用于对多发性硬化症患者的样品进行分类的工具和方法 干扰素(IFN)是由免疫系统响应于外来试剂例如病毒、细菌、寄生虫和肿瘤细胞的攻击而产生的天然蛋白质。当今，干扰素被批准用于治疗恶性肿瘤例如多毛细胞白血病，恶性黑素瘤，和与AIDS相关的卡波西肉瘤；慢性乙型和丙型肝炎；多发性硬化症；尖锐湿疣，由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的生殖器和肛周疣；慢性肉芽肿病；肾细胞癌(RRC)；和严重的恶性骨硬化病。临床试验正在进行或者已完成，以显示对于其他恶性肿瘤、由病毒介导的疾病和自身免疫相关疾病(例如类风湿性关节炎)来说包含干扰素的治疗的临床益处。
多发性硬化症(MS)是特征在于进行性神经功能障碍的中枢神经系统的常见炎性疾病。该疾病具有异质性质，这反映在从轻微到严重的脱髓鞘性疾病的临床表现中。目前还没有可用的治愈性疗法，并且大多数患病个体最终残疾(1)。
IFN是在复发性弛张性MS(RRMS)中显示出临床功效的第一试剂。干扰素β(IFNβ)减少临床复发，降低脑疾病活动性，和可能延缓残疾的进展。然而，疗法与许多不利反应相联系，包括流感样症状和短暂的实验室异常。此外，对IFNβ的应答是部分的，即疾病活动性仅被抑制了大约三分之一(2)。临床经验暗示，存在有IFN“应答者”以及“无应答者”(3；4)。在预测性的生物标志物不存在的情况下，就有这样的问题，即谁将对疗法作出应答，以及当不便和成本具有重要意义时治疗谁。
对IFNβ的无应答性的一部分可以通过免疫原性来解释。响应于IFN治疗而形成的抗体已被表征为结合抗体或中和抗体。然而，因为并非所有患者形成中和抗体(Nab)，并且如果被诱导，Nab随着时间过去而出现(5-8)，所以可能牵涉其他机制来解释无应答性。
在正常生理学中，IFN通过下列方式来产生其生物学效应：与细胞表面上的多亚基受体IFNAR-1和-2结合，从而起始在两个分歧途径中出现的细胞内第二信使的复杂级联。一个途径导致转录因子ISGF3(IFN-刺激的基因因子(IFN-stimulated gene factor)3)的激活，所述ISGF3是磷酸化的信号转导及转录激活蛋白(Signal Transducer andActivator of Transcription，STAT)2与STAT1和IFN调节因子9(IFNregulatory factor 9，IRF-9；p48)的复合物，其与在多个基因中存在的IFN-刺激的应答元件(IFN-stimulated response element，ISRE)结合(9；10)。另一个途径牵涉STAT2/1和STAT2/3异二聚体以及STAT1同二聚体(IFNα-激活的因子(IFNalpha-activated factor)，AAF)，其与IFNγ-激活的序列(IFN gamma-activated sequence，GAS)应答元件结合(10-13)。最终，由IFN诱导的ISRE和GAS增强子元件的激活开启了广泛多样的基因(14)，从而导致特定的转录变化。
存在有对于开发出这样的生物标志物的明确需要，所述生物标志物允许根据对I型干扰素作出应答的可能性来对细胞进行分类。
本发明提供了用于对来自人个体的细胞进行分类的方法，所述方法包括提供包含来自所述个体的细胞的样品，所述细胞通常对暴露于I型干扰素作出响应；测定由1型干扰素调节的途径的活性水平；和基于所测定的活性水平来对所述细胞进行分类。优选的是，所述途径包括激活途径，由此所述激活途径包括基因的转录激活。本发明的重要应用是确定用I型干扰素治疗所述个体是否可能是成功的。具有被分类为不良的应答者的细胞的个体可能不会良好地对用I型干扰素进行的治疗作出应答。
优选的根据本发明的方法进一步包括在测定所述途径的活性水平之前，在I型干扰素存在下培养所述细胞。
在一个优选地实施方案中，所述个体患有自身免疫疾病或者处于患自身免疫疾病的危险中。术语“自身免疫疾病”是指这样的疾病，所述疾病的特征在于针对一般存在于体内的抗原或者模拟了一般存在于体内的物质的抗原的免疫应答。典型的自身免疫疾病包括多发性硬化症(MS)、克罗恩病和类风湿性关节炎。
用干扰素进行治疗并且对于其来说可能从根据本发明的方法对细胞进行分类中获益的其他疾病是恶性肿瘤例如多毛细胞白血病，恶性黑素瘤，和与AIDS相关的卡波西肉瘤；慢性乙型和丙型肝炎；多发性硬化症；尖锐湿疣，由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的生殖器和肛周疣；慢性肉芽肿病，严重的恶性骨硬化病，慢性病毒性肝炎，血液学恶性肿瘤例如多发性骨髓瘤；和肾细胞癌。慢性病毒性肝炎、血液学恶性肿瘤和肾细胞癌用IFNα进行治疗，而MS和多发性骨髓瘤用IFNβ进行治疗。
对于本发明方法的应用来说优选的自身免疫疾病是多发性硬化症(MS)，更优选地复发性弛张性MS。
已发现，在患有自身免疫疾病(例如多发性硬化症)或者处于患自身免疫疾病(例如多发性硬化症)的危险中的个体中，通常对暴露于I型干扰素作出响应的细胞的应答性与治疗前显著不同。这种差异是个体对于用所述I型干扰素进行的治疗的应答性的指示，并且可以通过测定由1型干扰素调节的途径的活性水平来测定。优选地，基于所测定的活性水平，将样品分类为源自具有高、低或中等的对用所述I型干扰素进行的治疗无应答或有应答的可能性的个体。
对暴露于I型干扰素的应答可以在临床上进行测定。几个标准是本领域已知的(3；4)，并且可以用于测定临床应答。优选的标准是测定扩展残疾状况得分(Expanded Disability Status Score，EDSS)的变化；治疗开始前2年和后2年复发率的差异；和/或通过磁共振成像测量的新T2损伤的形成。优选地，通过由在暴露于干扰素6个月后EDSS增加而确定的增加的残疾和/或在暴露于干扰素的过程中一次或多次复发的存在来确定无应答性。
存在有各种I型干扰素。最值得注意的是天然存在的干扰素α(IFNα)和干扰素β(IFNβ)。然而，已制备了许多不同的保留了原始干扰素的活性的变体。例如，由干扰素α和β的氨基酸组成产生了完全人工的I型干扰素。这种分子称为“复合(consensus)”干扰素。在本发明中，如果分子是干扰素α、干扰素β或其功能性部分、衍生物和/或类似物(其至少在种类方面具有与I型干扰素相同的活性，尽管活性的量不必需要是相同的)，那么将该分子称为I型干扰素。IFN的功能性部分是这样的IFN的部分，其包含有在种类方面与IFN自身相同的基因活性调节活性。此类部分的活性的量可能不同于完全蛋白质的活性。本领域技术人员能够产生合适的IFN的衍生物。衍生物可以例如通过保守氨基酸置换来获得，事实上某些目前被开处方的人干扰素在氨基酸序列方面与天然人干扰素略微不同。商购可得的I型干扰素的例子是：RebifTM，液体形式的干扰素β1a；AvonexTM，冻干形式的干扰素β1a；CinnovexTM，普通/生物相似形式的干扰素β1a(AvonexTM)；BetaseronTM，干扰素β1b；Roferon ATM，常规干扰素-α2a；Intron-ATM，常规干扰素-α2b；和PegasysTM，PEG化的干扰素α2a。因此，本发明的I型干扰素也可以在化学上进行修饰，例如通过添加PEG。
