用于诊断和治疗男性低生育力的方法和药物组合物.pdf

本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的试剂。所述试剂可以为例如降解DNA的酶(如DNA酶)、阻断无细胞DNA和精细胞表面受体之间相互作用的物质、结合DNA的物质、抑制内源性精细胞DNA酶的物质、抑制由结合到精细胞表面受体上的DNA介导的信号传导途径的成员的物质、或刺激造成无细胞DNA对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂。本发明还提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用本发明的药1物组合物。本发明还提供了确定男性受试对象的生育力状况的方法、辅助生育的方法、选择辅助生育技术(ART)的方法和在用在辅助生育技术中的精细胞群中选择精细胞的方法。

权利要求书
1.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含降解DNA的酶和生理可接受的载体。

2.  如权利要求1所述的组合物，其中所述酶为选自脱氧核糖核酸内切酶或脱氧核糖核酸外切酶中的脱氧核糖核酸酶。

3.  如权利要求2所述的组合物，其中所述脱氧核糖核酸酶为I型脱氧核糖核酸酶。

4.  如权利要求1～3任一项所述的组合物，其中所述酶来源于动物、植物、细菌、病毒、酵母菌或原生动物，或者为重组酶或人类重组酶。

5.  如前述权利要求任一项所述的组合物，所述组合物为适于口服施用的形式。

6.  如权利要求1～5任一项所述的组合物，所述组合物为适于通过吸入施用的剂型。

7.  如权利要求1～5任一项所述的组合物，所述组合物为适于通过注射施用的剂型。

8.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含阻断无细胞DNA与精细胞表面受体之间相互作用的物质和生理可接受的载体。

9.  如权利要求8所述的组合物，其中所述物质为糖蛋白IF-1。

10.  如权利要求8所述的组合物，其中所述受体选自CD4和MHC II。

11.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含结合DNA的物质和生理可接受的载体。

12.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含抑制内源性精细胞DNA酶的物质和生理可接受的载体。

13.  如权利要求12所述的组合物，其中所述物质选自金精三羧酸或柠檬酸或它们的盐。

14.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含抑制由结合到精细胞表面受体上的DNA介导的信号传导途径的成员的物质和生理可接受的载体。

15.  如权利要求14所述的组合物，其中所述物质是半胱天冬酶抑制剂。

16.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述药物组合物包含刺激造成无细胞DNA对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂和生理可接受的载体。

17.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用降解DNA的酶。

18.  如权利要求17所述的方法，其中所述酶为选自脱氧核糖核酸内切酶或脱氧核糖核酸外切酶中的脱氧核糖核酸酶。

19.  如权利要求18所述的方法，其中所述脱氧核糖核酸酶为I型脱氧核糖核酸酶。

20.  如权利要求17～19任一项所述的方法，其中所述酶来源于动物、植物、细菌、病毒、酵母菌或原生动物，或者为重组酶或人类重组酶。

21.  如权利要求17～20任一项所述的方法，其中所述酶通过口服施用。

22.  如权利要求17～20任一项所述的方法，其中所述酶通过吸入施用。

23.  如权利要求17～20任一项所述的方法，其中所述酶通过注射施用。

24.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用阻断无细胞DNA与精细胞表面受体之间相互作用的物质。

25.  如权利要求24所述的方法，其中所述物质为糖蛋白IF-1。

26.  如权利要求24所述的方法，其中所述受体选自CD4和MHC II。

27.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用结合DNA的物质。

28.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用抑制内源性精细胞DNA酶的物质。

29.  如权利要求28所述的方法，其中所述DNA酶抑制剂选自金精三羧酸或柠檬酸或它们的盐。

30.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用抑制由结合到精细胞表面受体上的DNA介导的信号传导途径的成员的物质。

31.  如权利要求30所述的方法，其中所述物质为半胱天冬酶抑制剂。

32.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用刺激造成无细胞DNA对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂。

33.  如权利要求17～32任一项所述的方法，其中所述施用的持续时间为短期、中期或长期。

34.  一种确定男性受试对象的生育力状况的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试对象获取身体组织样品或体液样品；
(b)测量所述样品中的无细胞DNA水平或造成无细胞DNA对精细胞的影响降低的试剂的水平；
(c)将所测得的水平与一个或多个预定阈值比较；和
(d)基于所述比较来确定所述生育力状况。

35.  如权利要求34所述的方法，其中所述试剂为DNA酶。

36.  一种确定男性受试对象的生育力状况的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试对象获取含有精细胞的样品；
(b)测量所述精细胞中的指示细胞凋亡的物质的水平；
(c)将所测得的水平与一个或多个预定阈值比较；和
(d)基于所述比较来确定所述生育力状况。

37.  如权利要求36所述的方法，其中所述物质选自Fas受体、caspas3和精细胞内部DNA酶。

38.  一种辅助生育的方法，所述方法包括：
(a)从受权利要求17～33任一项所述的方法治疗的男性中获取含有精细胞的样品；
(b)将所述样品利用在辅助生育技术中。

39.  一种选择辅助生育技术的方法，所述方法包括：
(a)通过权利要求34～37任一项所述的方法确定男性受试对象的生育力状况；
(b)基于所述生育力状况确定辅助生育技术。

40.  一种在用于辅助生育技术中的精细胞群中选择精细胞的方法，所述方法包括：
(a)获取含有精细胞的精液样品；和
(b)从所述精液样品中去除表达细胞凋亡标记的精细胞，以获得精细胞亚群。

41.  如权利要求40所述的方法，其中所述标记为细胞表面Fas受体。

42.  如权利要求40所述的方法，其中所述标记为DNA-精细胞表面受体复合物。

43.  如权利要求40所述的方法，其中所述去除精细胞的步骤涉及用抗体结合所述标记和从所述精液样品中去除抗体结合精细胞。

44.  如权利要求43所述的方法，其中所述抗体是荧光标记抗体，并且使用荧光激活细胞分选仪来去除结合到所述抗体上的精细胞。

45.  如权利要求43所述的方法，其中所述抗体能结合树脂珠，并且使用柱子或离心作用或磁体来从树脂结合精细胞中分离未结合的精细胞。

46.  如权利要求39所述的方法，其中所述辅助生育技术选自宫腔内人工授精、体外受精、卵胞质内单精子注射和卵胞质内形态学选择注射。

47.  一种用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含选自下列试剂的试剂和生理可接受的载体：
(a)造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的试剂；和
(b)刺激造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的内源性物质的产生的试剂。

48.  一种治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用选自下列试剂的试剂：
(a)造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的试剂；和
(b)刺激造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的内源性物质的产生的试剂。

