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1、(10)申请公布号 CN 103424401 A (43)申请公布日 2013.12.04 CN 103424401 A *CN103424401A* (21)申请号 201310369652.8 (22)申请日 2013.08.22 G01N 21/76(2006.01) (71)申请人 四川省中医药科学院 地址 610041 四川省成都市人民南路4段51 号 申请人 雅安三九药业有限公司 (72)发明人 赵军宁 鄢良春 郑晓秋 朱雅宁 赵炳祥 (74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 张娟 (54) 发明名称 一种快速检测鱼腥草注射液。
2、综合毒性的生物 测试方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速检测鱼腥草注射液综 合毒性的生物测试方法， 包括如下步骤 ：（1） 制备 测试用菌液 ： 取发光细菌冻干粉， 用氯离子浓度 为0.1-1.0mol/L的溶液复苏， 得测试用菌液 ；（2） 检测 ： 取鱼腥草注射液待检样品， 用测试用菌液 检测， 确定发光强度抑制率为 50% 的样品稀释度 以及稀释度 - 效应动力曲线。本发明方法检测准 确度和灵敏度均较高， 操作简单。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页。
3、 附图10页 (10)申请公布号 CN 103424401 A CN 103424401 A *CN103424401A* 1/1 页 2 1. 一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法， 其特征在于 ： 包括如下步 骤 ： （1） 制备测试用菌液 ： 取发光细菌冻干粉， 用氯离子浓度为 0.1-1.0mol/L 的溶液复苏， 得测试用菌液 ； （2） 检测 ： 取待检样品， 用测试用菌液检测， 确定稀释度 - 效应动力曲线以及发光强度 抑制率为 50% 的稀释度。 2. 根据权利要求 1 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述发光细菌是费氏弧 菌、 明亮发光杆菌 T。
4、3 小种、 青海弧菌及其它非致病发光细菌。 3. 根据权利要求 1 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述制备测试用菌液的 方法是 ： 取型号为CS234的费氏弧菌冻干粉1支， 加入0.2-1.0ml的氯离子浓度为0.51mol/ L 的溶液， 即得测试用菌液。 4.根据权利要求1所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 （1） 中， 所述氯离子溶液的pH为 5 9。 5. 根据权利要求 1 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述检测的方法如下 ： a、 预测试 ： 取待检样品， 用水稀释成 5 个梯度的待检液， 体积百分比分别是 ： 100%、 25%、 6.。
5、25%、 1.5625%、 0.39%， 以氯离子浓度为 0.1-1.0mol/L 的溶液为标准液， 在所述待测液和 标准液中加入测试用菌液， 菌液加入量为待检液或标准液体积的 1/25 1/15， 放置 5 30min， 检测发光强度， 计算 5 个稀释度的发光度抑制率 ； b、 确定检测稀释度的上限及下限 ： 根据步骤 a 的结果， 以抑制率为 90 100% 的任一 稀释度为上限， 若样品原液的抑制率未达到90%， 则以样品原液为上限 ； 以抑制率为010% 的任一稀释度为下限 ； c、 测试 ： 在步骤b确定的稀释度上限和下限之间增配69个均匀稀释梯度的待检液， 以氯离子浓度为 0.1。
6、-1.0mol/L 的溶液为标准液， 在所述待测液和标准液中加入测试用菌 液， 菌液加入量为待检液或标准液体积的 1/25 1/15， 放置 5 30min， 检测发光强度， 制 作稀释度 - 效应动力曲线， 计算抑制率为 50% 的稀释度。 6. 根据权利要求 5 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 a 和步骤 c 中， 所述待检液中加 有含氯离子的溶液， 氯离子的浓度为 0.1-1.0mol/L ； 所述标准液中氯离子浓度为 0.51mol/ L。 7. 根据权利要求 5 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 a 和步骤 c 中， 所述待检液和氯 化钠溶液的 pH 为 5 9。 8.。