合适的IFN的部分例如是具有改变的糖基化模式的部分或者非糖基化的部分。可以通过去除或改变分子的糖基化位点来阻止糖基化。如果此类(部分)去糖基化的IFN的产生要求改变氨基酸组成，那么此类去糖基化的IFN是IFN的功能性部分的衍生物。IFN的功能性部分、衍生物和/或类似物包含有在种类方面相同但在量方面不一定相同的活性。
一般而言，IFN可以将细胞因子产生特性谱调节至抗炎表型的那种(例如通过上调IL-10)，并且这看起来在体循环中和在CNS内发生。所有I型干扰素(干扰素-α和干扰素-β)通过I型干扰素受体(IFN-R1)发挥其作用。因此，IFN的功能性部分、衍生物和/或类似物优选地包含在种类方面相同但在量方面不一定相同的通过IFN-R1的信号传导活性。在本发明中，将干扰素-β用于证明本发明方法的效能，然而，备选的I型干扰素(例如，干扰素-α)也是有效的。
I型干扰素的活性的模式在哺乳动物界中在很大程度上是保守的。大鼠干扰素对于人细胞具有活性。人和灵长类动物的干扰素在人中都是有活性的。在一个优选的实施方案中，所述I型干扰素是灵长类动物I型干扰素或其功能性部分、衍生物和/或类似物。在一个特别优选的实施方案中，所述I型干扰素是人I型干扰素。优选地，所述I型干扰素是干扰素β或其功能性部分、衍生物、类似物和/或等价物。
许多细胞对I型干扰素作出响应。短语“通常对暴露于I型干扰素作出响应的细胞”意指这样类型的细胞，当获自正常(健康)个体时，所述细胞在以正常的量/浓度暴露于I型干扰素时对I型干扰素作出响应。此类细胞的非限制性例子包括存在于颊粘膜刮屑(scraping)中的颊细胞，和上皮细胞例如角质形成细胞。细胞样品的优选例子是血液或总血细胞样品。优选地，所述样品包含外周血单核细胞(PBMC)或其细胞级分，其通常对暴露于I型干扰素作出响应。此类细胞的特别优选的例子是外周单核细胞、B细胞和T细胞。
本发明的方法特别适合于对患有多发性硬化症或者处于患多发性硬化症的危险中的个体的样品或细胞进行分类。
患有多发性硬化症或者处于患多发性硬化症的危险中的个体对于由1型干扰素介导的治疗的应答性与在所述治疗之前由1型干扰素调节的途径的基础活性水平逆相关。在治疗之前所述途径的增加的活性减少了对所述治疗作出应答的机会，由此将所述活性与参照样品的活性相比较，所述参照样品包含来自例如不患有多发性硬化症的个体，或患有多发性硬化症但对所述治疗作出响应的个体的细胞。可以基于从应答者和非应答者获得的数据来设定阈值。如果途径的基础活性水平的得分超过所述阈值，那么可以将所述应答性分类为具有增加的不作出响应的风险。如果基础活性的得分低于所述阈值，那么可以将所述应答性分类为具有增加的作出响应的风险。对于本领域技术人员来说明显的是，依赖于该分类的导出可靠性，可以设定超过一个任意阈值以用于对来自人个体的细胞进行分类。
可以以本领域已知的许多方式来测量由1型干扰素调节的途径的活性水平。已知的方法包括用抗体以及例如共焦显微术或荧光激活细胞分选术来测定中间信号传导分子例如STAT1、STAT2和IRF7的细胞定位或磷酸化水平，和使用多重免疫测定法来测定由干扰素调节的细胞因子例如白介素6和15、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL8(MCP-2)、CCL19以及CXCL9、10和11的血清水平。在一个优选的实施方案中，通过测定所述细胞中表2的至少一种基因，LGALS3BP或Siglec-1的表达水平来测定所述活性水平。在本发明中，发现表2中列出的基因，LGALS3BP和Siglec-1是由1型干扰素调节的途径的活性水平的指示，并因此可以用于测定所述活性。
用于测定表达水平的优选方法是测定所述细胞中的RNA水平。在本发明中，优选的是，对于表2的至少一种基因，LGALS3BP或Siglec-1，测定所述细胞中的RNA水平。优选地，表2中列出的所述至少一种基因，LGALS3BP或Siglec-1具有至少-0.65的R值。优选地，测定所述细胞中表2的至少5种，和优选地至少10种，更优选地至少15种基因的RNA水平。随着增加用于测定的基因的数目，该分类的准确性增加。优选地，所述至少5、10或15种基因中的每一种在所述表中包含至少-0.65的R值。所列出的具有至少-0.65的R值的所有15种基因可以在本分析中使用。当测定少于5种基因的RNA水平时，优选的是，所测定的RNA水平中的至少一种涉及RSAD2的水平。当测定至少5种基因的RNA水平时，优选的是，至少测定RSAD2(Viperin)、IFIT1(别名，G10P1；IFI56；RNM561)、MX1(别名，MxA；IFI78)、G1P2(别名，ISG15；IFI15)和Image：1926927的RNA水平。在另一个优选的实施方案中，至少测量基因RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1的基因或基因产物。这些提供了比表2中已经合适的前5种更加好的结果。在另一个优选的实施方案中，至少测量表2的前10种基因和/或基因产物(即RSAD2直至LY6E)。这些也提供了比表2中已经合适的前5种更好的结果。
因此，在一个优选的实施方案中，所述样品是在用所述I型干扰素进行的治疗开始之前获自所述个体的样品。一旦治疗已经开始，也可以将这些基因签名用于追踪和/或测定个体的应答性。在后面一种情况下，优选的是，所述样品包括在用所述I型干扰素进行的治疗开始之前和之后获自个体的样品。
优选地，通过将所测定的活性水平与参照相比较来进行在本发明方法中的该分类。参照可以是来自所述个体的另一个细胞样品的所测定的所述途径的活性水平。在这种情况下，优选的是，在用I型干扰素进行的治疗开始之前收集所述样品之一，和在所述治疗开始之后收集所述样品中的另一个。优选地，本发明的方法进一步包括将所述活性水平与在来自同时接受用I型干扰素进行的治疗的所述个体的细胞样品中所述途径的活性水平相比较。在另一个优选的实施方案中，将样品中的细胞分成两个级分，其中对于所述两个级分的细胞测定所述途径的活性水平，并且其中所述级分中的第一个级分包含未处理的细胞(静息细胞)，和其中所述级分中的第二个级分包含在测定所述途径的活性水平之前在I型干扰素存在下进行了培养的细胞，所述方法进一步包括基于所述两个级分中的活性水平的比较来对所述细胞进行分类。未处理的细胞可以是在收集后直接冷冻的细胞。也可以在冷冻之前将未处理的细胞与收集样品中的血清和/或其他细胞相分开。未处理的细胞也可以是全血样品。可以将所述细胞进行培养，但是为了保持“未处理的”，它们不可以与I型干扰素一起进行培养。在所述样品是蛋白质样品的情况下，优选的是，未处理的样品是血清样品。