说明书用于诊断和治疗男性低生育力的方法和药物组合物
技术领域
本发明涉及方法和药物组合物，更具体而言，本发明涉及用于诊断和治疗男性低生育力的方法和药物组合物。
背景技术
下面是认为与理解本发明有关的现有技术参考文献的列表。本文中有时会通过在括号中指出来自如下列表的这些参考文献的编号来确认它们。
1.Isidori A，Latini M，Romanelli F.(1)Isidori A，Latini M，Romanelli F.Treatment of male infertility.Contraception(男性不育的治疗).2005年10月；72(4)：314-8。
2.Kerin JFP，Peek J，Warms GM，Kirby C，Jeffrey R，Matthews CD，Cox LW(1984)Improved conception rate after intrauterine insemination ofwashed spermatozoa from men with poor quality semen(提高来自精液重量欠佳的男性的经洗涤的精子在宫腔内人工授精的妊娠率).Lancet1：533-534。
3.Ombelet W，Puttemans P，Bosmans E(1995)Intrauterine insemination：a first step procedure in the algorithm of male subfertility treatment(宫腔内人工授精：男性低生育力治疗法则中的第一步程序).Hum Reprod10：90-102。
4.Hinting A，Comhaire F，Vermeulen L，Dhont M，Vermeulen A，Vandekerckhove D(1990)Possibilities and limitations of techniques ofassisted reproduction for the treatment ofmale infertility(用于治疗男性不育的辅助生育的技术的可能性和限制性).Hum Reprod 5：544-548。
5.Comhaire F，Milingos S，Liapi A，Gordts S，Campo R，Depypere H，Dhont M，Schoonjans F(1995)The effective cumulative pregnancy rate ofdifferent modes oftreatment of male infertility(男性不育治疗的不同方式的有效累积妊娠率).Andrologia 27：217-221。
6.Palermo GD，Cohen J，Alikani M，Adler A，Rozenwaks Z(1995)Intracytoplasmic sperm injection：a novel treatment for all forms of malefactor infertility(卵胞质内单精子注射：用于所有形式的男性因素不育的新型治疗).Fertil Steril 63：1231-1240。
7.Bartoov B，Berkovitz A，Eltes F.Selection of spermatozoa withnormal nuclei to improve the pregnancy rate with intracytoplasmic sperminjection(选择具有正常细胞核的精子来提高卵胞质内单精子注射的妊娠率).N Engl J Med.2001年10月4日；345(14)：1067-8。
8.Bartoov B，Berkovitz A，Eltes F，Kogosovsky A，Yagoda A，LedermanH，Artzi S，Gross M，Barak Y.Pregnancy rates are higher withintracytoplasmic morphologically selected sperm injection than withconventional intracytoplasmic injection(卵胞质内形态学选择注射的妊娠率高于常规卵胞质内单精子注射的妊娠率).Fertil Steril.2003年12月；80(6)：1413-9。
9.Berkovitz A，Eltes F，Lederman H，Peer S，Ellenbogen A，Feldberg B，Bartoov B.How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection(如何通过精子选择来改善IVF-ICSI结果).Reprod Biomed Online.2006年5月；12(5)：634-8。
10.WHO laboratory manual for the examination of human semen andsperm-cervical mucus interaction(用于测定人类精液和精子与宫颈粘液相互作用的WHO实验指南).1999第4版.World Health Organization.Cambridge university press。
11.Aitken RJ.Sperm function tests and fertility(精子功能与生育力).Int J Androl.2006年2月；29(1)：69-75；discussion 105-8。
12.Bartoov B，Berkovitz A，Eltes F，Kogosowski A，Menezo Y，Barak Y.Real-time fine morphology of motile human sperm cells is associated withIVF-ICSI outcome(人类能动精细胞的实时精细形态学与IVF-ICSI结果有关).J Androl.2002年1月～2月；23(1)：1-8。
13.Spadafora C.Sperm cells and foreign DNA：a controversial relation(精细胞与外来DNA：悖论关系).Bioessays.1998年11月；20(11)：955-64。
14.Shak S，Capon DJ，Hellmiss R，Marsters SA，Baker CL.Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum(人类重组I型DNA酶降低了囊性纤维化痰的粘性).Proc Natl Acad SciUSA 1990；87：9188-92。
今天，在西方世界大约五对夫妻中有一对具有低生育力。低生育力被定义为在1年无保护性交后受孕失败。在所有低生育力夫妻中，大约由一半观察到了男性低生育力，并且在这些夫妻中几乎有40％的低生育力完全出于男性因素。
男性生育力状况通过精液分析来评价。最普通的分析，称作“常规精液分析”，提供了所射出的精液中的精子数、活动的(和/或前向活动的)精细胞的比例和形态学正常的细胞百分比。男性低生育力通常与精子生成量低(少精子症)、精子活力弱(弱精子症)和异常精子形态(畸形精子症)中的一个或多个有关。所有这三个缺陷的组合(“精子品质不良症(oligoasthenoteratozoospermia)”，OTA)是男性低生育力的最常见因素。受孕的概率随着精子浓度、活动性和正常形态的提高而增加。世界卫生组织(WHO)已提出指定这些参数的用于将精液样本分为正常或异常的阈值的指南。
然而，常规精液分析有许多限制，从而造成很大比例的患者表现出原因不明的低生育力。为改进诊断，已开发了提供与人类精液的授精潜力有关的更多信息的额外测试。这些测试包括各种精细胞功能性测试(11)、作为“活动精子细胞器形态学测定”的功能性形态学测试(MSOME，12)和测试精细胞中DNA损伤程度的测试，例如，精子染色质结构分析(SCSA，11)。
在某些情形中，男性低生育力的成因是已知的。它们包括精索静脉曲张、激素紊乱、感染、免疫性不育、男性生殖道梗阻和隐睾症。目前的医药治疗和外科手术治疗可用于这些情况(1)。然而，在大量的男性低生育力情形中，其成因是未知的。在这些情形中，可以对低生育力的男性施加各种治疗(通常在特定基础上)。这些治疗包括抗雌激素、芳香化酶抑制剂、雄激素、FSH(促卵泡激素)、己酮可可碱(pentoxyphylline)、精氨酸、肉毒碱、谷胱甘肽、维生素(A、C和E)和寡聚矿物质(锌、硒)(1)。