7、 根据权利要求 5 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 a 和步骤 c 中， 所述菌液加入量 为待检液或标准液体积的 1/20。 9. 根据权利要求 5 所述的测试方法， 其特征在于 ： 步骤 a 和步骤 c 中， 所述放置时间为 15min。 10. 根据权利要求 1 9 任意一项所述的测试方法， 其特征在于 ： 检测发光强度采用型 号为 LUMIStox300 的生物毒性测试仪或其他具有发光强度检测功能的仪器。 权 利 要 求 书 CN 103424401 A 2 1/13 页 3 一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法 技术领域 0001 本发明涉及一种快速检测鱼腥草注射液综。
8、合毒性的生物测试方法。 背景技术 0002 鱼腥草注射液具有广谱抗病毒、 抗细菌作用， 这种双重抗感染作用是一般抗菌药 所不具备的， 故为临床常用的抗感染产品， 被列为 全国中医医院急诊科 ( 室 ) 必备中成 药 ， 在临床上应用已有几十年。 但是， 其不良反应存在多发、 普遍、 临床表现的多样、 不可预 知、 不良反应种类的不确定、 批与批之间不良反应存在差异性等特点。 从国家药品不良反应 监测中心数据库收到的使用鱼腥草注射液等注射剂的不良反应病例报告来看， 过敏反应、 呼吸系统反应、 心脑血管系统反应的构成比依次排在鱼腥草注射液不良反应的前三位。其 中过敏反应报道数量最多， 约占 50%。
9、 以上。主要表现为皮肤和全身过敏反应， 一般停药或给 予抗过敏治疗即可消除。 主要的严重不良反应表现为过敏性休克， 且发生率较高为29.84%， 并有死亡病例发生。 0003 虽然目前已经采取了诸多手段对鱼腥草注射液的质量进行了控制， 如 ： 1. 药材原 料质量控制 （GAP） ； 2. 辅料和内包装材料的控制 ； 3. 生产过程质量控制关键点 (GMP) ； 4. 质 量标准的控制 （采用多成分定量测定， 指纹图谱等） ； 5. 流通过程质量控制 (GSP) ； 6. 使用环 节药品质量控制等， 但仍然无法有效的保证其药效的一致性和降低其不良反应的发生率。 因此， 有必要引入新的方法辅助其。
10、质量控制。 发明内容 0004 为了解决上述问题， 本发明提供了一种快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测 试方法。 0005 本发明快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法， 包括如下步骤 ： 0006 （1） 制备测试用菌液 ： 取发光细菌冻干粉， 用氯离子浓度为 0.1-1.0mol/L 的溶液 复苏， 得测试用菌液 ； 0007 （2） 检测 ： 取待检样品， 用测试用菌液检测， 确定稀释度 - 效应动力曲线以及发光 强度抑制率为 50% 的稀释度。 0008 稀释度 - 效应动力曲线， 是指待检溶液稀释度与发光强度抑制率的关系曲线。 0009 步骤 （1） 中， 所述发光细菌是费氏弧。
11、菌、 明亮发光杆菌 T3 小种、 青海弧菌及其它非 致病发光细菌。 0010 步骤 （1） 中， 所述制备测试用菌液的方法是 ： 取型号为 CS234 的费氏弧菌冻干粉 1 支， 加入 0.2-1.0ml 的氯离子浓度为 0.51mol/L 的溶液， 即得测试用菌液。 0011 步骤 （1） 中， 所述含氯离子的溶液的 pH 为 5 9。 0012 步骤 （2） 所述检测的方法如下 ： 0013 a、 预测试 ： 取待检样品， 用水稀释成 5 个梯度的待检液， 体积百分比分别是 ： 100%、 25%、 6.25%、 1.5625%、 0.39%， 以氯离子浓度为 0.1-1.0mol/L 的。
12、溶液为标准液， 在所述待测 说 明 书 CN 103424401 A 3 2/13 页 4 液和标准液中加入测试用菌液， 菌液加入量为待检液或标准液体积的 1/25 1/15， 放置 5 30min， 检测发光强度， 计算 5 个稀释度的发光度抑制率 ； 0014 b、 确定检测稀释度的上限及下限 ： 根据步骤a的结果， 以抑制率为90100%的任 一稀释度为上限， 若样品原液的抑制率未达到 90%， 则以样品原液为上限 ； 以抑制率为 0 10% 的任一稀释度为下限 ； 0015 c、 测试 ： 在步骤 b 确定的稀释度上限和下限之间增配 6 9 个均匀稀释梯度的待 检液， 以氯离子浓度为 。
13、0.1-1.0mol/L 的溶液为标准液， 在所述待测液和标准液中加入测试 用菌液， 菌液加入量为待检液或标准液体积的 1/25 1/15， 放置 5 30min， 检测发光强 度， 制作稀释度 - 效应动力曲线， 计算抑制率为 50% 的稀释度。 0016 本发明稀释度， 是指待检溶液被冲淡的程度。例如， 1ml 鱼腥草注射液用 3ml 水稀 释， 稀释度为 25%。 0017 如果稀释度的值小， 说明待检鱼腥草注射液的毒性大， 如果稀释度的值大， 说明待 检鱼腥草注射液的毒性小。 0018 抑制率为 50% 的稀释度， 即本发明 EC50。 0019 步骤 a 和步骤 c 中， 所述待检液。