在另一个优选的实施方案中，在静息的和用I型干扰素(优选地，IFNβ)处理的纯化的PBMC之间比较表达水平。优选地，所述PBMC源自相同的样品，其中所述样品的一个部分代表了静息PBMC。所述样品的另一个部分根据本发明在I型干扰素(优选地，IFNβ)存在下进行培养，并且代表了用I型干扰素(优选地，IFNβ)处理的纯化的PBMC。在这个实施方案中，特别优选的是，所述样品是来自在样品收集时未用干扰素治疗的个体的样品。优选地，所述个体是这样的个体，其正在就I型干扰素应答性进行预筛选，优选地以便确定该个体是否将用I型干扰素对MS进行治疗。优选的是，对于基因RSAD2、MxA和STAT1，测定用于比较的表达水平。优选地，借助于定量PCR，优选地借助于定量实时PCR来测定所述表达水平。
基因集合的表达谱可以使用各种方法来测定。用于测定RNA表达水平的方法例如Northern印迹法是本领域已知的，并且可以应用于本发明。优选的例子是定量扩增方法例如PCR，以及涉及使用包含用于各自RNA的探针的(微)阵列的方法。优选的基于PCR的方法包括多重PCR和多重依赖于连接的探针扩增。阵列形式对于这个目的是特别有用的。通过使用阵列形式，可以产生基因签名，所述基因签名将具有高、低或中等的对用I型干扰素进行的治疗有应答的可能性的个体区分开。
微阵列由固体支持物组成，在所述固体支持物上以有序的阵列放置了源自独个基因的DNA片段。将这些阵列与从细胞mRNA制备的荧光cDNA探针杂交。两种类型的微阵列是最常用的。一种包含通过使用光刻蚀掩蔽技术的原位寡核苷酸合成而产生的寡核苷酸。在这种类型中，基因由11至16个寡核苷酸(25聚体)来代表，每个包括完美匹配和错配(除了在其中心处的单个碱基错配外是相同的)。另一种类型的微阵列由印刷在显微镜载玻片上的更长序列(20～2000bp)的cDNA(PCR产物)或寡核苷酸组成，其中每个组成要素代表了不同的基因(15-16)。
cDNA探针与微阵列的杂交导致与在微阵列上的已知位置处的相应基因序列的特异碱基配对。在洗涤后，通过使用共焦扫描装置来定量荧光cDNA探针与每个DNA点的特异杂交信号。将扫描图像转换成基因表达矩阵。随后，可以应用不同的生物信息学软件以分析所述数据。数据分析包括数据的标准化以减少实验内和实验间的偏差。
用于测定RNA表达水平的优选方法包括Taqman低密度阵列(TaqmanLow Density Arrays)(TLDA；Applied Biosystems)，其是预加载的可定制的384-孔微观流体卡，用于基于Taqman实时PCR的靶标类别和途径研究。经定制设计的TLDA卡可以用于测量目的基因。通过使用这种高通量系统，可以使用样品的最低量对高达8个样品同时分析所有基因的表达。
用于测定表2的至少一种基因，LGALS3BP或Siglec-1的表达水平的备选方法是通过测定蛋白质表达水平。所述蛋白质表达水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定，包括但不限于Western印迹法、流式细胞术、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。优选的方法包括流式细胞术和/或ELISA。
本发明进一步提供了分部试剂盒(kit of part)，其包含对于表2的至少5种，和优选地至少10种，更优选地至少15种基因的RNA特异的探针或引物组。优选地，其中所述至少5、10或15种基因中的每一种在所述表中包含至少-0.65的R值。
本发明进一步提供了根据本发明的试剂盒用于对患有多发性硬化症或者处于患多发性硬化症的危险中的个体的样品进行分类的用途。
在另一个方面，本发明提供了用于将个体分类为具有减少的对由1型β干扰素介导的疗法作出应答的能力的个体的方法，所述方法包括：
-在包含来自所述个体的蛋白质的样品中测定一种或多种蛋白质或糖蛋白的水平；
-将所测定的水平与预定水平相比较，所述预定水平与降低的对由1型β干扰素介导的疗法的应答相关；和
-基于所述比较，评估所述个体是否具有减少的对由1型β干扰素介导的疗法作出应答的能力。
在本发明的这个方面，优选的是，所述样品是体液样品。优选地，血液样品。更优选地，所述个体的血清或血浆样品。在一个优选的实施方案中，测定由表2的基因，LGALD3BP，或Siglec-1编码的蛋白质的水平。在一个优选的实施方案中，测定由基因LGALD3BP编码的蛋白质的水平。
本发明进一步提供了用于将个体分类为具有减少的对由1型干扰素介导的疗法作出应答的能力的个体的方法，所述方法包括：
-在来自所述个体的核酸样品中测定IFR5基因中的一种或多种多态性，所述多态性与降低的对由1型干扰素介导的疗法的应答相关；和
-基于所述多态性的基因型，确定所述个体是否具有减少的对由1型干扰素介导的疗法作出应答的能力。
在一个优选的实施方案中，所述一种或多种多态性包括如图10中所描绘的在SNP rs2004640之中，在SNP rs4728142之中，或在外显子6中的30bp插入-缺失多态性之中的多态性。
当基于临床数据(EDSS得分和/或复发率，在治疗开始前2年的过程中对在治疗开始后2年的过程中测量的)将患者分为好的或差的应答者(或未测定的)时，我们看到在关于rs2004640的T等位基因而言纯合的和/或关于rs4728142的A等位基因而言纯合的患者组中存在有高百分比的差的应答者。
rs2004640的TT基因型与低/差的生物学应答有关。
rs2004640的TT基因型与低/差的临床应答有关。
rs4728142的AA基因型与低/差的生物学应答有关。
rs4728142的AA基因型与低/差的临床应答有关。
rs2004640的TT基因型与所述基因集合的IFN应答基因的高基线水平有关。
rs4728142的AA基因型与所述基因集合的IFN应答基因的高基线水平有关。
关于5bp CGGGG缺失而言纯合的患者显示出低/差的生物学应答。
关于5bp CGGGG缺失而言纯合的患者显示出差的临床应答。