当男性不育的治疗在合理的一段时间后没有导致怀孕，或如果诊断指标显示在生育力状况上没有改善可能，则可以考虑辅助生育技术(ART)。各种辅助生育方法通过避开女性生殖道下游或上游的某些或全部迁移屏障以及卵子投入来增强精子授精潜力。目前常见的ART方法包括宫腔内人工授精(IUI，2，3)、经典体外受精(IVF，4，5)和IVF-卵胞质内单精子注射(IVF-ICSI，6)。ICSI的改进是称作“卵胞质内形态学选择注射”(IMSI，7～9)的技术，在该技术中，通过高倍显微镜测定活动精子的精细形态学并选择展示出最好核形态的精子用于ICSI。
已显示来自各种物种精细胞在体外结合和吸收外源性DNA(13)。DNA结合至少部分由存在于精细胞表面上的CD4和MHCII分子介导，并且被存在于精液中的糖蛋白IF-1所拮抗。精子与细胞外的无细胞DNA(cell free DNA)的相互作用激活了切割精子基因组DNA的细胞内核酸酶(如DNA酶)，最终导致类似于细胞凋亡的细胞死亡过程。
从1965年起，牛DNA酶I(I型脱氧核糖核酸酶)已经在临床中使用。在前苏联国家中，它被用来治疗由DNA病毒(如疱疹病毒和腺病毒)造成的感染。据信DNA酶将病毒DNA降解为单个核苷酸和寡聚核苷酸。该药物通常用于治疗II型单纯疱疹病毒(生殖器疱疹)感染、由单纯疱疹病毒造成的疱疹眼部感染、带状疱疹感染、呼吸道炎症(如支气管炎症和肺炎以及肺结核)。对于这些应用，或通过肌内注射、吸入或以滴眼来施用所述药物。重组人类DNA酶I是另一种临床使用的DNA酶I。它是通过吸入施用FDA认证药物来治疗囊性纤维化(CF)患者。在这些患者中，粘脓性分泌物在气道中的滞留既造成肺功能降低又造成感染加重。粘脓性分泌物含有非常高浓度的由变性白细胞释放的细胞外DNA，该变性白细胞响应感染而积累。DNA酶I水解CF患者的痰中的DNA并降低痰的粘弹性(14)。
发明内容
本发明基于以下新的意外发现，即存在于男性血液循环中的无细胞脱氧寡核苷酸的高水平与低生育力有关，并且外源性无细胞DNA的施用降低了精子质量并导致低生育力。本发明人因此发现，对低生育力的男性提供DNA酶可以改善精液质量和生育潜力。
根据本发明的第一方面，提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物。本发明的药物组合物包含阻断无细胞脱氧核糖核酸分子对精细胞的影响的试剂、或诱导阻断无细胞脱氧核糖核酸分子对精细胞的影响的内源性物质的产生的试剂。例如，可刺激胰腺和腮腺分泌的高水平的DNA酶。使用激活1，4，5-三磷酸肌醇酯(InsP3)受体的InsP3或激活兰尼碱(ryanodine)受体的Ca2+能够对胰腺和腮腺的腺泡细胞施加刺激。这两种受体的激活导致Ca2+释放到腺泡细胞中，从而启动从这些器官中的分泌。本发明的药物组合物还包含药用载体。
根据本发明的第二方面，提供了治疗男性的方法，所述方法包括对所述男性施用阻断无细胞脱氧核糖核酸分子对精细胞的影响的试剂或诱导阻断无细胞脱氧核糖核酸分子对精细胞的影响的内源性物质的产生的试剂。
根据一个优选的实施方式，所述试剂为蛋白，优选为影响无细胞脱氧核糖核酸分子在体液中的水平的酶。根据该实施方式，所述酶优选为脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。所述DNA酶可为脱氧核糖核酸内切酶或脱氧核糖核酸外切酶(脱氧核糖核酸内切酶在分子内部切割而脱氧核糖核酸外切酶在分子的一端(即3’端或5’端中的任一端)切割)。
大量DNA酶是已知的，它们在其底物特异性、化学机理和生物功能上具有差异。可根据本发明应用的非限制性DNA酶是DNA酶I(I型脱氧核糖核酸酶)、DNA酶II(II型脱氧核糖核酸酶)、DNA酶γ、半胱天冬酶激活的DNA酶(CAD)、L-DNA酶II、DHPII。根据本发明的一个优选实施方式，所述DNA酶为DNA酶I。所述DNA酶可来源于动物、植物、细菌、病毒、酵母菌或原生动物，或者可为重组DNA酶，优选为人类重组DNA酶。
根据本发明的另一个实施方式，所述试剂可为干扰脱氧核糖核酸分子与精细胞表面上的受体结合的能力的分子。这些分子可为结合并阻断所述受体的分子或结合并阻断脱氧核糖核酸分子的分子。阻断所述受体的分子可为低分子量分子，例如脱氧核糖核苷酸二聚体、磷酸脱氧核糖基焦磷酸(phosphodbosyl pyrophosphate，PdRPP)、脱氧核糖核苷酸或金属离子，或为高分子量分子，如肽、多肽、蛋白、抗体或糖蛋白。在一个优选的实施方式中，所述分子为能阻断无细胞DNA与精细胞受体之间相互作用的糖蛋白IF-1或其类似物。结合并阻断脱氧核糖核酸分子的分子可为肽、多肽、蛋白、DNA结合蛋白、核蛋白(如组蛋白、精蛋白)或抗体。脱氧核糖核酸分子还可以通过在精细胞表面上结合不是受体的蛋白和脂质来施加对精细胞的不利影响。在此情形下，所述试剂可为干扰该结合的分子。
根据本发明的另一个实施方式，所述试剂可为阻断信号传导途径中的一个阶段的分子，所述信号传导途径由脱氧核糖核酸分子与精细胞表面上的受体的结合而产生。所述试剂可为低分子量化合物或高分子，例如半胱天冬酶抑制剂(如ZVAD和bcl-2蛋白家族或半胱天冬酶显性阴性蛋白)。
由无细胞DNA造成的精细胞损伤可能与精细胞内部的高DNA酶活性有关。因此，根据本发明的另一个实施方式，本发明的药物组合物可包含抑制精细胞内的内源性DNA酶活性的DNA酶抑制剂。所述试剂可为低分子量化合物或高分子。优选的试剂包括金精三羧酸(ATA)或柠檬酸或它们的功能性类似物。
所述组合物可包含药用载体与所述试剂的组合。术语“药用载体”是指惰性无毒的赋形剂之一，所述赋形剂基本不与干扰影响精细胞的DNA的试剂反应，且添加所述赋形剂是为了赋予所述组合物以形状或稠度，为了提供保护以防止所述试剂降解并增加其在体外和体内的存活，以及为了渗透到体内和递送到体液中并帮助所述试剂在受试对象体内分配和递送到目的部位(或者递送到无细胞DNA、目的细胞表面受体或进入精细胞中)。
根据一个实施方式，所述组合物为适于口服施用的形式。根据另一个实施方式，所述组合物为适于注射的形式，优选的是肌内(IM)、皮下或静脉内(i.v.)注射。根据本发明的又一个实施方式，所述组合物为适于吸入的形式。虽然也可应用其它施用形式，但是应注意的是，口服施用因其对所述治疗具有更好的顺应性，因而是本发明的优选途径。
由受本发明的方法治疗的男性获取的精液样品可以用在任何传统的辅助生育技术(ART)中。辅助生育技术的非限制性列表包括宫腔内人工授精(IUI)、体外受精(经典IVF)、卵胞质内单精子注射(ICSI)和卵胞质内形态学选择注射(IMSI)以及其它在生育领域内已知的技术。
根据良好的医疗实践，并考虑所述男性受试对象的临床状况、施用部位和方法、施用计划、受试对象的年龄、体重和从业医生所了解的其它因素，对本发明试剂进行施用和给药。剂量可为一日或数日/数周/数月(等)的一段时间内的单次剂量或者多次剂量。治疗时间长度通常与低生育力状况的严重性、试剂的有效性和接受治疗的男性受试对象相称。
通过对多个受测试的受试对象(表现低生育力的受试对象)施用不同量的受测试试剂然后以精液质量变化作为剂量的函数作图，可以容易地确定所述剂量。作为另一种选择，所述剂量可通过在适当的动物模型中进行的实验进行确定，然后使用多种转换方法之一外推到人类上。已知的是，被认作在受试对象中有效的量可能取决于多种因素，如施用方式(例如，口服施用比静脉内施用可能需要更高的剂量，以达到所述试剂的给定血浆水平)；所述受试对象的年龄、体重、体表面积、健康状况和遗传因素；以及对受试对象同时施用的药物。
治疗的持续时间应该根据精液数量和质量来确定。精子发生出现在睾丸内并在人类中需要大约64天。其后是8～10天的附睾转运(EPT)。在男性生殖道的不同部位(睾丸的精小管和附睾尾部)都观察到了无细胞DNA的有害影响。因此，无细胞DNA能影响精子发生的不同阶段，对精细胞造成损伤(表现出不同水平的严重性)。睾丸损伤既是定量也是定性的，而附睾损伤主要是定性的。因此治疗的持续时间可能不同且应根据精液数量和质量来确定。治疗持续时间优选选自下列方案：
短期治疗：
A.10天——该疗程的目的是降低在附睾转运期间无细胞DNA对精细胞的影响。
B.16天——该疗程的目的是降低在精子发生的成熟期和附睾转运期间无细胞DNA对精细胞的影响。
中期治疗：
C.26天——该疗程的目的是降低在一个精子发生周期中和在附睾转运期间无细胞DNA对精细胞的影响。