14、中加有含氯离子的溶液， 其氯离子浓度为 0.1-1.0mol/L ； 所述标准液中氯离子浓度为 0.51mol/L。 0020 步骤 a 和步骤 c 中， 所述待检液和氯化钠溶液的 pH 为 5 9。 0021 步骤 a 和步骤 c 中， 所述菌液加入量为待检液或标准液体积的 1/20。 0022 步骤 a 和步骤 c 中， 所述放置时间为 15min。 0023 前述检测方法中， 发光强度采用型号为 LUMIStox300 的生物毒性测试仪或其他具 有发光强度检测功能的仪器。 0024 本发明方法可以有效检测鱼腥草注射液的毒性， 为其临床应用提供可靠依据， 同 时， 本发明检测方法具有如下优。
15、点 ：（1） 检测速度快 ： 在1小时内可以得出结果， 评估其综合 毒性 ；（2） 操作简单 ： 无需灌胃、 静脉注射等专业技术， 操作简单， 方便易行 ；（3） 反应灵敏 ； 利用现代灵敏的光电检测技术， 能对极微弱的光强度变化进行检测， 比一般生物细胞反应 灵敏几个数量 级 ；（4） 能对综合毒性的大小进行判断 ；（5） 细菌样本量大， 克服了动物试验 中样本数量少以及个体差异等影响。 0025 显然， 根据本发明的上述内容， 按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下， 还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。 0026 以下通过实施例形式的具体实施。
16、方式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0027 图 1 浓度 1 费氏弧菌发光强度随时间的变化图 0028 图 2 浓度 2 费氏弧菌发光强度随时间的变化图 0029 图 3 浓度 3 费氏弧菌发光强度随时间的变化图 0030 图 4 浓度 4 费氏弧菌发光强度随时间的变化图 0031 图 5 浓度 5 费氏弧菌发光强度随时间的变化图 说 明 书 CN 103424401 A 4 3/13 页 5 0032 图 6 厂家甲第一批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 -。
17、 效应动力曲线 0033 图 7 厂家甲第二批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0034 图 8 厂家甲第三批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0035 图 9 厂家甲第四批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0036 图 10 厂家甲第五批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0037 图 11 厂家甲第六批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0038 图 12 厂家甲第七批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0039 图 13 厂家甲第八批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0。
18、040 图 14 厂家甲第九批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0041 图 15 厂家甲第十批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0042 图 16 厂家乙第一批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0043 图 17 厂家乙第二批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0044 图 18 厂家乙第三批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲 线 0045 图 19 厂家乙第四批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0046 图 20 厂家乙第五批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0047 图。
19、 21 厂家乙第六批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0048 图 22 厂家乙第七批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0049 图 23 厂家乙第八批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0050 图 24 厂家乙第九批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 0051 图 25 厂家乙第十批鱼腥草注射液样品对费氏弧菌的浓度 - 效应动力曲线 具体实施方式 0052 实施例 1 本发明快速检测鱼腥草注射液综合毒性的生物测试方法 0053 1 实验材料 0054 1.1 菌种 0055 费氏弧菌冻干粉 （CS234） ， 购自北京滨松。