在一个优选的实施方案中，测定超过一种多态性，以指明个体是好的还是差的对用I型干扰素进行的治疗的应答者。优选的是测定关于所示多态性的单元型，并且基于所测定的单元型对个体的细胞进行分类。在这个实施方案中，单元型1(rs4728142(A)rs2004640(T)外显子6indel(del)rs10954213(A))与差/低的生物学应答有关，而单元型8(rs4728142(G)rs2004640(G)外显子6indel(in)rs10954213(G))与好/高的生物学应答有关。因此，在一个方面，本发明提供了图10中所示的多态性的用途，即用于确定个体可能是好的、差的还是正常的对用I型干扰素进行的治疗的应答者。在一个优选的实施方案中，所述多态性是图11中所示的rs4728142、rs2004640、外显子6indel(del)或外显子6indel(in)、或者rs10954213的多态性。在一个优选的实施方案中，测定关于至少两种，和优选地至少3种，和更优选地所有所提及的多态性的单元型。如果分析了互补链，那么还根据本发明测定多态性。在这种情况下，本文上面所示的相关性和预测当然与各自的互补核苷酸的存在有关。组合特征是这些多态性全部位于IRF5基因中或接近IRF5基因。因为该基因可能显示更多的多态位点，所以技术人员能够发现与所示的多态性良好相关联的进一步的多态位点。因此，本发明进一步提供了用于将个体分类为具有减少的对由1型干扰素介导的疗法作出应答的能力的个体的方法，所述方法包括：
-在来自所述个体的核酸样品中测定与IFR5基因有关的进一步的多态位点，并且测定所述进一步的多态位点是否展示出与图10中所示的多态性以超过90％相关联的一种或多种多态性。
本发明进一步提供了多态性的用途，即用于将个体分类为具有减少的、正常的或良好的对由1型干扰素介导的疗法作出应答的能力的个体，所述多态性将IFR5基因的等位基因区分开，并且与图10中和本文上面所示的与对用I型干扰素进行的治疗的不良或良好应答者有关的多态性以超过90％相关联。
本发明进一步提供了用于在根据本发明的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含对于检测下列多态性来说特异的探针或PCR引物组：IFR5的SNP rs2004640、SNP rs4728142或在外显子6中的30bp插入-缺失多态性之中的多态性，或者与IFR5基因有关并且与图10中和本文上面所示的与对用I型干扰素进行的治疗的不良或良好应答者有关的多态性以超过90％相关联的多态性。
附图简述
图1A：在MS患者中对IFNβ疗法的生物学应答
Treeview图，其呈现了在没有对基因表达比(gene expressionratio)进行定中心的双向系统聚类分析(two-way hierarchicalCluster analysis)后，相对于中值表达比而言在基因表达比(生物学应答)方面显示出至少两倍差异的基因。在治疗后上调的基因由红色指示，下调的基因由绿色指示，以及在治疗后在表达方面未显示出差异的基因以黑色指示。
图1B：IFN-诱导的基因的簇
基于在患者组内的类似的生物学应答特性谱而聚类在一起的基因的选择。所述基因以0.925的相关性聚类在一起，并且已知由IFN诱导。这个IFN簇中的所有基因的平均表达比被称为生物学IFN-应答。
图2：基线基因表达水平和对IFNβ疗法的生物学应答之间的相关性
计算出在基线上的平均表达水平和IFN-诱导的基因集合的平均生物学应答，并且使它们彼此相关联，从而导致显著的负相关；A，图1B中所描述的IFN簇；B，15种基因的选择。
图3：在具有22位个体的组中，基线RSAD2基因表达水平和对IFNβ疗法的生物学应答之间的相关性
通过定量实时PCR测量出的RSAD2的相对基线表达水平标示在X轴上。y轴标示出了生物学应答(在IFNβ疗法开始前RSAD2的基因表达水平除以在IFNβ疗法开始后(＝在IFNβ疗法过程中)RSAD2的基因表达水平)。
图4：在基线处，在具有SNP rs 2004640的基因型GG、GT和TT的患者中，表2的前10种IFNI型应答基因的集合(RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1)的平均基因表达水平。关于T等位基因而言纯合的患者具有比杂合的患者显著更高的基线IFNI型应答基因表达(P＝0.0198)。rs2004640的TT基因型与该基因集合的IFN应答基因的高基线水平有关。
图5：在用IFN-b进行药物介入后，在具有SNP rs 2004640的基因型GG、GT和TT的患者中，表2的前10种IFNI型应答基因的集合(RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1)的平均基因表达水平。相比于杂合的患者(P＝0.0057)和关于G等位基因而言纯合的患者(0.0340)来说，对于关于T等位基因而言纯合的患者观察到显著减少的生物学应答。
图6：在基线处，在具有SNP rs4728142的基因型GG、GT和TT的患者中，表2的前10种IFNI型应答基因的集合(RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1)的平均基因表达水平。关于A等位基因而言纯合的患者具有比杂合的患者显著更高的基线IFN I型应答基因表达(P＝0.0394)。
图7：在用IFN-b进行药物介入后，在具有SNP rs4728142的基因型GG、GT和TT的患者中，表2的前10种IFN I型应答基因的集合(RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1)的平均基因表达水平。关于A等位基因而言纯合的患者具有比杂合的患者(p＝0.1198)和关于G等位基因而言纯合的患者(p＝0.1421)更低的生物学应答。
图8：在用IFNβ进行治疗之前和之后15位MS患者的LGALS3BP的表达水平显示，在大多数患者中，表达在治疗后上调。
图9：在具有15位个体的组中，基线LGALS3BP基因表达水平和对IFNβ疗法的生物学应答之间的相关性
LGALS3BP的相对基线表达水平标示在X轴上。y轴标示出了生物学应答(在IFNβ疗法开始后(＝在IFNβ疗法过程中)LGALS3BP的基因表达水平除以在IFNβ疗法开始前LGALS3BP的基因表达水平)。
图10：多态性的特征
实施例
实施例1(还可参见：van Baarsen LG，Vosslamber等人，PLoS ONE.2008)
患者
从MS Centre Amsterdam的门诊部征募一组16位具有临床上明确的复发性弛张性MS的荷兰患者(10位女性和6位男性)。在IFNβ疗法开始时的平均年龄是40.6±7.7，平均EDSS是2.3±1.3(范围1-6)。紧在治疗前和在该疗法开始后1个月获得血液样品。患者接受Avonex(n＝4)、倍泰龙(Betaferon)(n＝7)、利比(Rebif)22(＝2)或利比44(n＝3)。
血液取样
