggtctgg ctgaagcagc gcgtcggcga cgagggcgcc   720
cgctccgtca tgccggccga gtggctgggc gcccgcctgg ccgacggccc gcgccacccg   780
gtccccggca tgcccgccgg caactgcacc gcccagcagg gcgtcccggg cccgtggcac   840
gagcgcctgc cgcacttccg catggagttc accccgtcca acggcgacga gctgcagtcc   900
gagtacttcg tcgcccgcgc ggacgccgtc gcggcctacg aggcgctggc ccgcctgcgc   960
gaccgcatcg ccccggtcct gcaggtctcc gagctgcgca ccgtcgccgc cgacgacctg  1020
tggctgtccc cggcccacgg ccgcgactcc gtcgccttcc acttcacctg ggtcccggac  1080
gccgccgccg tcgccccggt cgccggcgcc atcgaggagg ccctggcccc gttcggcgcc  1140
cgcccgcact ggggcaaggt gttctccacc gcccccgagg tcctgcgcac cctgtacccg  1200
cgctacgccg acttcgagga gctggtcggc cgccacgacc ccgagggcac cttccgcaac  1260
gccttcctcg accgctactt ccgccgctga ggatccgagc tccagctttt gttcccttta  1320
gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg             1370
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>9
gcccatatga gcgacatcac ggtcacc            27
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>10
ggatcctcag cccgcgagca cccc               24
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>11
gccatgggcg acatcacggt caccaac            27
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
atggatcctc agcccgcgag cacccc             26
<210>13
<211>1268
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>在起始甲硫氨酸处加入NcoI克隆位点的变青链霉菌(Streptomyces lividans)和天
蓝色链霉菌SOX
<400>13
gccatgggcg acatcacggt caccaactgg gccggcaaca tcacgtacac ggcgaaggaa    60
ctgctgcggc cgcactccct ggacgcgctg cgggccctgg tggcggacag cgccagggtg   120
cgggtgctgg gcagcgggca ctccttcaac gagatcgccg agccgggcga cgggggtgtc   180
ctgctgtcgc tggcgggcct gccgtccgtg gtggacgtgg acacggcggc ccgtacggtg   240
cgggtcggcg gcggtgtgcg gtacgcggag ctggcccggg tggtgcacgc gcggggcctg   300
gcgctgccga acatggcctc gctgccgcac atctcggtcg ccgggtcggt ggccaccggc   360
acccacggtt cgggggtggg caacggttcg ctggcctcgg tggtgcgcga ggtggagctg   420
gtcaccgcgg acggttcgac cgtggtgatc gcgcggggcg acgagcggtt cggcggggcg   480
gtgacctcgc tcggcgcgct gggcgtggtg acgtcgctca cactcgacct ggagccggcg   540
tacgagatgg aacagcacgt cttcaccgag ctgccgctgg ccgggttgga cccggcgacg   600
ttcgagacgg tgatggcggc ggcgtacagc gtgagtctgt tcaccgactg gcgggcgccc   660
ggtttccggc aggtgtggct gaagcggcgc accgaccggc cgctggacgg tttcccgtac   720
gcggccccgg ccgccgagaa gatgcatccg gtgccgggca tgcccgcggt gaactgcacg   780
gagcagttcg gggtgccggg gccctggcac gagcggctgc cgcacttccg cgcggagttc   840
acgcccagca gcggtgccga gttgcagtcg gagtacctga tgccccggga gcacgccctg   900
gccgccctgc acgcgatgga cgcgatacgg gagacgctcg cgccggtgct ccagacctgc   960
gagatccgca cggtcgccgc cgacgcgcag tggctgagcc cggcgtacgg gcgggacacc  1020
gtggccgcgc acttcacctg ggtcgaggac acggcggcgg tgctgccggt ggtgcggcgg  1080
ctggaggagg cgctcgtccc cttcgcggcc cgtccgcact gggggaaggt gttcaccgtc    1140
ccggcgggcg agctgcgtgc gctgtacccg cggctggccg acttcggggc gctggccggg    1200
gcgctggacc cggcggggaa gttcaccaac gcgttcgtgc gcggggtgct cgcgggctga    1260
ggatccat                                                             1268