20、光子技术股份有限公司， -20避光保存。 0056 1.2 主要试剂 0057 复苏稀释液 ： 0.51mol/L 氯化钠溶液 ； 0058 渗透压调节液 ： 3.42mol/L 氯化钠溶液 ； 0059 鱼腥草注射剂， 市售。 0060 1.3 主要仪器及器材 0061 LUMIStox300 生物毒性测试仪及配套的 LUMIStherm 预温槽和测试管 （Dr.Bruno Lange GmbH） 、 BCD-539WF 电冰箱 （海尔） 、 PB-10 酸度计 （赛多利斯） 0062 2 实验方法 0063 2.1 测试用菌液的制备 0064 从冰箱冷冻室 （-20） 取出费氏弧菌冻干粉1。
21、支， 置于室温 （20左右） 平衡15min 后， 加入 0.2-1.0ml 复苏稀释液， 于室温下放置 10min， 即可用于测试。 0065 2.2 预试验 0066 将鱼腥草注射剂用蒸馏水按 1 ： 4 稀释成 5 个梯度 （即稀释度梯度） ： 100%、 25%、 说 明 书 CN 103424401 A 5 4/13 页 6 6.25%、 1.5625%、 0.39%， 按2.3所述制备成待测样品溶液， 按2.5所述方法粗测一遍， 确定上 限及下限的浓度 （即稀释度） 范围。上限为抑制率达到 90 100% 时样品的浓度， 若样品原 液的抑制率未达到 90%， 则以样品原液为上限 ；。
22、 下限为抑制率达到 0 10% 时样品的浓度。 0067 2.3 待测样品溶液制备 0068 在上限和下限之间根据需要再增配 6 12 个浓度。将样品用蒸馏水稀释到各浓 度， 再将各浓度样品与渗透压调节液以 17:3 的比例混合， 配制成待测样品溶液， 使待测样 品溶液氯离子浓度为 0.51mol/L。 0069 2.4 空白对照液 （标准液） 制备 0070 采用复苏稀释液作为空白对照液。 0071 2.5 发光强度测定 0072 待测样品每个浓度准备 3 支测试管， 每支测试管加入 1ml 待测样品， 设 3 个平行 样 ； 空白对照液也取 3 支测试管， 每支测试管加入 1ml 复苏稀释。
23、液， 同样设置 3 个平行样。 用移液器向各测试管中依次加入 0.05ml 测试用菌液， 轻轻振荡， 使之充分混匀， 每个测试 管加菌液的间隔时间为 15 秒， 于育温槽中放置 15min 后用生物毒性测试仪依次间隔 15 秒 测定各测试管的发光强度， 按下式计算抑制率， 以 EC50（抑制率等于 50% 时该样品的浓度值） 表示各样品的毒性大小， EC50值越小， 毒性越大。 0073 0074 2.6 方法学考察 0075 2.6.1 测定方法影响因素考察 0076 2.6.1.1 时间对发光强度的影响 0077 测试管中加入不同体积的复苏稀释液和测试用菌液， 制备成不同初始发光强度的 测。
24、试样品 （总体积为 1.05ml， 样品 1 为 1.04ml 复苏稀释液加入 0.01ml 测试用菌液 , 样品 2 为 1.02ml 复苏稀释液加入 0.03ml 测试用菌液 , 样品 3 为 1.00ml 复苏稀释液加入 0.05ml 测试用菌液 , 样品 4 为 0.95ml 复苏稀释液加入 0.1ml 测试用菌液 , 样品 5 为 0.85ml 复苏 稀释液加入 0.2ml 测试用菌液） , 轻轻振荡， 使之充分混匀， 每组样品做 3 个平行样。从混 匀开始计时， 每 1 分钟测定 1 次发光强度值， 算出 3 个平行样的平均值， 比较时间对不同初 始发光强度的影响。 0078 2.。
25、6.1.2pH 值对发光强度的影响 0079 取复苏稀释液加入NaOH或HCl， 分别配成pH为3,4,5,6,7,8,9,10,11的复苏稀释 液。分别取各 pH 值复苏稀释液 1ml 于测试管中 （每组做 3 个平行 样） ， 向各测试管中依次 加入 0.05ml 测试用菌液， 轻轻振荡， 使之充分混匀， 分别于放置 5min， 10min， 15min 后用生 物毒性测试仪测定发光强度值， 比较 pH 值对发光强度的影响。 0080 2.6.2 精密度考察 0081 2.6.2.1 重复性考察 0082 按上述确定的方法对 3 批鱼腥草注射剂样品 （KZ-110501、 KZ-11050。
26、2、 KZ-110503） 进行测试、 每批样品重复 3 次试验， 对结果进行评价。 说 明 书 CN 103424401 A 6 5/13 页 7 0083 2.6.2.2 中间精密度考察 0084 （1） 不同人员试验 0085 按上述确定的方法， 由两个工作人员在同一工作日对同一批鱼腥草注射剂样品 （KZ-110503） 进行测试， 对结果进行评价。 0086 （2） 不同工作日试验 0087 按上述确定的方法， 由同一工作人员在不同工作日对同一批鱼腥草注射剂样品 （KZ-110503） 进行测试， 对结果进行评价。 0088 3 结果 0089 3.1 测定方法影响因素考察 0090 。