D.32天——该疗程的目的是降低在整个精子发生期间和在附睾转运期间无细胞DNA对精细胞的有害影响。
长期治疗：
E.74天——该疗程的目的是降低在整个精子发生期间和在附睾转运期间无细胞DNA对精细胞的有害影响。
本发明还提供了评价男性生育潜力的方法。根据本发明的这一方面，确定了在受试对象的体液中的无细胞脱氧核糖核酸分子的水平和/或抑制无细胞脱氧核糖核酸分子对精细胞的影响的试剂水平。当所述无细胞脱氧核糖核酸分子水平在统计学上显著高于预定阈值和/或所述试剂水平的所述量在统计学上显著低于预定阈值时，所述受试对象被诊断为具有低生育力。根据一个优选的实施方式，所述试剂为蛋白，优选为影响无细胞脱氧核糖核酸分子在体液中的水平的酶。根据该实施方式，所述酶优选为脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。根据该确定结果，可以选择最佳辅助生育技术ART以克服低生育力。所述体液可为例如全血、血浆、血清、精液、精浆、淋巴液、汗液、唾液或泪液。
根据另一个实施方式，确定了精细胞中指示男性生育潜力的标记的活性。当所述活性在统计学上显著高于预定阈值时，所述受试对象被诊断为低生育力。根据该确定结果，可以选择最佳ART以克服低生育力。本发明人已发现，脱氧核糖核酸分子在雄性哺乳动物中的静脉内注射诱导了在其精细胞内的细胞凋亡标记Fas受体、caspas 3和内源性脱氧核糖核酸酶(DNA酶)的激活，以及所述Fas受体在精细胞表面上的表达提高指示了低生育力。因此，所述标记可能是细胞凋亡相关蛋白，根据该实施方式，所述细胞凋亡相关蛋白优选为细胞表面Fas受体、细胞内标记caspase-3或内源性脱氧核糖核酸酶(DNA酶)。另一标记是DNA-DNA受体复合物。精细胞上的Fas受体表达可使用抗Fas受体抗体进行免疫测定。所述抗体可通过与荧光染料偶联或使用本领域内任何已知方法(免疫组织化学法、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等)来检测。
本发明还提供了选择具有增强受孕能力的精细胞亚群以用于辅助生育技术的方法，所述方法包括从精液样品中去除表达指示细胞凋亡的膜标记的精细胞，以获得所述精细胞亚群。优选的标记为Fas受体。另一个标记为DNA-DNA受体复合物。优选的是，对表达所述标记的精细胞的选择利用了抗所述标记的抗体。与所述抗体反应的精细胞被识别为无法获得持久妊娠的精细胞并将其从所述样品中去除。所述抗体可以是荧光标记抗体，在这种情况下，使用荧光激活细胞分选仪去除与所述抗体结合的精细胞。可以将所述抗体与树脂珠结合，然后使用柱子、离心作用或磁体来将未结合的精细胞与树脂结合精细胞分离。
因此，本发明在一方面提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含降解DNA的酶和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含阻断无细胞DNA与精细胞表面受体之间相互作用的物质和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含结合DNA的物质和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含抑制内源性精细胞DNA酶的物质和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含抑制由结合到精细胞表面受体上的DNA介导的信号传导途径的成员的物质和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含刺激造成无细胞DNA对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂和生理可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用降解DNA的酶。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用阻断无细胞DNA与精细胞表面受体之间相互作用的物质。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用结合DNA的物质。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用抑制内源性精细胞DNA酶的物质。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用抑制由结合到精细胞表面受体上的DNA介导的信号传导途径的成员的物质。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用刺激造成无细胞DNA对精细胞的抗生育效果降低的内源性物质的产生的试剂。
在另一方面，本发明提供了确定男性受试对象的生育力状况的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试对象获取身体组织样品或体液样品；
(b)测量所述样品中的无细胞DNA水平或造成无细胞DNA对精细胞的影响降低的试剂的水平；
(c)将所测得的水平与一个或多个预定阈值比较；和
(d)基于所述比较来确定所述生育力状况。
在另一方面，本发明提供了确定男性受试对象的生育力状况的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试对象获取含有精细胞的样品；
(b)测量所述精细胞中的指示细胞凋亡的物质水平；
(c)将所测得的水平与一个或多个预定阈值比较；和
(d)基于所述比较来确定所述生育力状况。
在另一方面，本发明提供了辅助生育的方法，所述方法包括：
(a)从受本发明方法治疗的男性获取含有精细胞的样品；
(b)将所述样品利用在辅助生育技术(ART)中。
在另一方面，本发明提供了选择辅助生育技术(ART)的方法，所述方法包括：
(a)通过本发明的方法确定男性受试对象的生育力状况；
(b)基于所述生育力状况确定ART。
在另一方面，本发明提供了在用于辅助生育技术中的精细胞群中选择精细胞的方法，所述方法包括：
(a)获取含有精细胞的精液样品；和
(b)从所述精液样品中去除表达细胞凋亡标记的精细胞，以获得精细胞亚群。
在另一方面，本发明提供了用于治疗男性低生育力的药物组合物，所述组合物包含生理可接受的载体和选自下列试剂的试剂：
(a)造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的试剂；和
(b)刺激造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的内源性物质的产生的试剂。
在另一方面，本发明提供了治疗男性低生育力的方法，所述方法包括施用选自下列试剂的试剂：
(a)造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的试剂；和
(b)刺激造成细胞外DNA对精细胞的影响降低的内源性物质的产生的试剂。
附图说明
为了理解本发明并了解如何可以在实践中实施本发明，下文仅通过非限制性实施例的方式并参考附图对优选实施方式进行说明，其中：
图1是显示具有生育力的男性和生育力低下(即具有低生育力)的男性中的DNA浓度的柱状图；
图2显示了DNA注射对雄性小鼠的生育潜力的影响的柱状图；
图3是显示对小鼠注射无细胞DNA对精细胞染色质稳定性的影响的柱状图；
图4是显示对小鼠注射无细胞DNA对表达Fas受体的精细胞的百分比的影响的柱状图；
图5是显示对小鼠注射无细胞DNA对其精细胞内的caspas 3活性的影响的柱状图；
图6是显示对小鼠注射无细胞DNA对其精细胞内的内源性DNA酶活性的影响的柱状图；
图7显示了DNA注射对睾丸组织造成的形态损伤；
图8显示了DNA注射对睾丸组织造成的凋亡损伤(TUNEL染色)；
图9显示了DNA注射对睾丸组织造成的凋亡损伤的定量；
图10显示了DNA注射对睾丸组织造成的形态损伤和凋亡损伤(TUNEL染色)；
图11是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的精子密度的影响的柱状图；
图12是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的精子活动力的影响的柱状图；