从每个患者中抽取血液到一个PAXgene管(PreAnalytix，GmbH，Germany)和三个肝素管(Beckton Dickinson，Alphen a/d Rijn，Netherlands)中。在血液收集后，在1个小时内将管从门诊部转移到实验室中，以便使用lymphoprep(Axis-Shield，Lucron)密度梯度离心从肝素管中分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)。PAXgene管在室温(RT)下贮存2小时，以确保所有血细胞的完全裂解，在这之后，将管贮存于-20直至RNA分离。在贮存后7个月内分离总RNA。在RNA分离之前将管在RT下解冻2小时。接下来，根据制造商的指导，使用PreAnalytix RNA分离试剂盒来分离RNA，其中包括DNA酶(Qiagen)步骤以去除基因组DNA。RNA的数量和品质使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，Delaware USA)来进行测试，根据制造商的指导，包括DNA酶(Qiagen)步骤以去除基因组DNA。RNA的数量和品质使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，Delaware USA)来进行测试。
微阵列杂交
我们使用了印刷在经氨基硅烷包被的载玻片上的来自StanfordFunctional Genomics Facility(http://microarray.org/sfgf/)的43K cDNA微阵列，其包含～17,000种独特的基因。使用150-300mJoules，将最初的DNA斑点UV-交联至载玻片。在样品杂交之前，载玻片在包含40％超纯甲酰胺(Invitrogen，Breda，Netherlands)、5％SSC(Biochemika，Sigma)、0.1％SDS(Fluka Chemie，GmbH，Switserland)和50μg/ml BSA(Panvera，Madison，USA)的溶液中于42摄氏度预杂交15分钟。在预杂交后，将载玻片在MilliQ水中短暂漂洗，在沸水和95％乙醇中充分洗涤，并风干。如先前所描述的(17)，进行样品制备和微阵列杂交，除了上文所描述的不同的后处理和预杂交外。
微阵列分析
如先前所描述的(19)，使用Stanford Microarray Database(18)(http://genome-www5.stanford.edu//)来进行图像分析和数据过滤。将微阵列的统计学分析(20)(Statistical Analysis of Microarrays，SAM)用于确定显著差异表达的基因。如果假发现率(False DiscoveryRate，FDR)等于或小于5％，那么该基因被视为是显著差异表达的。使用聚类分析(cluster analysis)(21)来定义同步改变的基因的簇，在这之后，通过使用Treeview来显现所述数据。
实时PCR
根据制造商的指导，使用Revertaid H-minus cDNA合成试剂盒(MBIFermentas，St.Leon-Rot，Germany)，将RNA(0.5μg)逆转录成cDNA。使用SybrGreen(Applied Biosystems)，使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，施行定量实时PCR。使用Primer Express软件和指南(Applied Biosystems)来设计引物，并且在表4中列出。为了计算mRNA水平的任意值以及校正引物效率中的差异，构建了标准曲线。针对在相同cDNA样品中平行检测的持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，来使靶基因的表达水平标准化。
体外研究
使用包含1％胎牛血清(FCS；BioWhittaker，Cambrex)的PBS来洗涤新分离的PBMC，并且以2×106个细胞/ml/孔的密度在24-孔培养板中进行铺板。细胞用10个单位的重组IFNβ(Abcam，Cambridge，UK)刺激4小时或者不刺激，在这之后，根据制造商的指导，使用Rneasy QiagenRNA分离试剂盒(Qiagen，Venlo，Netherlands)来分离RNA。包括了DNA酶(Qiagen)步骤，以去除基因组DNA。RNA的数量和品质使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop Technologies，Wilmington，DelawareUSA)来进行测试。
统计学分析
使用Graphpad Prism 4软件来进行相关性分析。首先，就正态分布来对数据进行检验。在数据通过了正态性检验的情况下，使用Pearson相关性(Pearson correlation)来检验相关性。在数据的非参数分布的情况下，使用Spearman相关性(Spearman correlation)。如果p-值小于0.05，那么该相关性被视为是显著的。
实施例2(还可参见：van Baarsen LG，Vosslamber等人，PLoS ONE.2008)
在MS中IFNβ疗法的药物基因组学
为了了解IFNβ疗法的药效动力学，我们在治疗开始前和在治疗开始后1个月分析16位RRMS患者的外周血基因表达谱。将在治疗前和治疗后数据之间的使用微阵列的显著性分析(Significant Analysis ofMicroarrays，SAM)(假发现率(FDR)＜5％)来进行的两类别成对分析(two class paired analysis)应用于鉴定显著不同的基因。令人惊讶地，仅3种基因，“干扰素α诱导型蛋白27”(Interferonalpha-inducible protein 27，IFI27)、“环指蛋白36”(Ring fingerprotein 36，RNF36)和“上皮基质相互作用蛋白1(乳腺)”(Epithelialstromal interaction protein 1，EPSTI1)被鉴定为显著差异表达的。因此，我们得出结论，对IFNβ的生物学应答在MS患者群体中总体上是很低的或可忽略的。这个结论与在MS中发现亚最佳的I型IFN信号传导相一致(22)。
考虑到MS的异质性质，我们怀疑在整个MS群组的IFNβ治疗后所观察到的不良的体内应答是否可能反映了使患者之间药效动力学应答性的差异达到平均值。为了测试这个假设，我们研究了在个体患者水平上的生物学应答，并且对于每个患者和对于每种基因计算了在治疗前和治疗后的基因表达的比(前∶后)(log-2比)。将双向系统(无人管理)聚类分析用于选择在患者之间在IFNβ诱导的表达方面不同的基因。这个分析显示了在患者之间在对IFNβ的生物学应答方面的明显变化。全部126种基因在至少7位患者中显示出在基因表达比方面的至少2倍差异(图1A)。这个分析揭示，某些患者显示出被上调的基因，而在其他患者中相同基因在IFNβ疗法后被下调或未改变。如所预期的，这个基因表达模式的部分与已知的IFN应答基因(14)的表达相一致(图1B)。28种IFN-诱导的基因中的许多紧紧聚类在一起(r＝0.925)，这表明了这些基因的相关的功能；但它们在患者之间显示出不同的差异的相对应答比。某些IFN-诱导的基因的表达数据通过实时PCR来加以验证，并且显示出了与微阵列数据的良好相关性(表1A)。这些发现证实了这样的假设，即在具有RRMS的患者之间在IFNβ的药理学效应方面存在有相当大的变化。