27、3.1.1 时间对发光强度的影响 0091 实验结果如表 1 和图 1 所示 ： 0092 表 1 时间对不同初始发光强度的影响 0093 0094 说 明 书 CN 103424401 A 7 6/13 页 8 0095 由表 1 和图 1 5 可见， 5 个样品的发光强度值随时间的延长呈降低趋势， 在 5 30min内维持于一个相对稳定的水平， 初始发光强度值越高， 发光强度降低率越低。 同时， 实 验发现， 15min发光强度为500-1000时 （样品3） ， 检 测结果较准确， 成本也交低， 因此， 测试 用菌液的加入量优选为菌液体积的 1/20。 说 明 书 CN 10342440。
28、1 A 8 7/13 页 9 0096 3.1.2pH 值对发光强度的影响 0097 实验结果如表 2 所示 ： 0098 表 2pH 值对发光强度的影响 0099 0100 由表 2 可见， 检测时， 溶液 pH 值在 5.0-9.0 之间对发光强度的影响较小， 抑制率在 10% 之内， 因此使用本发明检测方法检测时， 溶液 pH 优选为 5.0 9.0。 0101 3.2 精密度考察 0102 3.2.1 重复性试验 0103 实验结果如表 3 和表 4 所示 ： 0104 表 3 重复性试验结果 0105 说 明 书 CN 103424401 A 9 8/13 页 10 0107 表 4。
29、 3 批鱼腥草注射剂样品 EC50值 （%） 0108 0109 由表3和表4可见， 本发明方法的重复性试验的相对偏差K-101103=K-100903K-100902K-100901KZ-110503KZ-1105 02091001KZ-110501。 其中， KZ-110501批次鱼腥草注射液EC50是K-101101批次鱼腥草 说 明 书 CN 103424401 A 13 12/13 页 14 注射液 EC50的 2.5 倍， 说明前者的毒性显著低于后者的毒性。 0145 3.2 厂家乙 10 批鱼腥草注射液综合毒性测试 0146 表 9 厂家乙 10 批鱼腥草注射液成品样品抑制率 （。
30、%） 0147 0148 0149 表 10 厂家乙 10 批鱼腥草注射液成品样品 EC50值 （%） 0150 说 明 书 CN 103424401 A 14 13/13 页 15 0151 根据表 9、 表 10 中厂家乙 10 批次鱼腥草注射液成品的 EC50（发光强度抑制率为 50% 时的稀释度） ， 可以看出， 厂家乙 10 批次鱼腥草注射液成品的综合毒性大小为 ： 100501 090924201008403201008405201008402090920201008404201008406100502=201008 401。其中， 201008401 批次鱼腥草注射液 EC50是。
31、 100501 批次鱼腥草注射液 EC50的 5.6 倍， 说明前者的毒性非常显著地低于后者的毒性。 0152 实验说明， 对于用传统方法检测质量均合格的鱼腥草注射液， 本发明方可以测出 其毒性有大有小， 并且， 毒性差别大， 能够较好地解释现有鱼腥草注射液不良反应不一致的 现象。 0153 综上， 本发明毒性检测方法的检测速度快， 操作简单， 反应灵敏， 准确度高， 可以检 测鱼腥草注射液的毒性， 为鱼腥草注射液的质量控制提供依据， 应用前景良好。 说 明 书 CN 103424401 A 15 1/10 页 16 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 16 2/。
32、10 页 17 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 17 3/10 页 18 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 18 4/10 页 19 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 19 5/10 页 20 图 11 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 20 6/10 页 21 图 14 图 15 图 16 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 21 7/10 页 22 图 17 图 18 图 19 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 22 8/10 页 23 图 20 图 21 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 23 9/10 页 24 图 22 图 23 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 24 10/10 页 25 图 24 图 25 说 明 书 附 图 CN 103424401 A 25 。