图13是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的精子前向活动力的影响的柱状图；
图14是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的正常精细胞百分比的影响的柱状图，其中根据WHO使用光学显微镜进行；
图15是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的带不同头部缺陷的精细胞百分比的影响的柱状图，其中根据WHO使用光学显微镜进行；
图16是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的带无定形头部的精细胞的百分比的影响的柱状图，其中根据WHO使用光学显微镜进行；
图17是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的带中段缺陷的精细胞的百分比的影响的柱状图，其中根据WHO使用光学显微镜进行；
图18是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中的精细胞染色质稳定性的影响的柱状图；
图19是显示DNA酶肌内注射对低生育力男性的精液中表达Fas受体的精细胞的百分比的影响的柱状图；
图20是显示DNA酶口服施用对精子密度的影响的柱状图；
图21是显示DNA酶口服施用对精液体积的影响的图；
图22是显示DNA酶口服施用对精细胞浓度的影响的柱状图；
图23是显示DNA酶口服施用对具有正常核形态的精细胞的百分比的影响的曲线图，其中通过MSOME进行；
图24是显示DNA酶口服施用对具有正常核形态(通过MSOME进行)的精细胞的数量的影响的曲线图；
图25是显示DNA酶口服施用对带狭窄头部形态(通过MSOME进行)的精细胞的百分比的影响的柱状图；
图26是显示DNA酶口服施用对精细胞染色质稳定性的影响的柱状图；
图27是显示DNA酶口服施用对表达Fas受体的精细胞的百分比的影响的曲线图；
图28是显示DNA酶吸入对带正常核形态(通过MSOME进行)的精细胞的百分比的影响的曲线图；
图29是显示DNA酶抑制剂柠檬酸盐对精细胞内部DNA酶的抑制的柱状图；
图30是显示Fas受体在能生育(即，具有生育力)的男性和低生育力的男性的精细胞表面上的表达的柱状图；
图31是显示caspas-3在低生育力男性的表达Fas受体的精细胞或不表达Fas受体的精细胞中的活性的柱状图；
图32是显示在使用表达Fas受体的精细胞或不表达Fas受体的精细胞对小鼠进行人工受精所获得的子代数的柱状图；
图33是显示在使用表达Fas受体的精细胞或不表达Fas受体的精细胞对小鼠进行人工受精所获得的2PN受精卵的数量的柱状图；
图34显示了在自然受精后或使用表达Fas受体的精细胞或不表达Fas受体的精细胞进行人工受精后的小鼠中的胚胎发育；
图35是显示IUI治疗成功或失败的低生育力男性的精液中的表达Fas受体的精细胞的百分比的柱状图；
图36是显示DNA酶施用后在小鼠血浆中的DNA酶活性的柱状图。
具体实施方式
实施例
材料
标准DNA溶液：
将100mM小牛胸腺DNA溶解于重蒸水(DDW)中。
DPA溶液：
将1.5g二苯胺溶解在100mL冰醋酸中并加入1.5mL硫酸。在使用当天，加入0.5mL乙醛。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液：
PVP培养基10890001获自Medi-Cult。
库尼兹(Kunitz)DNA酶活性反应缓冲液：
5mM MgSO4·7H2O，0.1M pH 5的醋酸钠，4mg％小牛胸腺DNA
方法
DNA和脱氧寡核苷酸水平(Burton法)：
将标准DNA溶液在166μL中稀释为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL。在每个166μL的血浆样品或DNA标准样品中，加入166μL的1N HClO4和664μL的DPA溶液。将样品在37℃温育20h(小时)，然后离心10min(分钟)(15,000g，37℃)。将300μL上清液转移到96孔板并在分光光度计中在600nm测量。
精液体积、精子密度和精子浓度：
使用移液管量取每份精液射出液(semen ejaculate)的体积。
精子浓度通过使用Helber血细胞计数器或Neubauer血细胞计数器对细胞进行计数来确定(精子浓度高时使用Helber而精子浓度低时使用Neubauer)。
通过将精液射出液体积乘以精子浓度来计算精子密度(＝整个精液射出液中的细胞数)。
精子活动力和前向活动力：
使用Helber血细胞计数器或Neubauer血细胞计数器对活动和不活动的精细胞进行计数并相应地计算活动精细胞百分比。通过测定精细胞以直线前进通过200μm的能力测定了一份样品中的20个随机活动精细胞的前向活动力，并相应地计算前向活动的精细胞百分比。
使用曙红-黑色素(eosin-nigrosin)染色技术的精细胞形态学：
使用2％曙红染色精细胞，核染色和10％黑色素染色作为背景。使用光学显微镜在浸镜油下在1000倍放大倍数对50个精细胞进行评价。根据WHO准则(10)进行所述精子形态分析。
干和湿(常规)活动的精子细胞器形态检查(MSOME)：
用于湿(常规)MSOME形态观察的精子制备：
将含数千个精子的1μL～2μL精子悬浮液的一个等分试样转移到含0％～8％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的溶液的精子培养基微滴中并置于浸镜油下的玻璃底皿中。通过形成从所述微滴边缘延伸的小湾，所述小湾捕获了活动精子的头部，从而可以对运动中的精细胞进行评价。
用于干MSOME形态观察的精子制备：
将液化后的新鲜精液射出液转移到室温(22～25℃)下的15mL圆底管中。通过在室温下在甩平式离心机(swing-out bucket)中在1500RPM离心15分钟来获得射出精细胞的软沉淀。除去精浆上清液。将所述精子沉淀悬浮在1mL Ferticult-IVF培养基中(FertiPro N.V.Beernem，比利时)，然后在室温下在1500RPM再离心5分钟。然后将所述管转移到5％CO2、37℃的培养箱中以45°倾斜进行40分钟的游上温育。然后小心除去精子沉淀的界面以上的上清液。将游上上清液在室温下在1500RPM离心5分钟然后弃去上清液。将所述沉淀涂在显微镜玻片上并进行空气干燥。
精子MSOME观察：
在21℃用安装了Nomarski光学系统(Uplan Apo X 100/1.35物镜和0.55NA聚光镜)的倒置显微镜(Olympus IX 70)检查精细胞。通过DXC-950P彩色摄像机(Sony)捕获图像，该摄像机具有用于高质量图像生成的具有约380000有效图像元素(像素)的1/2英寸3片强力HAD CCD，和彩色视频监视器(Sony PVM-14M4E，HR-Trinitron)。形态学评价在监视屏上进行，在如上配置下，该监视屏达到6300的实际放大倍数。检测了来自每个精子样品的100个活动精子的6个亚细胞器：顶体、顶体后膜(postacrosomal lamina)、颈部、线粒体、尾部和核的形态学状态。在特定畸形的存在的基础上判断这些亚细胞器的前5个是形态正常还是异常，如Bartoov等，1981和Glezerman和Bartoov，1993所公开定义的那样。对于核而言，其形态学状态通过形状和染色质含量来定义。MSOME对正常形状的核的标准是光滑、对称和椭圆形。精核的长度和宽度的正常范围分别为4.75±0.28μm和3.28±0.20μm(平均值±标准差)，而认为在该范围外的精细胞是异常的。核染色质物质为均一的、没有区域性核紊乱和不含超过一个前视边界直径为0.78±0.18μm的液泡。要被认为形态正常，精核必须具有正常的形状和正常的染色质含量。将显示出正常核以及正常顶体、顶体后膜、颈部、线粒体、尾部且在头部附近没有细胞质微滴或细胞质的精细胞划分为形态正常的精细胞。
精子染色质结构分析(SCSA)：