实施例3(还可参见：van Baarsen LG，Vosslamber等人，PLoS ONE.2008)
IFNβ疗法的差异药效动力学和IFN应答基因的基线表达之间的关系
先前，我们证明了在未治疗的RRMS患者之间在由I型IFN诱导的基因表达方面的显著差异(19)。此处，我们研究在对IFNβ的差异体内应答性和IFN-诱导的基因的基线表达水平之间是否存在关系。因此，对于每个患者我们测试了在治疗前I型IFN应答基因簇(图1B中所显示的)的表达水平与在治疗后的应答比之间是否存在联系。该分析证明，所述28种I型IFN基因的平均基线表达与体内由IFN诱导的应答水平负相关(p＝0.0049和Pearson r＝-0.6657)(图2A)。
为了产生最佳地预测对IFNβ的药理学应答的基因集合，我们选择了其表达在基线和生物学应答之间显示出最佳负相关的那些基因(p＜0.01和Pearson r＜-0.65)(表2)。为了排除在基线处的基因选择的潜在偏差，我们分析了所选择的15种IFN-诱导的基因的平均生物学应答与阵列上的所有基因的基线值的相关性。这导致与对IFNβ疗法的药效动力学应答显著相关联的三种另外的基因(IFI44L、MT1E和IMAGE：1879725；Pearson r＜0.65和方差＞1.00)。尽管这些基因没有与先前所选择的基因紧紧地聚类在一起，但它们在对IFNβ的药效动力学中可能是重要的。
实施例4(还可参见：van Baarsen LG，Vosslamber等人，PLoS ONE.2008)
使用纯化的PBMC的IFNβ药效动力学
为了证实所观察到的药效动力学差异是由于外周血细胞的差异应答性，而不是因为由于抑制性血浆蛋白质例如中和抗体的存在而引起的IFNβ的低暴露，通过定量实时PCR，我们测量了在静息的和用IFNβ处理的纯化的PBMC中所选择的三种已知IFNβ应答基因集合和IFNβ自身的表达。所选择的IFNβ应答基因是：i，RSAD2，其显示出最显著的在单基因水平上生物学应答对基线的相关性(表2)；ii，MxA，其显示出良好的负相关并且已知是I FN生物活性的标志物(23)；和iii，STAT1，其是对于IFNβ信号传导而言重要的组分之一。我们假定IFNβ的基线表达水平影响在治疗后的后续IFNβ信号传导。当将这些基因的体外生物学应答与所选择的15种基因的平均体内生物学应答相比较时，揭示出了显著的联系(表3)。根据这些结果，我们得出结论，在MS中的差异IFNβ应答性是外周血细胞的药效动力学差异的后果。
这些数据清楚地显示，存在有关于在具有MS的患者之间IFNβ药效动力学方面的差异的证据。迄今，对IFNβ的无应答性的一部分通过持久性中和抗体(NAb)的出现来加以解释，所述中和抗体显示出与IFN的功效的减少有关(24；25)。NAb在基线之前存在于患者中是不太可能的，因为NAb随着时间过去而出现。因此，我们观察到，差异IFN应答模式在IFNβ治疗前分离的来自MS患者的PBMC中也是明显的。体外应答差异与体内应答结果相一致。因此，我们的发现表明，在MS中对IFNβ的差异应答是患者之间的病理生理学差异的后果，并且排除了牵涉中和抗体来解释在患者子集中所观察到的缺陷应答的可能性。
在RRMS患者之间的这些差异证明了IFN应答基线水平作为可区分生物学应答者和非应答者的占优势途径的生理病理学重要性。我们指派了已知为IFN I型应答基因的基因簇(在表2中列出的前15种)。
实施例5(还可参见：van Baarsen LG，Vosslamber等人，PLoS ONE.2008)
在IFNβ疗法之前和之后在来自22位RRMS患者的全血中的RSDA2基因表达
如先前所描述的，许多IFN-诱导的基因的基线表达水平可以预测在RRMS患者中对IFNβ治疗的生物学应答(＝治疗前/后的基因表达之比)。在这个试验性研究中，我们在IFNβ治疗开始之前和之后从第二组22位RRMS患者中收集全血。
正如我们在先前研究中所观察到的，RSAD2的基因表达水平(尤其)可以预测对IFNβ治疗的生物学应答。在该第二组患者中，我们使用定量实时PCR测量了RSAD2的表达。
在治疗开始前具有高的RSAD2表达的患者中，在治疗后/过程中表达水平是低的，而在治疗前具有低的RSAD2表达的患者中，在IFNβ治疗后/过程中该表达明显上升(参见图3)。基线水平和在治疗后/过程中RSAD2的基因表达水平之间的这种负相关证实了先前研究的结果。
实施例6
为了测定生物学应答，在IFN-b疗法前和过程中从30位RRMS患者中收集外周血。从20位未治疗的RRMS患者中，经过3-12个月的时间段在两个时间点处收集外周血，以分析基线值随着时间过去的稳定性。使用表2的前10种IFN I型应答基因的集合(RSAD2、IFIT1、MX1、ISG15、EPSTI1、IRF7、LY6E、OAS1、OAS3、SERPING1)的平均基因表达水平，通过Taqman低密度阵列(Taqman Low Density Arrays，TLDA)分析了基线稳定性和生物学应答率。对于IRF5基因(IFN信号传导级联的组分)，测定了遗传性变异。对三个(rs2004640、rs10954213、rs4728142)单核苷酸多态性(SNP)的小组和一个在外显子6中的30bp插入-缺失多态性进行基因分型。使用Taqman基因分型测定法(Taqman GenotypingAssay)(Applied Biosystems)来对所述SNP进行基因分型。使用常规PCR，将30bp indel扩增为115/145bp片段。将经PCR扩增的片段在2.5％琼脂糖凝胶上分开，并且使用溴化乙锭染色来显现。
生物学应答的程度与I型IFN应答基因集合的基线表达负相关(R＝-0.3891；p＝0.0336)。随着时间过去的基线稳定性由r＝0.54的相关系数来反映；P＝0.029(n＝20)。
接下来，我们测定了三个SNP和在IRF5基因中的30bp插入-缺失多态性与在基线处和在用IFN-β进行药物介入后的IFN I型应答基因活性的联系。对于rs2004640，我们显示了，关于T等位基因而言纯合的患者具有比杂合的患者显著更高的基线IFN I型应答基因表达(P＝0.0198)(图4)。因此，相比于杂合的患者(P＝0.0057)和关于G等位基因而言纯合的患者(0.0340)来说，对于关于T等位基因而言纯合的患者观察到显著减少的生物学应答(图5)。对于rs4728142，关于A等位基因而言纯合的患者具有比杂合的患者显著更高的基线IFNI型应答基因表达(P＝0.0394)(图6)，并且具有朝向相比于杂合的患者(p＝0.1198)和关于G等位基因而言纯合的患者(p＝0.1421)来说更低的生物学应答的倾向(图7)。