SCSA确定具有异常染色质结构的精子的百分比。异常染色质结构被定义为精子DNA对酸诱导的原位变性的敏感性增加。通过流式细胞仪来确定每个细胞的DNA变性量，该流式细胞仪测量在吖啶橙染色的核中绿色(天然DNA)到红色(变性的单链DNA)荧光的转变。该转变表达为DFI(DNA断裂指标)，DFI为红色荧光与总荧光(红色+绿色)之比，代表变性单链DNA占总细胞DNA的量。在SCSA中，对样品中的每个精子计算DFI，结果为5000个精细胞的平均值。将100μL精细胞悬浮液的等分样品与2mL TNE缓冲溶液(0.01M Tris，0.15M NaCl，0.001MEDTA，pH 7.4)混合并在25℃在400×gmax离心15min。将最终沉淀重新悬浮在2mL TNE缓冲溶液中。将所述悬浮液在4℃在3000×gmax离心15min。通过强行吸打到500μL固定溶液(丙酮∶70％乙醇，1∶1体积比)中来固定所得核沉淀。上述过程的所有步骤都在4℃进行。将所述样品在室温下在3000×gmax离心15min，然后将所述沉淀与100μL酸性洗涤剂溶液(0.08M HCl，0.15M NaCl，0.1％Triton X-100，pH 1.2)在4℃混合30秒。然后，通过加入5μL含6mg/mL的吖啶橙(AO)的AO染色溶液来染色所述样品。用500μL柠檬酸缓冲液(0.037M柠檬酸，0.126M Na2HPO4，0.001M EDTA，0.15M NaCl，pH 6.0)稀释所述样品。其后，在Becton-Dickenson FACSort流式细胞仪(San Francisco，CA，USA)上对所述样品进行流式细胞分析，所述流式细胞仪装有Ultrasense和15mW激发波长为488nm的氩离子激光器。用由Jan van der Aa(Becton-Dickenson，Erembodegem，比利时)编写的ratio-time1.1软件包计算DFI比。所述DNA断裂指标(DFI)是核DNA断裂的精细胞的平均荧光值。DNA断裂指标百分比(％DFI)是核DNA断裂的精细胞的百分比。该参数在所述DFI的分布的基础上计算。
细胞内和血浆DNA酶活性：
将精细胞进行三个冻融循环，然后离心10分钟(27,000g，4℃)。通过在EDTA管内离心，从血液中分离血浆。将0.3mL上清液加入0.6mL DNA酶活性缓冲液中，然后用分光光度计在260nm对比仅含缓冲液和培养基的参照液来测量所述化合物。使用可商购的牛DNA酶I制得标准曲线。精细胞内部DNA酶以库尼兹单位标度。一个库尼兹单位定义为：在含5mMMgSO4·7H2O、0.1M pH 5醋酸钠和4mg％小牛胸腺DNA的反应缓冲液中，在25℃、pH 5和1cm通路长度的条件下，每分钟在260nm增加1O.D.的DNA酶量。以Bartoov单位标度血浆DNA酶。一个Bartoov单位定义为：在含0.1M Tris、10mM CaCl2、10mM MnCl2和0.05mg/mL小牛胸腺DNA的反应缓冲液中，在25℃、pH 7.5和1cm通路长度的条件下，每分钟在260nm产生0.001ΔA260的酶量。
精细胞的Fas受体表达：
用PBS洗涤精细胞，并将其在25℃在4％多聚甲醛(PFA)中温育30min。然后将所述细胞在封闭溶液(1％BSA的PBS溶液)中温育15min，接着与山羊抗Fas受体抗体一起温育40min。将抗人类Fas受体抗体用FITC标记，并且无需二抗。当使用小鼠精细胞时，用PBS洗涤所述细胞，并将其与二抗——FITC标记的抗山羊抗体培养30min。洗涤细胞并在Becton-Dickenson FACSort流式细胞仪中测量荧光。
精细胞中的半胱天冬酶3(Caspase-3)活性：
使用获自R&D Company的比色试剂盒测量了半胱天冬酶3的活性。用PBS洗涤精细胞，将其在裂解缓冲液中在4℃温育10min，并在10000g离心1min。在每50μL上清液中加入50μL反应缓冲液和5μL半胱天冬酶3比色底物，并在37℃温育2h。用分光光度计在405nm处测量活性。
将不表达Fas受体的精细胞与表达Fas受体的精细胞分离：
用PBS洗涤精细胞，并将其与山羊抗Fas受体抗体一起温育30min。用生物素标记抗人类Fas受体抗体且无需二抗。当使用小鼠精细胞时，用PBS洗涤所述细胞并与二抗——用FITC标记的抗山羊抗体一起再培养30min。然后用PBS洗涤所述细胞，并将其与偶联了含铁离子微珠(来自Myltenyi biotech Company)的抗生物素抗体一起温育以进行半胱天冬酶(caspas)活性确定，或将其与偶联所述微珠的抗FITC抗体温育以进行小鼠授精。按如下方法分离Fas受体阳性精细胞和Fas受体阴性精细胞：用PBS洗涤细胞并将其通过来自Myltenyi biotech Company的免疫磁性MACS分离柱转移。不表达Fas受体的未标记精细胞流经该柱而不结合。表达Fas受体的精细胞与柱结合并在后期使用活塞加压进行洗脱。
检测在口服或注射施用后的小鼠中的血浆DNA酶
将C57/黑色小鼠饿上12h，然后对其口服施用PBS(安慰剂，n＝10)或口服施用200μL PBS中的9mg DNA酶I(n＝14)、或腹膜内注射200μLPBS中的3mg DNA酶I(n＝6)。对照小鼠不受任何治疗(n＝10)。在注射40min后或口服施用1h后，从所述小鼠心脏收集血液。通过在EDTA管中离心，从所述血液中分离出血浆，并将其储存在-20℃。血浆中的DNA酶活性以Bartoov单位表示。
结果
无细胞DNA的体内影响
如在图1中可观察到，在低生育力男性的血液中的内源性无细胞DNA水平比能生育的男性的高，表明高血液DNA水平与低生育力具有相关性。事实上，无细胞DNA对雄性小鼠的静脉注射损伤了所述雄性小鼠的生育潜力：两组各10只雄性小鼠在15天中接受200μg无细胞DNA或PBS的静脉注射。然后让所述小鼠与雌性小鼠交配，并对两组的子代数进行计数。图2显示了与对照小鼠交配，每只雌性小鼠产生了6.9±1.7个子代，而与DNA注射的小鼠交配，每只雌性小鼠产生了0.7±2.2个子代。此外，无细胞DNA在小鼠内的静脉注射损伤了所述小鼠精细胞核的质量，如由DFI增加所表示的精细胞染色质稳定性的降低所观察的(图3)。此外，无细胞DNA在小鼠内的静脉注射诱导了小鼠精细胞内的细胞凋亡标记Fas受体、caspas 3和DNA酶的激活(图4～6)。
无细胞DNA注射不仅影响精细胞，而且还影响睾丸组织。如图7和图10中所观察到的，无细胞DNA造成了巨型细胞的出现和睾丸成熟和未成熟生殖细胞在管腔内的脱落(sloughing)所引起的小管上皮消耗。无细胞DNA注射还造成大的细胞凋亡区域的出现(图8～10)。在人类睾丸中，精子发生需要大约64天。因此，预期由DNA造成的睾丸损伤会长时间影响精细胞的发育，并且对该损伤的修复将需要长时间的治疗。
DNA酶I的肌内施用
为了测定DNA酶I是否能改善精液质量和生育潜力，将DNA酶I施用到低生育力的男性。在一组11对夫妻中，所述夫妻中的男性被事先鉴定为低生育力且所述夫妻在一次IVF-ICSI治疗中受孕失败，所述男性在7～10天的周期中通过肌内(IM)注射接受一日四次25mg牛DNA酶I。在第一次注射后的7～11天，所述夫妻接受第二次ICSI治疗。在所述治疗开始前和在第一次注射的4～7天和8～15天后，从所述受试对象取两次精液和血液样品并分析。如图11所示，精液分析揭示精子密度在治疗8～15天后与治疗前相比增加了70％(分别为24.28±14.73×106细胞/精液射出液对14.31±10.15×106细胞/精液射出液，P＜0.08)。此外，观察到了精子活动力在治疗4～7天后与治疗前相比有60％的增加(分别为30.6±12.6％和19±11.3％，P＜0.033，图12)，并且观察到精子前向活动力在治疗8～15天后与治疗前相比有76％的增加(分别为47±33.1％和26.7±23.4％，P＜0.010，图13)。
根据WHO准则(10)分析了所述精细胞的形态。在DNA酶治疗8～15天后，所述受试对象的精液中的形态学成形的精细胞百分比与治疗前相比提高了129％(分别为19.9±12.1％和8.7±15.6％，P＜0.098，图14)。此外，还显示出所述DNA酶治疗造成头部缺陷总量(total head defect)百分比在治疗8～15天后与治疗前相比减少24％(分别为57.3±17.6％和77.3±13.4％，P＜0.015，图15)。具体而言，观察到了无定形头部的百分比在治疗8～15天后与治疗前相比减少73％(分别为9.4±7.3％和34.5±29.3％，P＜0.043，图16)。此外，观察到中段缺陷百分比在治疗8～15天后与治疗前相比减少60％(分别为5.4±5.1％和13.5±8.6％，P＜0.040，图17)。还用MSOME分析了3个受试对象的精细胞形态。在所述DNA酶治疗后在这些受试对象中观察到了各种MSOME参数的改善(表1)。具体而言，在具有正常核的精细胞百分比上有改善。
表1

*P＜0.093
精细胞中的DNA损伤与受损受孕率以及子代健康相关。评价该损伤的最常采用的方法之一是“精子染色质结构分析”(SCSA)，该方法测量了暴露于酸性培养基的细胞中的精子染色质的稳定性。图18显示，DNA酶治疗造成精细胞染色质稳定性在治疗4～7天后与治疗前相比升高(较小的％DFI值)(分别为15.1±12.4％和25±19.6％，P＜0.033)。此外，DNA酶治疗造成了在治疗4～7天后和8～15天后与治疗前相比在精细胞中细胞凋亡标记Fas受体的表达降低(分别为26.5±12.5％和29.2±17.4％和39.7±23％，对于4～7天，P＜0.009，对于8～15天P＜0.023，图19)。
11对夫妻中有4对(36％)在所述DNA酶治疗之后的第二次ICSI治疗后怀孕(妊娠)。进行本试验的IVF中心的第一次ICSI周期的平均怀孕率为25％(18％～32％范围)。由于在一次未成功的ICSI后，该IVF中心不进行第二次ICSI，而是建议ICSI的失败者使用供者人工受精，因此在该IVF中心的未治愈患者的第二次ICSI周期的怀孕率是未知的。不论如何，36％的第二次ICSI治疗的成功率在所述IVF中心的25％之上，因此DNA酶治疗明显增加了ICSI治疗的怀孕机会。
图11～19和表1中的结果显示，DNA酶I的肌内注射改善了精液的大多数精液质量参数。在实验结束时，精子密度提高了70％。精子活动力在治疗4～7天后就已提高了60％，但后来发生活动力降低，这可能是因为在第七天左右发生并表现为24小时发烧的免疫应答。精子前向活动力在实验结束时提高了76％。精子活动力和精子密度的升高改善了受试对象的生育潜力，并使第一次ICSI治疗中无法成功者在第二次ICSI治疗及可能的其它ART治疗(如经典IVF或甚至IUI治疗)中受孕。
根据WHO准则(10)分析，DNA酶的肌内注射也改善了精子形态。正常精细胞的百分比提高了129％。具有头部缺陷的精细胞百分比降低了24％且达到正常值(≤65)。具有无定形头部的精细胞百分比降低了73％，并且具有中段缺陷的精细胞百分比降低了60％。使用MSOME也观察到了精子形态的改善。考虑用于MSOME分析的精细胞数和具有正常核的精细胞数在治疗后均增多。具有核液泡的精细胞数、窄型精细胞数和具有区域性紊乱的精细胞数都下降了。
此外，DNA酶治疗减少了精细胞的损伤。精细胞染色质损伤(根据SCSA分析)在治疗4～7天后已经减少了40％，并且细胞凋亡标记Fas受体的表达在4～7天后减少了26％，而在8～15天后减少了33％。在DNA酶治疗后观察到的精液质量的改善预期可以改善生育潜力，事实上，在治疗后，观察到了ICSI质量成功率的增加。
DNA酶I的口服施用
为了测定DNA酶I的口服施用是否与肌内注射中所观察到的那样能够改善精液的质量，一组9位男性在16天的周期中接受了每日四次50mgDNA酶I的口服施用。在治疗开始之前5天、治疗的开始当天以及治疗的第5、10和17天，从所述受试对象采取精液样品并分析。从表2中可以看出，精液分析揭示，精子密度(总精子/精液射出液)在治疗后与治疗前相比显著增加(分别为103±50×106细胞/精液射出液对42±38×106个细胞/精液射出液，P＜0.05)。当结果以对照％表示时，在治疗5天后就已观察到精子密度的增加，而在治疗10天和17天后，增加更明显(分别为235±95％、160±72％和284±138％，对照为100％，P＜0.005，图20)。
表2
  常规参数  -5  0  5  10  17  体积(mL)  1.2±0.5  1.4±0.6  1.8±0.7  1.7±0.8  2.3±0.6**  浓度(×106细胞/mL)  31±13  30±12  42±15  37±12  45±16*  总精子(×106细胞/精液射出液)  37±30  42±38  75±46  63±52  103±50*  精子活动力％  85±22  52±5  61±21  72±12  86±33  精子活力％  76±13  72±11  71±12  71±12  77±10  正常形状％  15±8  11±5  17±16  18±10  15±9  头部缺陷％  67±10  70±7  70±16  72±15  67±9  中段缺陷％  6±3  8±4  6±4  7±2  6±3  尾部缺陷％  15±10  12±12  8±6  12±8  12±6
*p＜0.05，n＝9
**p＜0.001，n＝9
此外，在治疗17天后，观察到了精液体积的增加(治疗前为1.3±0.5mL，而治疗17天后为2.3±0.6mL，P＜0.001，表2和图21)。该增加表明附腺的功能增强。如表2和图22中所示，在治疗中，精子浓度也增加了。
MSOME分析显示，具有正常核的精细胞的百分比在治疗5天和10天后与治疗前的水平相比就已增加了2倍，如表3和图23中所示。具有正常核的精细胞数在治疗后10天和17天后与治疗前相比也增加了(分别为5.0±3.4×106个细胞和5.7±5.1×106个细胞对1.6±2.1×106个细胞，P＜0.05，表3和图24)。此外，还观察到了具有狭窄头部的精细胞在治疗5天、10天和17天后与对照相比减少了(分别为84±15％、85±15％和83±21％，对照为100％，P＜0.05，图25)。
表3
  MSOME参数  -5  0  5  10  17  正常核％  5.2±2.7  4.7±2.6  9.0±4.3*  10.4±6.1*  12.3±6.3**  正常核(×106细胞)  2.0±2.7  1.2±0.9  3.0±2.4  5.0±3.4*  5.7±5.1*  异常形状总量  159±31  154±30  154±30  150±28  151±30  核液泡％  80±13  79±14  79±12  73±13  77±10  小型％  0.1±0.3  0.5±0.8  0.4±1.2  0.1±0.3  0.4±0.6  大型％  3.3±2.3  4.4±2.3  3.9±2.1  2.2±1.4  2.5±2.3  窄型％  40±10  41±14  33±10  35±9  34±9  宽型％  4.2±3.0  3.2±2.4  3.5±2.0  5.2±4.0  2.9±2.0  区域性障碍％  31±7  26±11  34±8  34±9  34±8  液泡指标  1.8±0.3  1.8±0.3  1.7±0.2  1.6±0.3  1.7±0.3