我们进行了单元型分析，并且确定，单元型1与差/低的生物学应答有关，而单元型8与好/高的生物学应答有关。
单元型1：rs4728142(A)rs2004640(T)外显子6indel(del)rs10954213(A)
单元型8：rs4728142(G)rs2004640(G)外显子6indel(in)rs10954213(G)
当基于临床数据(EDSS得分和/或复发率，在治疗开始前2年的过程中对在治疗开始后2年的过程中测量的)将患者分为好的或差的应答者(或未测定的)时，我们看到在关于rs2004640的T等位基因而言纯合的和/或关于rs4728142的A等位基因而言纯合的患者组中存在有高百分比的差的应答者。
结论：
·rs2004640的TT基因型与低/差的生物学应答有关。
·rs2004640的TT基因型与低/差的临床应答有关。
·rs4728142的AA基因型与低/差的生物学应答有关。
·rs4728142的AA基因型与低/差的临床应答有关。
·rs2004640的TT基因型与所述基因集合的IFN应答基因的高基线水平有关。
·rs4728142的AA基因型与所述基因集合的IFN应答基因的高基线水平有关。
·关于5bp CGGGG缺失而言纯合的患者显示出低/差的生物学应答。
·关于5bp CGGGG缺失而言纯合的患者显示出差的临床应答。
实施例7
在IFNβ疗法之前和之后，在来自15位MS患者的全血中的LGALS3BP(别名，90K/Mac-2BP蛋白)基因表达
如先前所描述的，许多IFN-诱导的基因的基线表达水平可以预测在MS患者中对IFNβ治疗的生物学应答(＝治疗前/后的基因表达之比)。在这个试验性研究中，我们在IFNβ治疗开始之前和之后从一组15位MS患者中收集全血。
正如我们在先前研究中所观察到的，LGALS3BP的基因表达水平(尤其)可以预测对IFNβ治疗的生物学应答。在治疗开始前具有高的LGALS3BP表达的患者中，在治疗后/过程中表达水平是低的，而在治疗前具有低的LGALS3BP表达的患者中，在IFNβ治疗后/过程中该表达明显上升(参见图8和图9)。因此，升高的LGALS3BP血清水平是关于不能对I型IFN治疗作出应答的预测性生物标志物，如先前对于用干扰素-α进行治疗的具有慢性丙型肝炎感染的患者所已经显示的(Artini M等人，Hepatol.1996 Aug：25(2)：212-7)。
实施例8
在外周血中的单核细胞上表达的Siglec-1，其作为关于对IFNb疗法的应答的生物标志物
唾液酸结合Ig样凝集素1(Sialic acid-binding Ig-like lectin1)(Siglec-1，唾液酸粘附素，CD169)已知是最突出的由I型IFN调节的候选基因之一。Biesen等人(Arthr.Rheum.2008Apr；58(4)：1136-45)证明，在炎性和定居单核细胞中的Siglec-1表达是用于在系统性红斑狼疮中监测疾病活动性和治疗成功的潜在生物标志物。使用多色流式细胞术测定了Siglec-1的水平。显示出，表达Siglec-1的单核细胞子集的频率与疾病活动性(如通过SLE疾病活动性指数(SLEDisease Activity Index)所测量的)相关，并且与补体因子的水平逆相关。最有趣的是，抗双链DNA(抗-dsDNA)抗体的水平与表达Siglec-1的定居单核细胞(而不是炎性单核细胞)的百分比高度相关。高剂量的糖皮质激素治疗导致在来自具有活动性SLE的患者的细胞中Siglec-1表达的急剧减少。因此，在定居血单核细胞中的Siglec-1表达是关于I型IFN应答的潜在生物标志物，所述I型IFN应答是疾病活动性的指示。因此，在MS和其他IFN相关疾病(黑素瘤、丙型肝炎感染)中在单核细胞上表达的Siglec-1的水平可以用作关于基线I型IFN应答活性(其可预测对治疗的应答)的生物标志物。
参考文献
(1)Hafler DA，Slavik JM，Anderson DE，O′Connor KC，De JP，Baecher-Allan C.Multiple sclerosis.Immunol Rev 2005April；204：208-31.
(2)Interferon beta-1b in the treatment of multiple sclerosis：final outcome of the randomized controlled trial.The IFNBMultiple Sclerosis Study Group and The University of BritishColumbia MS/MRI Analysis Group.Neurology 1995July；45(7)：1277-85.
(3)Rudick RA，Lee JC，Simon J，Ransohoff RM，Fisher E.Defining interferon beta response status in multiple sclerosispatients.Ann Neurol 2004 October；56(4)：548-55.
(4)Rio J，Nos C，Tintore M，Tellez n，Galan I，Pelavo R，Comabella M，Montalban X.Defining the response tointerferon-beta in relapsing remitting multiple sclerosispatients.Ann Neurol 2006 February；59(2)：344-52
(5)Reske D，Walser A，Haupt WF，Petereit HF.Long-termpersisting interferon beta-1b neutralizing antibodies afterdiscontinuation of treatment.Acta Neurol Scand 2004January；109(1)：66-70.
(6)Rice GP，Paszner B，Oger J，Lesaux J，Paty D，Ebers G.The evolution of neutralizing antibodies in multiple sclerosispatients treated with interferon beta-1b.Neurology 1999 April12；52(6)：1277-9.
(7)Sibley WA，Bamford CR，Clark K.Clinical viral infectionsand multiple sclerosis.Lancet 1985 June 8；1(8441)：1313-5.