*p＜0.05，n＝9
**p＜0.001，n＝9
已经观察到，在治疗5天后与对照相比，精细胞染色质稳定性(较小DFI值)增加(分别为75±35％和100％，P＜0.05，图26)。该增加在10天和17天后更加明显(分别为65±31％和62±33％和100％，P＜0.005，图26)。此外，表达凋亡标记Fas受体的精细胞的百分比在治疗10天后与治疗前相比降低了(分别为10.6±7.5％和35.4±26.4％，P＜0.05，图27)。与治疗前相比，治疗17天后观察到的表达凋亡标记Fas受体的精细胞的百分比进一步降低(分别为6.4±5.2％和35.4±26.4％，P＜0.005，图27)。
在参与所述口服DNA酶实验的受试对象中，仅有一个受试对象与其女性配偶尝试实现怀孕。这对夫妻此前已在IUI方法中失败四次。在所述DNA酶治疗后，这对夫妻实现了自然怀孕。图20～27及表2和表3中的结果显示，DNA酶I的口服施用具有下列效果：
1.增加精液体积。
2.增加精细胞浓度和密度。
3.通过增加具有正常核的精细胞的部分、增加染色质稳定性和降低表达Fas受体的细胞的比例来改善精子质量。
为了测定通过吸入施用DNA酶是否在精液质量上得到相似的效果，对一例案例进行了测定。在所述吸入方法中，受试对象每天三次吸入8mg所述酶，以4小时为间隔。所述酶的吸入导致正常核的百分比升高，该升高在吸入9天和17天后最为显著(图28)。
内源性精细胞DNA酶的抑制
为了测定所述DNA酶抑制剂柠檬酸盐是否能抑制细胞内精细胞DNA酶，将精细胞在有或没有10mM柠檬酸盐的情况下温育长达8小时。每小时测量所述细胞内DNA酶活性并计算所述DNA酶活性的总和。在柠檬酸盐处理的精细胞中，所述DNA酶活性的总和为对照精细胞的43％(图29)，表明柠檬酸盐抑制了细胞内DNA酶活性。
精细胞内的Fas受体表达和caspas 3活性与生育力的关系
已知的细胞凋亡标记之一是Fas受体的表达。如图4中所观察到的，无细胞DNA对小鼠的注射使Fas受体在其精细胞膜上的表达出现统计学意义上的显著升高。将精细胞与无细胞DNA在体外温育也使Fas受体在精细胞膜上的表达显著升高(未显示)。为了确定Fas受体表达与男性生育力之间是否具有相关性，在能生育的男性和低生育力的男性中确定了Fas受体在精细胞表面上的表达。在低生育力男性中表达Fas受体的精细胞的百分比比在能生育的男性中的百分比高出4倍(78.8±27.4对12.7±6.4，P＜0.001，图30)。接着，为了测定Fas受体在低生育力男性的精细胞中的表达与凋亡标记caspase-3的活性之间是否具有相关性，根据来自低生育力男性的精细胞的Fas受体表达将它们分离。确定每个精细胞群体中的caspase-3活性。在Fas受体阳性精细胞中的caspase-3活性百分比比在Fas受体阴性亚群中的caspase-3活性高出4倍(207.2±39.6对47.2±10.5，P＜0.001，图31)。
为了确定Fas受体表达是否与生育潜力相关，进行了如下实验：将小鼠精细胞与无细胞DNA(据发现可刺激Fas受体表达)温育，然后将表达Fas受体的精细胞与不表达Fas受体的精细胞分离。利用表达Fas受体的精细胞(Fas+)、不表达Fas受体的精细胞(Fas-)、与无细胞DNA一起温育但未根据Fas受体表达进行分选的精细胞和没有接触DNA的对照细胞对四组各10只雌性小鼠进行人工受精。所有人工受精均以相同的精细胞数进行。从图32可以看出，由用Fas(+)精细胞的人工受精没有获得胚胎，与之不同的是，用Fas(-)精细胞或对照精细胞进行的人工受精分别使得平均每只雌性小鼠得到3±1.4和2.7±1.1个胚胎。用与无细胞DNA一起温育但未分选的精细胞仅使得平均每只雌性小鼠得到0.3±0.4个胚胎。
为了确定表达Fas受体的精细胞在哪个阶段未能成功产生子代，如上所述，用精细胞对4组雌性小鼠进行人工受精。人工受精16～20小时后，杀死所述雌性小鼠，从输卵管中取出卵母细胞，并对2原核(2PN)受精卵进行计数。如图33中所示，Fas(+)和Fas(-)精细胞产生相似数量的2PN受精卵，且在对照精细胞和与无细胞DNA温育的精细胞之间没有观察到显著差异。于是，使用Fas(+)和Fas(-)精细胞进行了相似的人工受精且在怀孕的不同阶段杀死雌性小鼠。检查两种处理中的胚胎发育并与自然受精的胚胎发育比较。在用Fas(+)精细胞进行人工受精的雌性小鼠中没有观察到2PN阶段之后的胚胎发育，而用Fas(-)精细胞进行人工受精的雌性小鼠展示了如自然受精一样的正常胚胎发育(图34)。
此外，测定了在人类中Fas受体在精细胞上的表达与IUI治疗结果的相关性。通过用人类抗Fas受体进行的免疫荧光染色法和FACS分析，测定了来自进行IUI治疗的72对低生育力的夫妻的精液样品的Fas表达。18例导致怀孕，而其余的54例没有导致怀孕。如图35所示，在实现怀孕的组中的Fas(+)精细胞的频率在统计学上低于未实现怀孕的组(分别为22.4％±18.2和33.1％±16.6，P＜0.027)。
小鼠血浆中的DNA酶活性
为了测定DNA酶在口服施用后到达血流的能力，通过腹膜内注射或口服施用处理小鼠并在1小时后测定DNA酶活性。如图36中所示，在腹膜内注射和口服施用的组中与阴性对照组相比均观察到了血浆内DNA酶活性的显著增加(分别为14399±4000和10853±2150，对比1345±580，p＜0.001)。在接受安慰剂的组中也观察到了DNA酶活性小幅升高(4055±3500)。
检测DNA酶安全性和有效性的动物研究
在俄罗斯毒理学研究所(Federal Institute of Toxicology in Russia)在啮齿动物和狗中进行了检测DNA酶安全性和有效性的动物研究。该研究显示，DNA酶的短期使用和长期施用在受研究的温血实验室动物上没有毒性效应。以比用于人类的推荐剂量高100倍的剂量对所述实验动物长期(30天)每日使用DNA酶对主要身体系统(神经系统、心血管系统、造血系统、分泌系统、呼吸系统)、新陈代谢、总体健康状况、发育和器官的基本体内平衡参数没有产生可检测到的有害影响。还观察到，在施用DNA酶后，对消化系统也没有刺激效应。