(8)Vartanian TK，Zamvil SS，Fox E，Sorensen PS.Neutralizingantibodies to disease-modifying agents in the treatment ofmultiple sclerosis.Neurology 2004 December 14；63(11 Suppl5)：S42-S49.
(9)Ghislain JJ，Fish EN.Application of genomic DNA affinitychromatography identifies multiple interferon-alpha-regulatedStat2 complexes.J Biol Chem 1996 May 24；271(21)：12408-13.
(10)Li X，Leung S，Qureshi S，Darnell JE，Jr.，Stark GR.Formation of STAT1-STAT2 heterodimers and their role in theactivation of IRF-1 gene transcription by interferon-alpha.JBiol Chem 1996 March 8；271(10)：5790-4.
(11)Brierley MM，Fish EN.Functional relevance of theconserved DNA-binding domain of STAT2.J Biol Chem 2005 April1；280(13)：13029-36.
(12)Ghislain JJ，Wong T，Nguyen M，Fish EN.Theinterferon-inducible Stat2：Stat1 heterodimer preferentiallybinds in vitro to a consensus element found in the promoters ofa subset of interferon-stimulated genes.J Interferon CytokineRes 2001 June；21(6)：379-88.
(13)Takaoka A，Taniguchi T.New aspects of IFN-alpha/betasignalling in immunity，oncogenesis and bone metabolism.CancerSci 2003 May；94(5)：405-11.
(14)Der SD，Zhou A，Williams BR，Silverman RH.Identification of genes differentially regulated by interferonalpha，beta，or gamma using oligonucleotide arrays.Proc NatlAcad Sci USA 1998 December 22；95(26)：15623-8.
(15)Brown，P.O.& Botstein，D.Exploring the new world ofthe genome with DNA microarrays.Nat Genet 1999；21：33-37.
(16)3.Hughes，T.R.，Mao，M.，Jones，A.R.，Burchard，J.，Marton，M.J.，Shannon，K.W.，Lefkowitz，S.M.，Ziman，M.，Schelter，J.M.，Meyer，M.R.，Kobayashi，S.，Davis，C.，Dai，H.，He，Y.D.，Stephaniants，S.B.，Cavet，G.，Walker，W.L.，West，A.，Coffey，E.，Shoemaker，D.D.，Stoughton，R.，Blanchard，A.P.，Friend，S.H.，& Linsley，P.S.Expression profiling usingmicroarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotide synthesizer.Nat.Biotechnol.2001；19：342-347.
(17)van der Pouw Kraan TC，Baarsen EGM，Rustenburg F，BaltusB，Fero M，Verweij CL.Gene expression profiling in rheumatology.In：Cope AP，editor.Arthritis Research.Methods and Protocols，Volume 2 ed.The Humana Press Inc.；2007.
(18)Ball CA，Awad IA，Demeter J，Gollub J，Hebert JM，Hernandez-Boussard T等人，The Stanford Microarray Databaseaccommodates additional microarray platforms and data formats.Nucleic Acids Res 2005 January 1；33(Database issue)：D580-D582.
(19)van Baarsen LG，van der Pouw Kraan TC，Kragt JJ，BaggenJM，Rustenburg F，Hooper T等人，A subtype of multiple sclerosisdefined by an activated immune defense program.Genes Immun 2006September；7(6)：522-31.
(20)Tusher VG，Tibshirani R，Chu G.Significance analysisof microarrays applied to the ionizing radiation response.ProcNatl Acad Sci USA 2001 April 24；98(9)：5116-21.
(21)Eisen MB，Spellman PT，Brown PO，Botstein D.Clusteranalysis and display of genome-wide expression patterns.ProcNatl Acad Sci USA 1998 December 8；95(25)：14863-8.
(22)Feng X，Petraglia AL，Chen M，Byskosh PV，Boos MD，RederAT.Low expression of interferon-stimulated genes in activemultiple sclerosis is linked to subnormal phosphorylation ofSTAT1.J Neuroimmunol 2002 August；129(1-2)：205-15.
(23)Kracke A，von WP，Al-Masri AN，Dalley G，Windhagen A，Heidenreich F.Mx proteins in blood leukocytes for monitoringinterferon beta-1b therapy in patients with MS.Neurology 2000January 11；54(1)：193-9.
(24)Li DK，Zhao GJ，Paty DW.Randomized controlled trial ofinterfefon-beta-1a in secondary progressive MS：MRI results.Neurology 2001 June 12；56(11)：1505-13.
(25)Rudick RA，Simonian NA，Alam JA，Campion M，ScaramucciJO，Jones W等人，Incidence and significance of neutralizingantibodies to interferon beta-1a in multiple sclerosis.MultipleSclerosis Collaborative Research Group(MSCRG).Neurology 1998May；50(5)：1266-72.
Deguez-Gonzalez R，Calaza M，Perez-Pampin E，de 1a Serna AR，Fernandez-Gutierrez B，Castaneda S等人，Association ofinterferon regulatory factor 5 haplotypes，similar to that foundin systemic lupus erythematosus，in a large subgroup of patientswith rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum 2008；58(5)：1264-1274.
Demirci FY，Manzi S，Ramsey-Goldman R，Minster RL，Kenney M，Shaw PS等人，Association of a common interferon regulatory factor5(IRF5)variant with increased risk of systemic lupuserythematosus(SLE).Ann Hum Genet 2007；71(Pt 3)：308-311.
Graham RR，Kyogoku C，Sigurdsson S，Vlasova IA，Davies LR，Baechler EC等人，Three functional variants of IFN regulatoryfactor 5(IRF5)define risk and protective haplotypes for humanlupus.Proc Natl Acad Sci USA 2007；104(16)：6758-6763.
Kristjansdottir G，Sandling JK，Bonetti A，Roos IM，MilaniL，Wang C等人，Interferon Regulatory Factor 5(IRF5)GeneVariants are Associated with Multiple Sclerosis in Three DistinctPopulations.J Med Genet 2008.
Sigurdsson S，Goring HH，Kristjansdottir G，Milani L，Nordmark G，Sandling JK等人，Comprehensive evaluation of thegenetic variants of interferon regulatory factor 5(IRF5)revealsa novel 5 bp length polymorphism as strong risk factor forsystemic lupus erythematosus.Hum Mol Genet 2008；17(6)：872-881.
表
表1：微阵列数据和实时PCR数据之间的相关性。
表2：对于IFN簇，在单基因水平上基线对生物学应答的相关性
表3：体外单个IFN-诱导的基因的生物学应答和15种基因的平均体内生物学应答之间的相关性
表4：用于实时PCR的引物